SOCS1基因沉默對人膀胱癌T24細胞增殖、侵襲及化療敏感性的影響

閆駿，朱小軍，斯欽布和，王國強，陳利剛，黃勇

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特010050)

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SOCS1基因沉默對人膀胱癌T24細胞增殖、侵襲及化療敏感性的影響

閆駿，朱小軍，斯欽布和，王國強，陳利剛，黃勇

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特010050)

目的 探討細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)基因沉默對人膀胱癌細胞增殖、侵襲及化療敏感性的影響。方法 將培養(yǎng)好的人膀胱癌T24細胞隨機分為三組，用Lipo2000將重組質(zhì)粒pU-SOCS1-siRNA(沉默SOCS1基因)、陰性對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至干擾組、對照組，空白組不做任何處理?；虺聊螅肦T-PCR技術(shù)檢測細胞中SOCS1 mRNA表達；Western blotting法檢測細胞中SOCS1蛋白表達；MTT法檢測細胞增殖率；流式細胞術(shù)檢測細胞周期及化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡率；Transwell小室模型檢測細胞侵襲能力；MTT法檢測細胞化療敏感性。結(jié)果 與其他兩組比較，干擾組SOCS1基因沉默后SOCS1 mRNA和蛋白表達降低(P均<0.05)；細胞增殖率降低(P均<0.05)；G0/G1期細胞增多，S、G2/M期細胞減少(P均<0.05)；吉西他濱誘導(dǎo)的細胞凋亡率升高(P<0.05)；體外侵襲能力減弱(P均<0.05)；對化療藥物卡鉑和吉西他濱的敏感性增強(P均<0.05)。結(jié)論 SOCS1基因沉默后，人膀胱癌細胞T24的增殖、體外侵襲能力下降，化療敏感性增強。

膀胱腫瘤；細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1；基因沉默；細胞增殖；細胞侵襲；化療敏感性

細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)在腫瘤中既可作為原癌基因也可作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。研究表明，SOCS1可抑制人胃癌細胞的生長及腹膜種植轉(zhuǎn)移[1]；SOCS1過表達可阻止癌細胞轉(zhuǎn)移及使其侵襲能力減弱[2]；SOCS1過表達還可通過抑制Janus激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)通路和激活p53信號通路負性調(diào)控惡性黑色素瘤細胞的增殖，促進體內(nèi)外細胞凋亡，使細胞周期阻滯在S期[3]。但另有研究證實，沉默SOCS1表達能抑制腫瘤細胞增殖，并阻止腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生[4]。miR-572通過抑制SOCS1基因表達，促進人卵巢癌細胞增殖和細胞周期進展[5]。SOCS1在腫瘤發(fā)生中的作用機制目前存在爭議，甚至在同種腫瘤不同細胞系中作用也可能不一致，推測SOCS1的作用可能與腫瘤類型、細胞種類等有關(guān)。為明確SOCS1在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用，2015年2～12月，本研究將人膀胱癌細胞株T24中SOCS1基因沉默后，觀察細胞增殖、侵襲及化療敏感性的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人膀胱癌細胞株T24(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國，Gibco)，RT-PCR試劑盒、2×Taq PCR MasterMix PCR擴增試劑(日本，TaKaRa)，pSilencerTM2.1-U6neo質(zhì)粒(美國，Ambion)，核酸內(nèi)切酶(美國，NEB)，卡鉑、吉西他濱、SOCS1抗體(美國，Sigma)，Lipo2000、BLOCK-iTTMU6 RNAi Entry Vector 試劑盒(美國，Invitrogen)，β-actin抗體(武漢，博士德)，羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(南京，碧云天)，細胞裂解液、MTT甲基噻唑基四唑(江蘇，凱基生物)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒、預(yù)染蛋白Marker(美國，Thermo Fisher Scientific)，引物(上海生工公司)。流式細胞儀(美國，BD)，梯度PCR儀(美國，Applied Biosystems 9700)。

1.2 SOCS1基因沉默及細胞分組 SOCS1干擾片段設(shè)計參考文獻[6]。SOCS1-siRNA寡核苷酸片段退火形成雙鏈DNA后，與pSilencerTM2.1/U6neo載體連接，構(gòu)建pU-SOCS1-siRNA真核表達載體。取對數(shù)期T24細胞種植于六孔板，培養(yǎng)12 h，細胞融合度為40%～50%備用。將培養(yǎng)好的T24細胞隨機分為三組，采用Lipo2000嚴格按照說明書進行轉(zhuǎn)染。干擾組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pU-SOCS1-siRNA沉默SOCS1基因，陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒，空白組不做任何處理。轉(zhuǎn)染6 h，換含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細胞內(nèi)SOCS1 mRNA表達檢測 采用RT-PCR技術(shù)?；虺聊?8 h收集細胞，六孔板每孔添加適量TRIzol和氯仿，移液器吹打，提取總RNA，去基因組后檢測RNA純度，純度合格且無蛋白質(zhì)污染，用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；SOCS1上游引物：5′-ATGCAGTCTCCACAGCAGCAGAG-3′，下游引物：5′-CGAACGGAATGTGCGGAAGTG-3′。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進行定量分析。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、5 min，變性94 ℃、30 s，SOCS1退火60 ℃、30 s(內(nèi)參GAPDH退火55 ℃、30 s)，延伸72 ℃、1 min，40個循環(huán)，72 ℃、6 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DNA條帶，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參Ct；ΔΔCt=待測樣品中目的基因ΔCt-參照樣品中目的基因ΔCt；基因相對表達量=2-ΔΔCt。

