Gli表達(dá)下調(diào)對(duì)人胃腺癌AZ521細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制

米源，杜媛鯤，劉慶熠,廖海江，王林，王雷

(1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011；2河北醫(yī)科大學(xué)期刊社)

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Gli表達(dá)下調(diào)對(duì)人胃腺癌AZ521細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制

米源1，杜媛鯤2，劉慶熠1,廖海江1，王林1，王雷1

(1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011；2河北醫(yī)科大學(xué)期刊社)

目的 探討鋅指蛋白(Gli)表達(dá)下調(diào)對(duì)人胃腺癌AZ521細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的影響，并探討其分子機(jī)制。方法 將培養(yǎng)好的人胃腺癌AZ521細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，分別用Gli1&Gli2 siRNA、對(duì)照siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Gli1、Gli2 mRNA表達(dá)；Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Gli1、Gli2、細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)、p21、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果 轉(zhuǎn)染48 h，與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，CyclinE、Vimentin和MMP-9蛋白表達(dá)下調(diào)，E-cadherin、p21蛋白表達(dá)上調(diào)，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，侵襲能力降低(P均<0.05)。結(jié)論 同時(shí)下調(diào)Gli1、Gli2基因表達(dá)可阻滯胃腺癌AZ521細(xì)胞周期、降低細(xì)胞侵襲能力，其機(jī)制可能與二者調(diào)節(jié)CyclinE、p21、E-cadherin、Vimentin和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

