基于多肽識別基團(tuán)的熒光探針及其對食品中氰化物的檢測

周彬彬 汪霞麗 王芳斌 張繼紅 楊 滔 程云輝 郝遠(yuǎn)強

(1. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410117；2. 長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；3. 商丘師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南 商丘 476000)

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基于多肽識別基團(tuán)的熒光探針及其對食品中氰化物的檢測

周彬彬1汪霞麗1王芳斌1張繼紅1楊 滔1程云輝2郝遠(yuǎn)強3

(1. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410117；2. 長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；3. 商丘師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南 商丘 476000)

食品；氰化物；多肽；熒光探針；檢測

氰化物是嚴(yán)重危害食品安全的劇毒化合物，能與細(xì)胞線粒體內(nèi)高鐵細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合，生成氰化高鐵細(xì)胞色素氧化酶，從而失去傳遞氧的作用，造成人體組織缺氧窒息，引起組織衰竭以至機(jī)體死亡[1]。研究[2]表明：口服氰化鈉、氰化鉀的致死量為1～2 mg/kg，口服氫氰酸致死量為0.7～3.5 mg/kg。氰酸鹽是氰化物的主要存在形式，被大量應(yīng)用于電鍍、冶煉等行業(yè)，造成環(huán)境的污染，從而產(chǎn)生食品安全隱患。另外，含菜豆亭堿的四季豆、五色豆等豆類，以及含氰甙的竹筍、苦杏仁、木薯及其相關(guān)制品等食品中也含有氰化物，能引起急性中毒[3]。因此，食品中氰化物的檢測是一項重要的安全檢測指標(biāo)，也是一項常規(guī)檢測指標(biāo)。

在現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中，氰化物的檢測通常采用分光光度法，以吡啶—巴比妥酸、異煙酸—吡唑酮、異煙酸—巴比妥酸等作為顯色體系。但該法針對不同的樣品需采取不同的處理方法，實際工作中若采用相同的試劑處理樣品對檢測結(jié)果影響很大，且該法前處理操作較復(fù)雜，部分樣品毒性較大[4-7]。近年來，學(xué)者們研究了色譜法、光譜法、離子色譜—脈沖安培檢測法、銀明膠絡(luò)合法、電化學(xué)法、硝酸銀滴定法、及快速檢測試紙條法等在氰化物檢測方面的應(yīng)用，這些技術(shù)與傳統(tǒng)的分光光度法相比，都具備各自特有的優(yōu)勢。如色譜法和光譜法靈敏度更高，試劑用量少[1]；離子色譜—脈沖安培檢測法線性范圍寬、檢出限低[8]；銀明膠絡(luò)合法選擇性好[9]；電化學(xué)法操作簡便[10]；硝酸銀滴定法重現(xiàn)性好。然而，這些方法都存在耗時較長，影響因素較多、對檢測人員素質(zhì)要求高等問題。且色譜法、離子色譜—脈沖安培法儀器較貴，電化學(xué)法、硝酸銀滴定法易受食品中復(fù)雜成分的干擾。因而這些方法都沒能在食品中氰化物檢測方面受到廣泛推廣應(yīng)用。另外，現(xiàn)有的氰化物試紙條檢測方法雖然具備現(xiàn)場快速定性的優(yōu)點[11]，但是，其目前的靈敏度不足以達(dá)到世界衛(wèi)生組織對飲用水中氰化物含量檢測濃度的規(guī)定[12]，且當(dāng)其針對食品中氰化物進(jìn)行檢測的時候，又易受到食品中其它復(fù)雜成分的干擾。

熒光探針法，因其具有高選擇性、高靈敏度、反應(yīng)速度快等特點，在食品安全檢測方面被廣泛應(yīng)用[13-15]。近年來，熒光探針法在氰化物的檢測方面，也展現(xiàn)出了潛在的優(yōu)勢[16-17]，研究者們設(shè)計了熒光探針分子對水中的氰化物進(jìn)行了檢測，都展現(xiàn)出了較高的靈敏度和選擇性。但目前用于氰化物檢測的熒光探針分子往往存在水溶性較差，不利于實際應(yīng)用等問題，而且大部分都是基于人工合成的識別基團(tuán)，因此帶來探針分子合成繁瑣以及生物相容性不好等問題。已有研究[18]表明，將多肽與香豆素結(jié)合而得到的熒光探針分子展現(xiàn)出了很好的生物相容性和水溶性。