1.4 細胞內(nèi)SOCS1蛋白表達檢測 采用Western blotting法?；虺聊?8 h收集細胞，冰上加裂解液充分裂解細胞，離心收集上清液，使用BCA法測定樣品蛋白濃度，分裝成50 μg/管，加上樣緩沖液高溫變性，樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST配制的5%脫脂奶粉常溫封閉1～2 h，TBST洗膜3次后孵育一抗，SOCS1稀釋比例為1∶1 000，β-actin稀釋比例為1∶2 000，一抗4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次后孵育對應(yīng)的HRP標記的羊抗小鼠或羊抗兔二抗，稀釋比例為1∶5 000，常溫孵育2 h；TBST洗膜后暗室添加適量ECL試劑后壓片、顯影、定影，膠片掃描后蛋白條帶用Image J軟件進行灰度分析，得到各蛋白條帶灰度值。蛋白相對表達量=待測樣品中目標蛋白灰度值/參照樣品中目標蛋白灰度值。

1.5 細胞增殖率檢測 采用MTT法。分別于基因沉默后12、24、48、72、96 h收集細胞，各組均設(shè)置3個復(fù)孔，添加MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，棄MTT溶液，加DMSO后采用酶標儀于波長490 nm處測光密度值(OD值)，細胞增殖率=(實驗組OD490值-對照組OD490值)/對照組OD490值×100%。

1.6 細胞周期與凋亡檢測 采用流式細胞術(shù)。細胞周期：基因沉默后48 h，收集細胞，用-20 ℃預(yù)冷的70 %冰乙醇固定，于4 ℃冰箱過夜，冰乙醇用DEPC水配制，碘化丙啶染色0.5 h，直接上機檢測，計數(shù)各周期細胞百分比。細胞凋亡：各組細胞于轉(zhuǎn)染前8 h添加化療藥物吉西他濱，終濃度6 nmol/L，轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，加入Annexin Ⅴ及緩沖液5 μL將其制成細胞數(shù)約1×109/L懸液，避光反應(yīng)30 min，然后加入PI 10 μL流式上機檢測，計算細胞凋亡率。

1.7 細胞侵襲能力測定 采用Transwell侵襲小室試驗。轉(zhuǎn)染后48 h，取0.5 g/L Matrigel人工基質(zhì)膠20 μL均勻涂抹于孔徑為8 μm的Transwell侵襲小室微孔膜表面，37 ℃放置30 min，待其聚成凝膠狀。各組均取轉(zhuǎn)染后48 h的細胞1.0×107個分別接種于Transwell微孔膜上層，下層添加條件培養(yǎng)基0.6 mL，繼續(xù)在CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后PBS洗滌，使用棉簽輕輕抹去微孔膜表面未侵入膜的細胞，微孔膜常溫干燥0.5 h后吉姆薩染色，在顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野中穿膜細胞數(shù)，取平均值。

1.8 細胞化療敏感性檢測 采用MTT法。基因沉默后48 h收集細胞，種植于96孔板。按照分組分別添加不同濃度的卡鉑(0、5、10、20、30、40 mg/L)和吉西他濱(0、5、10、20、40、80 nmol/L)，三組各濃度均設(shè)置3個復(fù)孔，作用48 h添加MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，棄MTT溶液，加DMSO后用酶標儀于波長490 nm處測OD值，根據(jù)OD值繪制細胞生長曲線圖，采用GraphPad Prism軟件計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果

2.1 SOCS1基因沉默后細胞內(nèi)SOCS1 mRNA及蛋白表達比較 基因沉默后48 h，空白組SOCS1 mRNA及蛋白相對表達量分別為1.00±0.08、1.00±0.12，陰性對照組分別為0.94±0.11、1.05±0.16，干擾組分別為0.22±0.03、0.13±0.06；與其他兩組比較，干擾組SOCS1 mRNA及蛋白相對表達量降低(P均<0.05)。

2.2 SOCS1基因沉默對細胞增殖率的影響 三組增殖率比較見表1。

表1 三組增殖率比較

注:與干擾組同時間點比較，*P<0.05。

2.3 SOCS1基因沉默對細胞周期的影響 見表2。

表2 三組各周期細胞分布比較±s)

