丁酸梭菌豬血粉固體培養(yǎng)基的設(shè)計與優(yōu)化

秦東方 劉愛民 李 豪

(1. 馬鞍山師范高等?？茖W校，安徽 馬鞍山 243041；2. 安徽師范大學生命科學學院，安徽 蕪湖 241002)

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丁酸梭菌豬血粉固體培養(yǎng)基的設(shè)計與優(yōu)化

秦東方1劉愛民2李 豪1

(1. 馬鞍山師范高等?？茖W校，安徽 馬鞍山 243041；2. 安徽師范大學生命科學學院，安徽 蕪湖 241002)

為了達到豬血有效降解與丁酸梭菌微生物生態(tài)制劑偶聯(lián)生產(chǎn)的目的，運用混料設(shè)計方法對丁酸梭菌的豬血粉固體培養(yǎng)基進行設(shè)計和優(yōu)化，建立數(shù)學回歸模型，探討培養(yǎng)基各成分及其之間的交互作用對結(jié)果的影響，并將其發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于飼料。結(jié)果表明：最優(yōu)化配方為促生長因子4.8%、玉米粉46.3%、豬血粉49.0%，在該條件下丁酸梭菌可以達到8.18×107CFU/g，游離氨基酸態(tài)氮的含量由發(fā)酵前的0.02 g/100 g增加到3.13 g/100 g。方差分析和驗證實驗都表明應(yīng)用混料設(shè)計法建立的數(shù)學模型適用于丁酸梭菌的豬血粉固體培養(yǎng)基優(yōu)化。

丁酸梭菌；混料設(shè)計；培養(yǎng)基配方；豬血粉；固體發(fā)酵

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)又名酪酸菌，是從健康人和動物腸道中分離出來的一種嚴格厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌[1-2]，具有產(chǎn)丁酸、葉酸等益生物質(zhì)的特性[3]，可促進動物生長、調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡、提高機體免疫力，抑制腸道內(nèi)致病菌生長繁殖，在畜牧養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。同時，丁酸梭菌在生長過程中可以產(chǎn)生諸多酶系，如蛋白酶系[6-7]、淀粉酶系等[8]，這些酶可以將飼料中的大分子蛋白質(zhì)和淀粉水解成為小分子物質(zhì)，既有利于丁酸梭菌的增殖生長，又能提供動物可以消化吸收的小分子營養(yǎng)物質(zhì)，提高了原料利用率。

豬血是一種價格低廉的畜產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，在中國資源十分豐富。新鮮豬血中含有約19%的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成平衡，其中賴氨酸和色氨酸含量比較高，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和氨基酸資源[9]。另外，豬血中含有豐富的具有維生素和鐵、鉀、磷、鎂、鈣等礦物質(zhì)，營養(yǎng)均衡，價值較高[10]。但由于血紅蛋白易于褐變，適口性差等問題嚴重制約了豬血資源的開發(fā)和利用。為此，研究者從不同角度對豬血資源進行開發(fā)利用，萬佳蓉等[11]利用多菌種進行混合發(fā)酵豬血，周毅等[12]篩選出水解豬血蛋白的優(yōu)良菌株，李斌等[13]酶解豬血制備血紅素。這些研究主要集中于水解豬血蛋白生成多肽或氨基酸以及相應(yīng)的衍生物。而將豬血降解與微生物生態(tài)制劑偶聯(lián)生產(chǎn)的研究卻鮮有報道。本研究擬將豬血降解與益生菌丁酸梭菌生態(tài)制劑制備的偶聯(lián)生產(chǎn)進行研究，以獲得富含營養(yǎng)的豬血蛋白水解物和具有益生功能的丁酸梭菌微生物生態(tài)制劑，實現(xiàn)高品質(zhì)多功能飼料的高效生產(chǎn)?；诖?，本試驗重點研究丁酸梭菌發(fā)酵豬血的首要問題，即培養(yǎng)基成份的配比，以期為后序研究和開發(fā)集營養(yǎng)與保健功能于一體的丁酸梭菌豬血產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種：丁酸梭菌(ClostridiumbutyricumMIYAIRI 588)，從日本米雅利桑制藥株式會社生產(chǎn)的口服酪酸梭菌活菌片中分離得到；