本研究設(shè)計將香豆素(Coumarin, C)骨架與甘氨酸-甘氨酸-組氨酸三肽(Gly-Gly-His，GGH)縮合得到熒光探針分子(C-GGH)，此探針的生色團(tuán)為香豆素結(jié)構(gòu)，識別基團(tuán)為GGH三肽。利用探針分子識別基團(tuán)與Cu2+絡(luò)合形成復(fù)合物(命名為C-GGH-Cu2+)使熒光淬滅，而復(fù)合物C-GGH-Cu2+在CN-的存在下，通過CN-與Cu2+的絡(luò)合形成更加穩(wěn)定的絡(luò)合物，體系熒光又得到恢復(fù)的原理，從而實現(xiàn)對食品中氰化物的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

甘氨酸、組氨酸、DIC、HOBt：分析純，吉爾生化上海有限公司；

硫酸銅、7-二乙胺基香豆素-3羧酸：分析純，上海安耐吉化學(xué)有限公司；

用于干擾性試驗的其它陰離子四丁基銨鹽類：分析純，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

用于合成的有機(jī)溶劑：分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；

1.1.2 樣品的采集

研究過程中的食物樣本為本單位監(jiān)督抽檢過程中所抽取的樣品，檢驗過程中發(fā)現(xiàn)氰化物含量較高的樣品，留樣進(jìn)行本試驗研究；部分種類樣品采取加標(biāo)方式。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光分光光度計：F-2500型，日本日立公司；

核磁共振譜儀：AMX-400型，瑞士Bruker公司；

高分辨質(zhì)譜儀：LCQ Fleet型，美國Thermo-Fisher公司；

紫外可見分光光度計：UV2450型，日本島津公司；

高效液相色譜儀：6AD型，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 GGH三肽的合成 GGH三肽的合成照參文獻(xiàn)[19]，利用HOBt和DIC通過標(biāo)準(zhǔn)的多肽液相合成法來合成，合成產(chǎn)率為67%。

1.3.2 C-GGH熒光探針的合成 將7-二乙胺基香豆素-3-羧酸(522 mg，2 mmol)室溫條件下加入DMF(10 mL)中，攪拌下加入DIC (2 mmol)，HOBt ( 2 mmol)活化反應(yīng)1 h。將含有三肽GGH (538 mg，2 mmol)的DMF(10 mL)溶液緩慢滴入到上述反應(yīng)液中，繼續(xù)室溫攪拌反應(yīng)3 h。待反應(yīng)結(jié)束后，向最終反應(yīng)液中加入冰乙醚(80 mL)，析出黃色沉淀。在冷凍條件下高速離心并收集沉淀產(chǎn)物。用高效液相色譜分離純化粗產(chǎn)物，得到黃色固體產(chǎn)物789 mg (收率：77%)。

1.3.3 產(chǎn)物表征 核磁共振氫譜(1H-NMR)表征：共振頻率為500 MHz，D2O重水作為溶劑，TMT作為內(nèi)標(biāo)物，室溫進(jìn)行掃描。質(zhì)譜(ESI-MS)表征：采用電噴霧離子源(ESI)形式，選擇正離子模式，掃描范圍為從100～1 000m/z。

1.3.4 氰化物的檢測 將合成的熒光探針分子C-GGH (1.0 μmol/L)溶解于水體系的HEPES緩沖溶液中(pH=10.0)中，加入等濃度的銅離子(1.0 μmol/L)混合得到C-GGH-Cu2+溶液。然后分別加入含不同濃度氰化物的溶液后均勻混合，測試絡(luò)合物探針溶液的熒光光譜，以溶液在470 nm處的熒光發(fā)射值對氰根離子濃度作圖。作為對照，食物樣品中的氰化物含量參考GB/T 5009.48—2003、GB/T 5009.36—2003和GB/T 8538—2008中規(guī)定的檢測方法進(jìn)行檢測并比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 C-GGH熒光探針分子的合成與表征

