纖維素膜固定化麥麩酯酶的工藝研究

葉 麟 姜 露 申光輝 黎杉珊 吳賀君 張志清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

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纖維素膜固定化麥麩酯酶的工藝研究

葉 麟 姜 露 申光輝 黎杉珊 吳賀君 張志清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

以麥麩中的植物酯酶為酶源，通過(guò)交聯(lián)、吸附方法比較，選擇物理吸附法將其固定于玻璃纖維素膜上，以酶活回收率為指標(biāo)，探索其固定化的最佳條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗(yàn)，進(jìn)一步研究了緩沖液pH值、固定化時(shí)間、固定化溫度3個(gè)因素及交互作用對(duì)麥麩酯酶固定化效果的影響，確定最佳固定化條件為：磷酸鹽緩沖液pH值7.0，固定化時(shí)間4 h，固定化溫度29 ℃，該條件下酶活回收率的預(yù)測(cè)值為28.21%，驗(yàn)證值為27.51%。該研究為利用固定化麥麩酯酶快速檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留提供了技術(shù)參考。

吸附法；麥麩酯酶；固定化；纖維素膜

從麥麩中提取的植物酯酶(plant esterase，PE)，屬于羧酸酯水解酶類，由于其活性可被有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥所抑制，可用于快速測(cè)定果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯農(nóng)藥的殘留，且具有與動(dòng)物酯酶相似的檢測(cè)限而被越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注[1-3]。研究結(jié)果[4]9-11[5]表明，將植物酯酶固定化以后，對(duì)于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測(cè)的靈敏度較游離態(tài)酶都有不同程度的提高，且可以重復(fù)使用多次，儲(chǔ)存條件也較游離態(tài)酶隨和。

目前，對(duì)于植物酯酶的固定化方法研究主要集中于交聯(lián)法和吸附法[6-8]。范欽華等[9]以麥草秸稈為原料，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷和乙二胺改性，戊二醛交聯(lián)，制備了固定化小麥酯酶，其對(duì)敵敵畏的檢測(cè)下限為0.06 μg/L。徐艷陽(yáng)等[10]研究表明，當(dāng)采用717強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂作為吸附載體，并對(duì)其進(jìn)行酸堿處理后，利用得到的Cl-型交換樹(shù)脂來(lái)吸附固定黑豆酯酶，此固定化黑豆酯酶對(duì)氧樂(lè)果的抑制程度與氧樂(lè)果的濃度變化呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。研究[11-13]表明，植物酯酶不是單一的酶系，而是有兩種及以上同工酶共同組成，單一的同工酶還可能由不同的酶蛋白亞基構(gòu)成，當(dāng)這些同工酶共同存在的情況下往往要比單一的同工酶活性要好，所以對(duì)于植物酯酶的固定化往往選用植物酯酶的粗提液[6]。目前，關(guān)于植物酯酶的固定化研究主要集中于豆類中的酯酶[4]8-10以及小麥粉中的酯酶[7]，而關(guān)于麥麩酯酶的固定化研究，還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬選用麥麩酯酶的粗提液為酶源，將其固定于膜載體上，并優(yōu)化其固定化條件，以期將麥麩酯酶固定化后用于果蔬中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

麥麩：雅安市售；

定性濾紙：杭州特種紙業(yè)有限公司；

硝酸纖維素膜(厚度140 μm)、醋酸纖維素膜：成都康迪生物技術(shù)有限公司；

玻璃纖維素膜：Ahlstrom8964(厚度0.41 mm，克重77.8 g/m2)、GL-b01(厚度0.56 mm，克重60 g/m2)、GL-b02(厚度0.75 mm，克重89 g/m2)、GL-b04(厚度0.78 mm，克重92 g/m2)，上海杰一生物技術(shù)有限公司；

聚酯纖維素膜：MA0280(厚度0.40 mm，克重68 g/m2)、fusion 3(厚度0.39 mm，克重95 g/m2)、Ahlstrom6613(厚度0.42 mm，克重100 g/m2)，上海杰一生物技術(shù)有限公司；