丁酸梭菌液體種子培養(yǎng)基：各物質(zhì)按質(zhì)量分數(shù)計為胰蛋白胨2%、牛肉膏1%、酵母膏0.6%、葡萄糖0.4%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.04%、氯化鈣0.02%；

高層半固體瓊脂培養(yǎng)基：液體種子培養(yǎng)基添加0.3%的瓊脂而制得；

豬血粉：蛋白質(zhì)含量達90%，天津恩彼蛋白質(zhì)公司；

玉米粉：購自安徽馬鞍山安民菜市場的玉米經(jīng)粉碎過30目篩后所得。

1.2 方法

1.2.1 活菌數(shù)測定 精確稱取已發(fā)酵好的固體培養(yǎng)基10 g，加入裝有100 mL無菌水的錐形瓶內(nèi)，在振蕩器中以100 r/min的速度振蕩20 min，等微生物完全溶解于無菌水后過濾制備得丁酸梭菌菌懸液，準確吸取10.00 mL菌懸液至90.00 mL無菌水中稀釋，經(jīng)充分振蕩后吸取1.00 mL至裝有9.00 mL無菌水的試管中，重復(fù)此操作，稀釋至合適的濃度后采用高層半固體瓊脂試管計數(shù)法測定活菌數(shù)[14]。

1.2.2 丁酸梭菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備

(1) 培養(yǎng)基主要成分的設(shè)計：培養(yǎng)基以農(nóng)副產(chǎn)品豬血粉為主要原料，添加一定量的玉米粉，由于蛋白質(zhì)和淀粉都屬于大分子物質(zhì)，在發(fā)酵初期由于丁酸梭菌總數(shù)少，很難快速見效，需要加入一定的促生長因子如硫酸銨、葡萄糖和無機鹽類等，本研究參考丁酸梭菌液體種子培養(yǎng)基成分確定促生產(chǎn)因子的成分為硫酸銨、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和氯化鈣，其質(zhì)量配比為40∶40∶10∶5∶5。經(jīng)上述分析將丁酸梭菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計為3種成分，即豬血粉、玉米粉和促生長因子。

對于丁酸梭菌培養(yǎng)基的制備，有不少研究者[14-16]嘗試了多種方法，而混料試驗設(shè)計方法更側(cè)重于研究各試驗因子的不同比例來反映變量的關(guān)系，不必考慮配方的總量，是一種快捷高效的方法?？紤]到推廣應(yīng)用成本，本研究采用限制成分上下界的混料設(shè)計，即對每種成分的比例都進行了適當?shù)南拗?，其形式為：X1+X2+X3=100%，具體各成分的限制條件見表1。

借助試驗設(shè)計軟件Design Expert(Version 6.0.5，Stat-Ease Int. Co., Minneapolis, MN. USA)，采用混料(Mixture)設(shè)計中的D-Optional方法[17]。以每克培養(yǎng)基中丁酸梭菌的數(shù)量為指標，對丁酸梭菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方進行優(yōu)化。

(2) 固體培養(yǎng)基的配制與滅菌：稱取培養(yǎng)基100 g，然后與100 mL水混和均勻，裝入三角瓶中，塞上瓶塞后，放入滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后即得固體培養(yǎng)基。

表1 豬血粉培養(yǎng)基各成分限制條件表

1.2.3 菌種活化與固態(tài)培養(yǎng) 從分離純化得到的丁酸梭菌菌種斜面上挑取一環(huán)接種于種子培養(yǎng)液中，35 ℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h后進行鏡檢，當90%以上的菌體形成芽孢時，即得到成熟的種子菌，將活化的種子菌懸液以體積質(zhì)量比為8%的接種量接入裝有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。