胃腫瘤；鋅指蛋白基因；細(xì)胞周期；細(xì)胞侵襲

多數(shù)胃癌患者就診時(shí)已處于進(jìn)展期，即使經(jīng)過(guò)常規(guī)治療，但由于腫瘤細(xì)胞的高度侵襲性，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。近年來(lái)研究表明，Hedgehog(Hh)信號(hào)通路的異常活化和下游目的基因的過(guò)度表達(dá)是多種高侵襲性惡性腫瘤的共同特征，其參與調(diào)控多種腫瘤的異常增殖、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥[1～4]。既往關(guān)于Hh異常表達(dá)和胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究集中在對(duì)Hh上游通路Smo進(jìn)行調(diào)控[5]，而針對(duì)胃癌細(xì)胞中Hh通路的核心下游靶點(diǎn)鋅指蛋白1(Gli1)和Gli2的調(diào)控與胃癌生物學(xué)行為關(guān)系的研究極少。2015年8月～2016年1月，本研究通過(guò)siRNA特異性抑制Gli在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，初步探討Gli1、Gli2參與胃腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)Z521(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所)。胎牛血清(美國(guó)Gemini公司)，EMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)，SilencerTMSelect Gli1、Gli2和對(duì)照siRNA(美國(guó)Life Technologies公司)，LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；總RNA提取試劑盒(德國(guó) Qiagen公司)；TaqManTM基因表達(dá)預(yù)混液(美國(guó)Applied Biosystems公司)；TaqManTMGli1、Gli2及GAPDH的引物和探針(購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司)；Gli1兔抗人多克隆抗體、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)鼠抗人單克隆抗體、波形蛋白(Vimentin)兔抗人單克隆抗體和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)鼠抗人單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)兔抗人單克隆抗體(美國(guó)Cell signaling公司)；Gli2鼠抗人單克隆抗體、p21鼠抗人單克隆抗體和GAPDH鼠抗人單克隆抗體均(美國(guó)Santa Cruz公司)。Pierce-BCA蛋白分析試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)；ABI 7900HT高通量熒光定量RT-PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；Epics-XL 型流式細(xì)胞儀(美國(guó) Beckman-Coulter公司)；Matrigel 膠(美國(guó)BD公司)；iScriptTMcDNA合成試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)；Transwell膜嵌套(美國(guó)Corning公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 將AZ521細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 EMEM培養(yǎng)基。將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AZ521以3×105/孔接種于6孔板，細(xì)胞融合生長(zhǎng)至50%～60%時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)基。將細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組。按照LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行siRNA干擾引物的轉(zhuǎn)染，將Gli1&Gli2 siRNA轉(zhuǎn)染入實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染入空白對(duì)照組，濃度均為100 nmol/L，于轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞內(nèi)Gli1、Gli2 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR技術(shù)。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組樣本RNA并測(cè)定濃度。按照iScriptTMcDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄，條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。用無(wú)R-Nase水稀釋cDNA，將反應(yīng)體系10 μL(Taqman 基因表達(dá)預(yù)混液5 μL、cDNA 4.5 μL和TaqManTMGli1、Gli2、GAPDH各自的引物、探針0.5 μL)加樣于384孔板，放置于ABI 7900HT高通量RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH的Ct值作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細(xì)胞內(nèi)CyclinE、p21、E-cadherin、Vimentin及MMP-9蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，PBS 洗滌3次，每個(gè)6孔板內(nèi)加含有蛋白酶抑制劑的M-PER細(xì)胞總蛋白提取試劑100 μL，收集每組樣本的總蛋白提取液，BCA法測(cè)定樣本的總蛋白濃度。蛋白上樣與SDS-PAGE凝膠電泳200 V 50 min。冰水浴轉(zhuǎn)至PVDF膜100 V 1 h。室溫5%脫脂奶粉的TBST液封膜1 h，分別加入一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min。分別加羊抗鼠或羊抗兔二抗(1∶20 000)室溫孵育1 h，ECL試劑發(fā)光5 min后暗室曝光顯影，Image軟件檢測(cè)蛋白條帶灰度值。設(shè)定GAPDH為內(nèi)參，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。于轉(zhuǎn)染后48 h制備單細(xì)胞懸液，PBS漂洗后置于4 ℃、70%冰乙醇固定30 min。用冷PBS漂洗3次，于37 ℃含碘化丙啶40 μg和RNaseA 100 μg的PBS中孵育30 min。上機(jī)檢測(cè)各組樣品的DNA含量，采用MuticycleAV分析軟件對(duì)DNA細(xì)胞周期進(jìn)行擬合分析，計(jì)算每周期細(xì)胞百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。將Matrigel膠從-80 ℃冰箱中取出置于4 ℃待其融化，按1∶4比例用培養(yǎng)基稀釋后鋪于聚碳酸酯膜上并放置于培養(yǎng)箱待固化。24 h后收集細(xì)胞，吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液重懸在無(wú)血清培養(yǎng)液中，在Transwell小室上室加入包含7.5×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液100 μL，下室加含10%血清的培養(yǎng)液500 μL，于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h，用棉棒擦去聚碳酸酯膜上層基質(zhì)膠和未遷移的細(xì)胞，4%甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下高倍視野(×400)觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。每張膜隨機(jī)觀察4個(gè)視野取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組Gli1、Gli2 mRNA表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染后48 h，實(shí)驗(yàn)組Gli1、Gli2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.03、0.37±0.04，空白對(duì)照組分別為1.00±0.02、1.00±0.05；實(shí)驗(yàn)組Gli1、Gli2 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組(P均<0.05)。

2.2 兩組各類蛋白表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染后48 h，與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Gli1、Gli2、CyclinE、MMP-9和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，p21、E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P均 <0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組各類蛋白表達(dá)比較

2.3 兩組周期比較 轉(zhuǎn)染后48 h，實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞百分比(65.10±3.00)%，S期細(xì)胞百分比(32.99±2.50)%；空白對(duì)照組分別為(47.08±2.45)%、(50.85±2.70)%。與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少(P均<0.05)。

2.4 兩組侵襲能力比較 轉(zhuǎn)染后24 h，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)(179±7)個(gè)/視野，空白對(duì)照組為(260±11)個(gè)/視野，與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。