C-GGH熒光探針分子的合成路線見圖1。7-二乙胺基香豆素-3-羧酸上的羧基適合標(biāo)準(zhǔn)的多肽縮合反應(yīng)，可與氨基酸或多肽的氨基縮合。但考慮到香豆素的位阻效應(yīng)可能會影響到下一步反應(yīng)的產(chǎn)率，本研究中先合成GGH三肽，再與7-二乙胺基香豆素-3-羧酸縮合。另一方面，為了避免縮合過程中出現(xiàn)GGH三肽分子內(nèi)或自身分子間反應(yīng)的情況，合成過程中先將7-二乙胺基香豆素-3-羧酸活化，再采取將GGH溶液緩慢滴入到活化反應(yīng)液中的方式，整個滴加過程控制在2.5～3.0 h。

圖1 C-GGH 合成路線

液相法合成以后，向反應(yīng)液中加入冰乙醚析出固體，再用高效液相分離提純，得到純度90%以上的C-GGH。然后通過質(zhì)譜對探針分子進(jìn)行表征，(HRMS:m/z, calcd for [M+H]+513.209 2; found 513.208 9)，表征結(jié)果與理論值吻合。進(jìn)一步的核磁表征也對合成產(chǎn)物進(jìn)行了證實(見圖2)，1H NMR (400 Hz, D2O):δ8.49 (dd,J=20.3, 3.2 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.22～7.12 (m, 1H), 6.93 (d,J=8.9 Hz, 1H), 6.36 (d,J=8.1 Hz, 1H), 6.00 (s, 1H), 4.66～4.61 (m, 2H), 3.94 (s, 2H), 3.78 (d,J=34.7 Hz, 2H), 3.28～3.02 (m, 6H), 0.95 (t,J=6.6 Hz, 6H)。質(zhì)譜和核磁的表征結(jié)果說明，通過以上所述合成路線及合成方法順利得到了C-GGH探針分子。

2.2 C-GGH-Cu2+在氰化物作用下的熒光變化

將C-GGH (1.0 μmol/L)溶解于水體系的HEPES緩沖溶液中，加入不同濃度的Cu2+(硫酸銅形式)后測試熒光光譜，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到等物質(zhì)的量時，C-GGH熒光基本猝滅。因此研究中選擇將1.0 μmol/L的C-GGH加入等濃度的Cu2+混合得到C-GGH-Cu2+探針溶液。然后分別加入不同濃度的氰根離子后均勻混合，測試絡(luò)合物探針溶液的熒光光譜，結(jié)果如圖3所示，隨著不同濃度氰根離子的加入，絡(luò)合物探針溶液的熒光逐漸恢復(fù)，當(dāng)氰根離子的濃度達(dá)到探針分子濃度30倍時，熒光強度恢復(fù)到最大值。以溶液在470 nm處的熒光發(fā)射值對氰根離子濃度作圖見圖4，發(fā)現(xiàn)氰根離子濃度在0.15～15.00 μmol/L時，兩者之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。檢測限為0.015 μmol/L。根據(jù)GB 2757—2012、GB 2715—2005和GB 8537—2008規(guī)定，氰化物在蒸餾酒與配制酒中的限量值為8.0 mg/L(以HCN計，折算酒精度為100%)，糧食中氰化物限量值為0.015 mg/kg，自來水中限量值為0.05 mg/L，礦泉水中限量值為0.01 mg/L，以限量值要求最高的礦泉水計算，礦泉水中氰化物的限量值折算為摩爾濃度后為0.385 μmol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于檢測限，說明該熒光探針分子的靈敏度足以滿足食品中氰化物的檢測。

圖2 C-GGH 核磁表征結(jié)果

圖3 1 μmol/L的C-GGH-Cu2+在不同濃度氰化物作用下的熒光變化

Figure 3 Fluorescence titration of C-GGH-Cu2+(1.0 μmol/L) with CN-(0, 0.2, 0.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, and 30 μmol/L)

圖4 C-GGH-Cu2+對氰化物檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 4 Dose-dependent luminescence response of C-GGH-Cu2+(1.0 μmol/L) to CN-