尼龍膜(Hybond N+)：美國(guó)Sigma公司；

α-乙酸萘酯：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

固蘭B鹽：分析純，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；

鹽酸：分析純，四川西隴化工有限公司；

牛血清白蛋白：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

α-萘酚、25%戊二醛(GA)、醋酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水乙醇等：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：CPA225D型，德國(guó)賽多利斯股份公司；

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW- 400A型傾斜式，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-2型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

紫外分光光度儀計(jì)：UV- 3100PC型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

冷凍離心機(jī)：ST16R型，美國(guó)賽默飛世爾科技；

超純水純化系統(tǒng)：Milli-Q型，美國(guó)密理博公司；

真空冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-12N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

真空干燥箱：DZF-6020型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

潔凈工作臺(tái)：SW-CJ型，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

醫(yī)用冷藏箱：YC-280型，澳柯瑪股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酯酶的提取 參考文獻(xiàn)[14]的方法，并做適當(dāng)修改。稱取5.0 g粉碎后的小麥麩皮，加入25 mL磷酸氫鈉緩沖液(pH 6.5)配制的0.15 mol/L NaNO3提取液，攪拌均勻后置于35 ℃的水浴鍋內(nèi)水浴靜置提取60 min，紗布粗過(guò)濾后8 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液過(guò)濾即得粗酶液。

1.2.2 固定化酶的制備 分別將各載體膜裁剪成1 cm×1 cm的正方形，用超純水洗去表面殘?jiān)覝亓栏蓚溆?。? mL粗酶液于25 mL燒杯中，加入3 mL磷酸氫鈉鹽緩沖溶液搖勻，將膜片浸入固定化酶液中靜置吸附4 h后取出置于玻璃板上，放進(jìn)潔凈工作臺(tái)中打開(kāi)排風(fēng)扇，調(diào)至檔位2，通風(fēng)1 h將膜片風(fēng)干，以此制得固定化麥麩酯酶膜片。

1.2.3 酶活的測(cè)定 固定化前酶液酶活測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)[14]修改如下：將吸收波長(zhǎng)由599 nm換成535 nm測(cè)定吸光度，測(cè)定固定化酶的酶活時(shí)將固定化前酶液換為固定化酶膜片測(cè)定，將每分鐘催化分解1 μmo1α-乙酸萘酯所需的酶量定義為1 U。固定化前酶液酶活計(jì)算公式：

(1)

式中：

E——每毫升固定化前酶液酶活力，U/mL；

N——酶液的稀釋倍數(shù)；

k——某一pH下α-萘酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；

OD535 nm——反應(yīng)后在波長(zhǎng)535 nm處測(cè)得的吸光度；

V——反應(yīng)體系總體積，mL；

V0——測(cè)定酶活所用酶液體積，mL。

按式(2)計(jì)算固定化酶活：

(2)

式中：

E0——每毫升固定化酯酶活力，U/mL；

N0——酶液的稀釋倍數(shù)；

k——某一pH下α-萘酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；

OD535 nm——反應(yīng)后在波長(zhǎng)535 nm處測(cè)得的吸光度；

V1——反應(yīng)體系總體積，mL；

V2——固定化所用酶液體積，mL。

1.2.4 酶活回收率的計(jì)算 按式(3)計(jì)算酶活回收率：

(3)

式中：

R——酶活回收率，%；

E0——每毫升固定化酯酶活力，U/mL；

E——每毫升固定化前酶液酶活力，U/mL；

1.2.5 影響麥麩酯酶固定化效率的各項(xiàng)因素優(yōu)化

(1) 固定化方法：控制酶用量為1 mL且酶液稀釋倍數(shù)為4倍，載體膜為玻璃纖維素膜GL-b04，將膜片浸入燒杯中的酶液后放進(jìn)4 ℃冰箱中靜置吸附4 h，取出膜片置于玻璃板上放進(jìn)潔凈工作臺(tái)中風(fēng)干，考察固定化方式分別為：1 mL E+1 mL GA+2 mL 1% BSA、1 mL E+1 mL GA+2 mL PBS、1 mL E+3 mL GA、1 mL E+3 mL PBS(pH 7.0)/1% BSA/超純水時(shí)的酶活回收率。