1.3 培養(yǎng)基氨態(tài)氮測定

[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸模型的建立

表2列出了利用豬血粉等原料發(fā)酵后丁酸梭菌生成量的試驗結(jié)果和對應(yīng)的預(yù)測值，運用Design Expert軟件，對試驗值進行二次多項式回歸擬合，得回歸方程：

R1=-189.933X1-120.930X2-106.033X3+270.495X1X2+416.419X1X3+482.982X2X3，

(1)

其中限制條件見表1，且X1+X2+X3=1，回歸方程的R2=0.994 3。

利用Design Expert軟件對試驗方案進行設(shè)計，并對試驗結(jié)果進行方差分析見表3。由表3可知，線性模型和3種成分間的交互作用的F值都比較大，P值都小于0.05，表明所考慮的這些因素以及三者間的交互作用對丁酸梭菌的生長繁殖都有顯著影響，是決定其生長的重要因素。從整個回歸模型的F值217.33和P值< 0.000 1來看，該模型能夠很好地擬合實際情況，失擬項影響不顯著，表明除模型中考慮的項目外，再無對結(jié)果影響顯著的項目，進一步表明該模型與試驗數(shù)據(jù)擬合得較好。從相關(guān)性分析結(jié)果來看，R-Squared=0.994 3表明預(yù)測值與試驗值之間有高度的相關(guān)性，AdjR-Squared=0.990 5再次表明試驗數(shù)據(jù)與二次回歸模型間擬合程度好。

表2 培養(yǎng)基混料設(shè)計試驗方案、試驗結(jié)果及回歸值

表3 二次多項式模型方差分析表

2.2 培養(yǎng)基中各組分對丁酸梭菌生長量的影響

混料設(shè)計的等高線圖和三維曲面圖可以直觀地表現(xiàn)出組分間變化對指標的影響。由圖1、2可知，同一等高線上的線條為曲線，表明豬血粉、玉米粉和生長因子3種組分之間存在相互作用，這與表3中方差分析的結(jié)果之一，即三組分間交互作用都比較顯著的結(jié)論是一致的。在培養(yǎng)基的3種成分中，促生長因子由于分子量小、營養(yǎng)全面等特點，在發(fā)酵前期極易被吸收利用，使得丁酸梭菌得以快速生長，而丁酸梭菌數(shù)量的倍增，所產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶等生物催化劑的量快速增加，進而加速了對玉米粉和豬血粉大分子的分解，其所生成的葡萄糖、氨基酸及礦物質(zhì)更促進了丁酸梭菌的生長繁殖，因此三成分間就產(chǎn)生了交互作用，本試驗對固體培養(yǎng)基進行研究的目的，就是要通過各種營養(yǎng)物對丁酸梭菌生長的協(xié)同增效作用，來提高生產(chǎn)效率，降低成本。

圖1 回歸模型的三維表面圖

圖2 回歸模型的等高線圖

2.3 丁酸梭菌固體發(fā)酵劑配方成分優(yōu)化

根據(jù)試驗值的擬合情況及限制條件，如果將限制條件X1+X2+X3=1變化為X3=1-X1-X2，則擬合方程即為關(guān)于X1和X2的二元二次多項式回歸方程，并且二次系數(shù)都為負值，說明單因素的拋物線有最大值，結(jié)合三維曲面圖和等高線圖可知，圖形近似球形且開口向下，表明各自變量在一定區(qū)間內(nèi)有最大值。應(yīng)用軟件的最優(yōu)化分析方法(Optimization)設(shè)定各組分的變化范圍和響應(yīng)值為最大值(表1)，運行軟件后，根據(jù)最陡爬坡預(yù)測并結(jié)合配方成本，本研究確定最優(yōu)化配方為促生長因子4.7%，玉米粉46.3%，豬血粉49.0%，預(yù)測回歸值為8.18×107CFU/g。按照優(yōu)化后的配方比例將各種成分混合后進行驗證實驗，4次結(jié)果的平均值8.08×107CFU/g，標準差為0.065×107CFU/g，變異系數(shù)C.V=0.8%。將回歸值8.18×107CFU/g作為標準值，應(yīng)用t檢驗得t=-3.08，根據(jù)顯著水平α=0.05，自由度df= 3，查表可得t0.025=3.182，t0.05=4.541，由此可以判斷回歸值與實際值之間無顯著差異，說明回歸方程得到的最優(yōu)化回歸值較好地反映了真實情況。并測得培養(yǎng)基中的游離氨基酸態(tài)氮的含量從發(fā)酵前的0.02 g/100 g增加為3.13 g/100 g，說明丁酸梭菌在生長過程中豬血中的蛋白質(zhì)得到有效的水解。