2.3 C-GGH-Cu2+對氰根離子的選擇性

圖5 C-GGH-Cu2+對不同陰離子的響應(yīng)圖Figure 5 Fluorescence changes of C-GGH-Cu2+ (1.0 μmol/L) upon the addition of various anions

圖6 不同陰離子的競爭檢測結(jié)果圖

Figure 6 Fluorescence responses of C-GGH-Cu2+at 478 nm in the presence of diferent anions (15.0 μmol/L) (black bars), followed by addition of CN-(15.0 μmol/L) (gray bars)

2.4 C-GGH-Cu2+對實際樣品的檢測

以上研究證明C-GGH-Cu2+探針對氰化物的檢測具有很高的靈敏度和選擇性，但食物樣品成分復(fù)雜，因此，本研究選取了酒、面粉、水等較易出現(xiàn)氰化物含量超標(biāo)的食物樣品作為代表，將該熒光探針法與國標(biāo)(GB/T 5009.48—2003、GB/T 5009.36—2003、GB/T 8538—2008)檢測方法進(jìn)行對比研究，以確定該方法的準(zhǔn)確度。由表1可知，本研究的熒光探針方法與以上國際方法相比，在對配制酒中氰化物檢測上，誤差率為2%～3%，對白酒的誤差率更低，僅為1.11%，可能因為白酒的成分相對配制酒更簡單，另外配制酒一般都帶顏色，對檢測結(jié)果也會稍有影響。面粉、自來水、礦泉水的誤差率相對稍微高點，分別為6.45%，4.81%，8.33%，原因主要為該類食品中氰化物的含量非常低，但即使有略高的誤差值，其結(jié)果也完全不會影響到對食品中氰化物含量的判定。因此，從表1中的對比研究數(shù)據(jù)可以確定，本研究中的熒光探針方法能準(zhǔn)確檢測食品中氰化物的含量，其準(zhǔn)確度與國標(biāo)(GB/T 5009.48—2003、GB/T 5009.36—2003、GB/T 8538—2008)檢測方法一致。

表1 熒光探針對實際樣品的檢測

3 結(jié)論

本研究以甘氨酸、組氨酸、7-二乙胺基香豆素-3-羧酸為原料，采用標(biāo)準(zhǔn)多肽合成法成功合成了水溶性好的熒光探針分子C-GGH，該探針分子與等物質(zhì)量的Cu2+作用形成C-GGH-Cu2+，熒光猝滅，新形成的C-GGH-Cu2+絡(luò)合物隨著氰化物的加入熒光又逐漸恢復(fù)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)C-GGH-Cu2+對氰化物表現(xiàn)出了高靈敏度和高選擇性，經(jīng)對實際食物樣品中氰化物進(jìn)行檢測，證明該方法的準(zhǔn)確度與國標(biāo)(GB/T 5009.48—2003、GB/T 5009.36—2003、GB/T 8538—2008)檢測方法一致。該法與現(xiàn)有常用的食品中氰化物檢測方法相比，具有簡單、快捷、低毒性等優(yōu)勢，因此，該方法在食品中氰化物的快速檢測方面具有較大的潛在應(yīng)用價值。

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Devise and synthesis of fluorescent probe for cyanide detection in food based on a peptide receptor

ZHOUBin-bin1WANGXia-li1WANGFang-bin1ZHANGJi-hong1YANGTao1CHENGYun-hui2HAOYuan-qiang3

(1.HunanInstituteofFoodQualitySupervisionInspectionandResearch,Changsha,Hunan410117,China; 2.SchoolofChemistryandBiologicalEngineering,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha,Hunan410114,China; 3.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShangqiuNormalUniversity,Shangqiu,Henan476000,China)

food; cyanide; peptide; fluorescent probe; detection

國家自然科學(xué)基金項目(編號：U1404215，31171627，31071523)；湖南省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品安全科技項目(編號：湘食藥科R201516)

周彬彬，男，湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院工程師，博士。

程云輝(1964-)，女，長沙理工大學(xué)教授，博士。

E-mail: chengyh6488@sina.com

2016—08—31

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.010