(2) 膜種類：控制酶用量為1 mL且酶液稀釋倍數(shù)為4倍，固定化方式為E+PBS(pH 7.0)，將不同膜片浸入燒杯中的酶液后放進(jìn)4 ℃冰箱中靜置吸附4 h，取出膜片置于玻璃板上放進(jìn)潔凈工作臺(tái)中風(fēng)干，考察載體膜為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、聚酯纖維素膜、尼龍膜(Hybond N+)、定性濾紙時(shí)的酶活回收率。

(3) 稀釋倍數(shù)：控制酶用量為1 mL，固定化方式為E+PBS(pH 7.0)，載體膜為玻璃纖維素膜GL-b04，將膜片浸入燒杯中的酶液后放進(jìn)4 ℃冰箱中靜置吸附4 h，取出膜片置于玻璃板上放進(jìn)潔凈工作臺(tái)中風(fēng)干，考察酶液稀釋倍數(shù)為2，3，4，5，6倍時(shí)的酶活回收率。

(4) 緩沖液pH值：控制酶用量為1 mL且酶液稀釋倍數(shù)為4倍，固定化方式為E+PBS，載體膜為玻璃纖維素膜GL-b04，將膜片浸入燒杯中的酶液后放進(jìn)4 ℃冰箱中靜置吸附4 h，取出膜片置于玻璃板上放進(jìn)潔凈工作臺(tái)中風(fēng)干，考察PBS緩沖液pH值為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0時(shí)的酶活回收率。

(5) 固定化溫度：控制酶用量為1 mL且酶液稀釋倍數(shù)為4倍，固定化方式為E+PBS(pH 7.0)，載體膜為玻璃纖維素膜GL-b04，將膜片浸入燒杯中的酶液后放進(jìn)4 ℃冰箱以及不同溫度水浴鍋中靜置吸附4 h，取出膜片置于玻璃板上放進(jìn)潔凈工作臺(tái)中風(fēng)干，考察固定化溫度為4，10，20，30，40，50 ℃時(shí)的酶活回收率。

(6) 固定化時(shí)間：控制酶用量為1 mL且酶液稀釋倍數(shù)為4倍，固定化方式為E+PBS(pH 7.0)，載體膜為玻璃纖維素膜GL-b04，將膜片浸入燒杯中的酶液后放進(jìn)30 ℃水浴鍋中靜置吸附不同的時(shí)間，取出膜片置于玻璃板上放進(jìn)潔凈工作臺(tái)中風(fēng)干，考察固定化時(shí)間為0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 h時(shí)的酶活回收率。

(7) 膜片干燥方式：控制酶用量為1 mL且酶液稀釋倍數(shù)為4倍，固定化方式為E+PBS(pH 7.0)，載體膜為玻璃纖維素膜GL-b04，將膜片浸入燒杯中的酶液后放進(jìn)30 ℃水浴鍋中靜置吸附4 h，取出膜片置于玻璃板上，考察干燥方式為室溫風(fēng)干(約25 ℃，1 h)、真空干燥(0.09 MPa，25 ℃，30 min)、真空冷凍干燥(<20 Pa，-50 ℃，30 min)時(shí)的酶活回收率。

(8) 響應(yīng)面法優(yōu)化麥麩酯酶固定化試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，分別以X1、X2、X3表示關(guān)鍵因子，-1、0、+1代表高、中、低水平。利用Design Expert 10軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，得出各因素之間的最佳結(jié)合。以優(yōu)化麥麩酯酶固定化的條件參數(shù)，選擇最優(yōu)的固定化條件。每個(gè)試驗(yàn)做3組平行，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究均采用3次平行重復(fù)試驗(yàn)，采用Microsoft Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與作圖，采用Design Expert 10設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)及其數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 22對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析與多重比較。0.010.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 各因素對(duì)麥麩酯酶固定化效率的影響