3 討論

Hh信號(hào)通路最初在1980年在研究果蠅幼蟲(chóng)體節(jié)發(fā)育的基因突變遺傳分析時(shí)被發(fā)現(xiàn)并命名。經(jīng)典的Hh信號(hào)通路自上而下主要由Hh配體、跨膜蛋白受體Ptch、Smo、核轉(zhuǎn)錄因子Gli和下游多種靶基因等構(gòu)成，其通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切。因此，闡明Hh通路和腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系將為臨床腫瘤的治療提供一個(gè)新思路。Yoo等[5]發(fā)現(xiàn)，Shh在胃癌組織中高表達(dá)，與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)，應(yīng)用Hh上游通路拮抗劑Cyclopamine可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。此外，有研究發(fā)現(xiàn),核轉(zhuǎn)錄因子Gli作為Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路的核心調(diào)控樞紐，應(yīng)用Gli抑制劑下調(diào)Gli表達(dá)比應(yīng)用上游通路拮抗劑具有更高效的抑瘤作用，認(rèn)為Gli可作為神奇的調(diào)控靶點(diǎn)[6]。本研究采用RNA干擾技術(shù)，應(yīng)用siRNA下調(diào)人胃腺癌AZ521細(xì)胞的Gli1和Gli2表達(dá)，觀察抗腫瘤效果并探討Gli與胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Gli1&Gli2 siRNA的胃癌AZ521細(xì)胞中內(nèi)源性Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，低于空白對(duì)照組，提示在胃癌AZ521細(xì)胞中存在Gli異常激活，應(yīng)用特異性的Gli1、Gli2 siRNA能有效下調(diào)胃癌細(xì)胞中內(nèi)源性Gli1、Gli2的表達(dá)。

細(xì)胞周期紊亂與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)最終體現(xiàn)在細(xì)胞周期。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組較空白對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的異常增殖。CyclinE是參與細(xì)胞周期G1與S轉(zhuǎn)換的重要正性調(diào)節(jié)因子，在腫瘤細(xì)胞G1晚期發(fā)揮正調(diào)控細(xì)胞周期的作用，促進(jìn)腫瘤的異常增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細(xì)胞中應(yīng)用Sox2可下調(diào)CyclinE進(jìn)而抑制腫瘤的增殖[7]。p21作為周期蛋白依賴性激酶抑制劑可以與Cyclin-CDK復(fù)合物相結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。p21表達(dá)上調(diào)可以通過(guò)抑制CDK2和CyclinE從而達(dá)到抑制上皮細(xì)胞增殖的作用[8]。目前關(guān)于胃腺癌細(xì)胞Gli表達(dá)與CyclinE、p21關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默Gli1和Gli2基因表達(dá)后，胃腺癌AZ521細(xì)胞CyclinE蛋白表達(dá)下降，p21蛋白表達(dá)上調(diào)，表明Hh/Gli信號(hào)通路異常激活后誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有可能是通過(guò)調(diào)節(jié)p21和CyclinE表達(dá)來(lái)完成，抑制Gli的表達(dá)可以調(diào)控AZ521的細(xì)胞周期。

腫瘤細(xì)胞除了異常增殖之外，另一個(gè)重要特征就是腫瘤細(xì)胞通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的生物學(xué)過(guò)程失去了上皮細(xì)胞表型的緊密連接，同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲、遷移。其中以上皮表型標(biāo)志E-cadherin下調(diào)和間質(zhì)表型Vimentin上調(diào)為重要特征，使腫瘤細(xì)胞更加富于侵襲性[9，10]。此外，MMP-9也是EMT的標(biāo)記物之一，可以通過(guò)破壞、降解鄰近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。Moirangthem等[11]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MMP-9可以通過(guò)增加細(xì)胞間的黏附和調(diào)節(jié)EMT過(guò)程抑制乳腺癌的進(jìn)展。Aaij等[12]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Vimentin基因的膀胱癌細(xì)胞中Vimentin和MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)，明顯增強(qiáng)了膀胱癌細(xì)胞的侵襲性。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Gli1、Gli2表達(dá)后可導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin和MMP-9表達(dá)下調(diào)；Transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明下調(diào)Gli1、Gli2表達(dá)后穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少。究其原因可能是Gli通過(guò)下調(diào)E-cadherin和上調(diào)Vimentin表達(dá)，誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，抑制Gli1和Gli2表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。

綜上所述，Gli siRNA能顯著下調(diào)胃腺癌細(xì)胞中內(nèi)源性Gli mRNA和蛋白的表達(dá)，Gli表達(dá)下調(diào)可以改變胃腺癌細(xì)胞周期分布和EMT進(jìn)程，這可能與Gli調(diào)控Cyclin E、p2l、E-cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白表達(dá)密切相關(guān)。

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王雷(E-mail:yuankundu@163.com)

河北省科技廳科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(132077127D)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.011

R735.2

A

1002-266X(2016)37-0035-03

2016-03-29)