3 結(jié)論

混料設(shè)計方法是一種高效的設(shè)計培養(yǎng)基配方的方法，不僅可以運用回歸分析方法建立直觀的數(shù)學模型，還能夠通過較少的試驗次數(shù)對配方中的各成分及其交互作用進行評價[19-20]。本研究將豬血水解與丁酸梭菌微生物生態(tài)制劑進行偶聯(lián)生產(chǎn)確定設(shè)計和優(yōu)化后的培養(yǎng)基最佳配方為促生長因子4.8%，玉米粉46.3%，豬血粉49.0%，預(yù)測回歸值為8.18×107CFU/g，該預(yù)測值與實際測定平均值8.08×107CFU/g之間差值較小，經(jīng)t檢測二者間無顯著差異，進一步表明混料設(shè)計法優(yōu)化的數(shù)學模型適用于本項目培養(yǎng)基的優(yōu)化設(shè)計。與戚薇[14]、孔青[15]等所得結(jié)果相差無幾，而本培養(yǎng)基配方成本更低，更符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求，更具有技術(shù)和經(jīng)濟優(yōu)勢。同時實現(xiàn)了豬血的水解，并使培養(yǎng)基中的游離氨基酸態(tài)氮的含量從發(fā)酵前的0.02 g/100 g增加為3.13 g/100 g，說明丁酸梭菌在生長過程中豬血中的蛋白質(zhì)得到有效的水解。

本項目創(chuàng)新性地利用豬血來實現(xiàn)益生菌丁酸梭菌和豬血高游離氨基酸飼料的偶聯(lián)生產(chǎn)，開辟了動物血液利用的新途徑，具有良好的經(jīng)濟社會效益和廣闊的市場應(yīng)用前景。

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Design and optimization of solid fermentation of porcine blood powder medium forClostridiumbutyricum

QINDong-fang1LIUAi-min2LIHao1

(1.Ma’anShanTeacher’sCollege,Ma’anshan,Anhui243041,China;2.CollegeofLifeScience,AnhuiNormalUniversity,Wuhu,Anhui241002,China)

For the purpose of joint production of hydrolysis of porcine blood and microbial ecology preparation ofClostridiumbutyricum, it was studied that the solid medium formulation suitable for the growth and reproduction ofC.butyricumwas made of porcine blood powder, and the fermentation products would be used in feed. The formulation of the solid medium formulation was designed and optimized by the mean of mixture design. Moreover, the mathematical regression model of three components of solid medium was established, and the various components and the interaction between them were also discussed. Furthermore, the results showed that the optimum formula was constituted by the growth promoting factor 4.8%, corn flour 46.3%, porcine blood powder 46.3%. On this condition，the number ofC.butyricumwas expected to reach 8.18×107CFU/g, and the content of free amino acid nitrogen increased from 0.02 g/100 g to 3.13 g/100 g during the fermentation. Consequently, variance analysis and verification test both showed that the mathematical model established by mixture design method was suitable for optimizing the solid fermentation of porcine blood powder medium forC.butyricum.

Clostridiumbutyricum; mixture design; substrate prescription; porcine blood powder; solid fermentation

安徽省高等學校省級自然科學研究項目(重點)(編號：KJ2014A2461)；安徽省高等學校自然科學研究項目(重點)(編號：KJ2016A692)

秦東方，男，馬鞍山師范高等?？茖W校副教授，碩士。

李豪(1978—)，男，馬鞍山師范高等專科學校副教授，碩士。E-mail:450685941@qq.com

2016—08—10

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.009