2.1.1 固定化方式對(duì)酶活回收率的影響 由圖1(a)可知，采用交聯(lián)法將麥麩酯酶固定化，不管是否添加保護(hù)劑，隨著戊二醛(GA)濃度的增加，酶活回收率不斷減小。其中方式1當(dāng)中0.01% GA的酶活回收率沒(méi)有0.05% GA交聯(lián)的方式高，但檢測(cè)體系透過(guò)率要略高于0.05% GA交聯(lián)，可能是0.05% GA交聯(lián)了更多的牛血清白蛋白，造成反應(yīng)液透過(guò)率下降，吸光度增加，從而導(dǎo)致酶活回收率增加。當(dāng)戊二醛濃度增加到0.5%時(shí)，各交聯(lián)方式所測(cè)得的酶活回收率都較低，而此時(shí)固定化酶液已經(jīng)被氧化為了淡黃色，原因可能是戊二醛的化學(xué)性質(zhì)非常活撥，不僅能與酶蛋白分子中的氨基進(jìn)行交聯(lián)，還會(huì)氧化氮原子形成淡黃色的聚合物，導(dǎo)致酶活性構(gòu)象發(fā)生變化，從而使酶失去活性[15-16]。這與前人[17-18]的研究結(jié)果相似。圖1(b)是針對(duì)方式1和方式4中酶活回收率異常較大且測(cè)定酶活時(shí)，反應(yīng)液肉眼可看見(jiàn)渾濁的幾組數(shù)據(jù)測(cè)定其反應(yīng)液的透過(guò)率。采用方式4即吸附法將酶固定化時(shí)，E+BSA雖然酶活回收率最高，達(dá)到了(47.638 4±0.356 5)%，但此時(shí)反應(yīng)體系肉眼可見(jiàn)大量的渾濁，透過(guò)率也僅為(13.433 3±3.066 5)%。原因可能是膜片不僅吸附了酶，同時(shí)還吸附了作為保護(hù)劑的BSA，當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后加入了鹽酸，使得BSA變性絮凝，從而導(dǎo)致檢測(cè)體系渾濁，進(jìn)而吸光度增加，酶活回收率增大。雖然采用方式1交聯(lián)后的酶活要高于吸附法，但其檢測(cè)體系的透過(guò)率遠(yuǎn)不如E+PBS高。因此，綜合考慮酶活回收率和檢測(cè)體系透過(guò)率，選擇E+PBS的方式將麥麩酯酶吸附固定。

圖1 固定化方法對(duì)酶活回收率的影響

2.1.2 膜種類對(duì)酶活回收率的影響 由圖2可知，采用毛細(xì)纖維結(jié)構(gòu)明顯的聚酯纖維素膜和玻璃纖維素膜載體固定化效果要顯著高于普通的膜(P<0.05)，其中玻璃纖維素膜為載體的酶活回收率顯著高于其他種類的膜(P<0.05)。原因可能是玻璃纖維素膜呈化學(xué)惰性，具有較多的毛細(xì)纖維結(jié)構(gòu)，能吸附比同等纖維素膜更多的水分，流速快，耐高溫，可用于細(xì)微顆粒的采集，且不含有粘合劑，可單獨(dú)作為固定化載體將酶較好地吸附固定[19]。而同類型玻璃纖維膜之間有一定差異，可能是膜的厚度、克重不同引起，其中GL-b04型號(hào)的玻璃纖維素效果最好，酶活回收率達(dá)到(22.855 7±0.027 0)%。因此，最終選擇玻璃纖維素膜GL-b04作為麥麩酯酶固定載體。

不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

2.1.3 稀釋倍數(shù)對(duì)酶活回收率的影響 由圖3可知，隨著稀釋倍數(shù)的增加，酶活回收率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酶濃度較低時(shí)，剩余的載體結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)較多，固定化的酶量較少，總活力較低；當(dāng)酶濃度較大時(shí)，載體上的結(jié)合位點(diǎn)趨向飽和，使大量的酶蛋白沒(méi)有與載體結(jié)合，造成酶分子相互聚集成團(tuán)，酶分子的活性中心有可能被遮蓋[20-21]，盡管吸附的酶量較多，但酶的催化活性表現(xiàn)較低，同時(shí)一些酶分子進(jìn)入載體的孔深處，使催化反應(yīng)時(shí)底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散相對(duì)困難[22]，影響酶與底物的充分結(jié)合，固定化酶的催化效率降低，表觀活力下降，這與孟玲等[7]采用離子吸附樹(shù)脂吸附固定小麥酯酶的研究結(jié)果相一致。在本研究中當(dāng)酶液稀釋倍數(shù)為4倍時(shí)，酶活回收率達(dá)到最高，為(23.987 8±0.365 7)%，因此選擇將酶液用磷酸氫鈉鹽緩沖溶液稀釋4倍后再固定。

不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

2.1.5 吸附溫度對(duì)酶活回收率的影響 由圖5可知，隨著固定化溫度的升高，酶活回收率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，以4 ℃作為對(duì)照(即把酶液放入4 ℃冰箱中將其固定化)，當(dāng)固定化溫度為30 ℃時(shí)酶活回收率達(dá)到最大，為(26.045 5±1.141 9)%。原因可能是在低溫和高溫時(shí)酶均遭到不同程度的破壞，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，酶的空間構(gòu)象沒(méi)有遭到破壞或破壞很少，從而減少固定過(guò)程中的酶活損失。由于物理吸附是一個(gè)放熱過(guò)程，隨著溫度增高，載體吸附的酶量降低；同時(shí)溫度也影響著酶分子的運(yùn)動(dòng)、活力和穩(wěn)定性[26]，一方面：升高溫度，酶分子的布朗運(yùn)動(dòng)加快，酶易從載體表面脫出，使得反應(yīng)加快，另一方面：溫度升高，酶蛋白逐漸變性，超過(guò)一定范圍則酶活下降。這與邵佳甲[27]關(guān)于大豆酯酶的固定化研究結(jié)果相一致。因此，在本研究中選擇固定化溫度為30 ℃。

2.1.6 吸附時(shí)間對(duì)酶活回收率的影響 由圖6可知，隨著固定化時(shí)間的升高，酶活回收率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。原因可能是隨著吸附時(shí)間增加，一方面玻璃纖維素膜載體的吸附空間接近飽和，無(wú)法再大量吸附酶液；另一方面游離酶在緩沖溶液中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致一些酶的活力降低甚至喪失，同時(shí)隨著蛋白載量的增加，會(huì)造成一定的空間位阻[28]，底物和產(chǎn)物擴(kuò)散阻力變大，影響了酶的活力，使酶活回收率下降，這與前人[19][25]68-69的研究結(jié)果相似。由圖6可知，當(dāng)固定化時(shí)間為4 h時(shí)，酶活回收率達(dá)到最高，為(26.421 0±0.708 9)%。因此，選擇4 h作為固定化時(shí)間。

不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

Figure 5 Effect of different immobilization temperature on the enzyme recovery of immobilized enzyme

不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

2.1.7 干燥方式對(duì)酶活回收率的影響 由圖7可知，固定化酶的干燥方式為室溫風(fēng)干時(shí)酶活回收率最高，可能是因?yàn)檎婵崭稍锛罢婵绽鋬龈稍镞^(guò)程中，水分在低溫及真空中迅速凝結(jié)成冰，導(dǎo)致一些結(jié)合不牢固的酶分子脫落而暴露在空氣中被氧化導(dǎo)致酶活回收率降低[29]。因此，選擇室溫風(fēng)干的方式將膜片干燥，即將膜片取出后置于玻璃板上，放入潔凈工作臺(tái)，打開(kāi)排風(fēng)扇1 h將膜片風(fēng)干。

不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化麥麩酯酶固定化條件

2.2.1 響應(yīng)面法因素與水平的選擇 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇連續(xù)變量中對(duì)酶活回收率影響顯著的pH、固定化時(shí)間、固定化溫度作為影響因子，以酶活回收率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面法，因素編碼及水平見(jiàn)表1。

2.2.2 回歸模型的建立與檢驗(yàn) 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，中心點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)試驗(yàn)做3組平行，取其平均值。采用Design Expert 10軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到固定化麥麩酯酶酶活回收率對(duì)pH、固定化時(shí)間、固定化溫度的二元多項(xiàng)式回歸模型為：

(4)

表1 響應(yīng)面分析因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.3 麥麩酯酶固定化條件的確定及驗(yàn)證 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design-Eepert 10軟件獲得了麥麩酯酶固定化的最佳條件為：磷酸鹽緩沖液pH值7.03、固定化時(shí)間3.85 h、固定化溫度29.22 ℃，此條件下酶活回收率的預(yù)測(cè)值為28.21%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，考慮到實(shí)際操作的可行性，實(shí)際固定化工藝條件修訂為：緩沖液pH值7.0、固定化時(shí)間4 h、固定化溫度29 ℃。在該優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得酶活回收率平均值為27.51%，與預(yù)測(cè)值較為接近(相對(duì)誤差為2.48%)，證明該模型能較好地預(yù)測(cè)固定化麥麩酯酶的實(shí)際酶活回收率。

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化麥麩酯酶固定化工藝之后，固定化酶活的回收率只有不到30%，而通過(guò)測(cè)定固定化后酶液的酶活，還保留有(62.746 5±2.660 8)%的酶活，空白對(duì)照組(即取1 mL粗酶液于25 mL燒杯中用pH 7.0的PBS稀釋4倍，置于29 ℃水浴鍋中靜置4 h后)的酶活保留率還有(64.253 6±2.985 6)%。因此，可以看出，酶液量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)載體膜片的吸附上限，使膜片吸附酶蛋白達(dá)到飽和而無(wú)法再吸附酶，造成酶液過(guò)量，此時(shí)可以考慮固定化酶液的再次利用，避免造成酶液浪費(fèi)。當(dāng)酶液在29 ℃條件下存放4 h后酶活損失率約為40%，在不對(duì)酶液進(jìn)行固定化時(shí)，也就意味著有40%左右的酶活被浪費(fèi)，而對(duì)酶液進(jìn)行固定化后，在損失的40%里面有將近30%的酶活被保留，能夠進(jìn)行再次利用。

表3 回歸方程方差分析及回歸系數(shù)顯著性分析

? **表示差異極顯著，P<0.01；*表示差異顯著，0.01

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化得到吸附法固定麥麩酯酶的最佳條件為：磷酸鹽緩沖液pH值7.0、固定化時(shí)間4 h、固定化溫度29 ℃，此模型下酶活回收率的預(yù)測(cè)值為28.21%，驗(yàn)證值為27.51%，是預(yù)測(cè)值的97.52%。試驗(yàn)證明響應(yīng)面分析法可以有效優(yōu)化吸附法固定麥麩酯酶的固定化條件，這為進(jìn)一步研究固定化麥麩酯酶的應(yīng)用提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

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Study on immobilization of wheat bran esterase with fibre membrance

YELinJIANGLuSHENGuang-huiLIShan-shanWUHe-junZHANGZhi-qing

(CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China)

Taking the plant-esterase from wheat bran as the enzyme source, comparing the physical adsorption method and the cross-linking with adsorption methods, and the glass fiber film as adsorption carrier, and then exploreed the optimum conditions for immobilization use enzyme activity recovery as the evaluation index. On the basis of single-factors experiments, the Box-behnken center-united experimental design principles were used to design the experiment and the response surface analysis of 3 factors (the buffer’s pH, immobilized time and immobilized temperature) and the interactive effect on immobilization. The optimum immobilized conditions were confirmed as followed: phosphate buffer’s pH 7.0, immobilized time 4 h, and immobilized temperature 29 ℃. Based on these conditions, the detection value of the enzyme recovery rate was 28.21%, and its verified value was 27.51%. The study provides a technical reference for rapid determination of organophosphorus and carbamate pesticide residues use immobilized wheat bran esterase.

adsorption method; wheat bran esterase; immobilization; fibre membrance

葉麟，男，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

張志清(1976—)，男，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士，博士生導(dǎo)師。E-mail: zqzhang721@163.com

2016—07—18

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.014