注:與干擾組比較，*P<0.05。

2.4 SOCS1基因沉默對吉西他濱誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響 空白組、陰性對照組、干擾組經(jīng)吉西他濱處理后凋亡率分別為(34.3±3.6)%、(32.9±4.2)%、(46.1±3.5)%，與其他兩組比較，干擾組細胞凋亡率升高(P均<0.05)。

2.5 SOCS1基因沉默對細胞侵襲能力的影響 基因沉默后24 h，空白組、陰性對照組、干擾組穿膜細胞數(shù)分別為(93±16)、(87±19)、(39±8)個，與其他兩組比較，干擾組穿膜細胞數(shù)減少(P均<0.05)。

2.6 SOCS1基因沉默對細胞化療敏感性的影響 SOCS1基因沉默后48 h，空白組對卡鉑、吉西他濱的IC50分別為(15.34±1.32)mg/L、(20.32±2.51)nmol/L，陰性對照組分別為(14.62±1.57)mg/L、(20.73±2.48)nmol/L，干擾組分別為(9.83±1.05)mg/L、(11.28±1.46)nmol/L；與其他兩組比較，干擾組對卡鉑、吉西他濱的IC50減小(P均<0.05)。

3 討論

SOCS1是細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子蛋白家族的重要成員。近年來隨著對SOCS1研究的深入，其各種功能逐漸被發(fā)現(xiàn)。SOCS1參與體內(nèi)多種免疫反應(yīng)、激素的調(diào)節(jié)以及多種腫瘤的生成和發(fā)展等，尤其是它與腫瘤的關(guān)系成為近期研究的熱點。SOCS1是固有免疫和獲得性免疫的重要生理性調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)淋巴細胞的激活、發(fā)育和分化，使人γ-干擾素等炎癥因子的分泌減少，起到炎癥抑制作用；還可通過JAK-STAT信號通路作用于T淋巴細胞、樹突細胞和單核-巨噬細胞，參與癌癥、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展。SOCS1的表達與腫瘤細胞增殖、周期及侵襲能力等的調(diào)節(jié)有關(guān)。研究報道，SOCS1過表達可通過JAK/STAT3、p53信號通路負性調(diào)控人黑色素瘤細胞的增殖活性[3]。人舌鱗癌細胞CAL27中基因SOCS1沉默后，細胞增殖能力減弱，使細胞周期阻滯在G0/G1期[7]。miR-155抑制SOCS1表達激活STAT3信號通路，阻止胰腺癌細胞轉(zhuǎn)移，并減弱其侵襲能力[8]。本研究表明，T24細胞SOCS1基因沉默后，細胞增殖能力和體外侵襲能力受到抑制；還影響細胞周期，細胞有絲分裂受到抑制，S期細胞明顯減少，G0/G1期細胞顯著增多，與上述文獻報道一致。

Zhang等[5]研究指出，miR-572過表達，下調(diào)SOCS1，使人卵巢癌細胞G0/G1期細胞明顯減少，而S期細胞顯著增多；相反，當(dāng)抑制miR-572表達時，SOCS1表達上調(diào)，人卵巢癌細胞G0/G1期細胞明顯增多變大，而S期細胞顯著減少，與本研究SOCS1沉默后增加人膀胱癌G0/G1期細胞數(shù)目及減少S、G2/M期細胞數(shù)目等結(jié)論相反，推測原因可能為SOCS1在腫瘤中的作用與腫瘤類型相關(guān)。而另有研究結(jié)果顯示，SOCS1可使人胃癌細胞周期阻滯在G2/M期，并使G0/G1期細胞數(shù)目增多[1]。SOCS1過表達顯著減弱宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，促進細胞凋亡，SOCS1表達還明顯抑制結(jié)直腸癌細胞的體外侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力[9]。與本研究中SOCS1沉默增加人膀胱癌細胞侵襲能力及增加凋亡細胞數(shù)目等結(jié)論相反，推測原因同樣是SOCS1在腫瘤中作用因細胞種類不同所致。

SOCS1高表達可影響細胞對多種細胞因子的敏感性，在IFN-γ敏感性降低的過程中可能發(fā)揮著重要作用。研究表明，人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1中SOCS1表達被抑制后，增殖能力下降，并增強細胞對IFN-γ的敏感性[4]。人舌鱗癌細胞SOCS1沉默，顯著降低化療藥物卡鉑和紫杉醇對癌細胞的IC50，提高細胞對化療藥物的敏感性[7]。本研究結(jié)果顯示，沉默T24細胞SOCS1的表達，可增加T24細胞對化療藥物卡鉑和吉西他濱的敏感性，并提高化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡率，說明干擾SOCS1表達可能成為未來人膀胱癌臨床治療和藥物干預(yù)的靶標。研究表明，SOCS1干擾顯著抑制人黑色素瘤細胞Mel526的生長，S期細胞減少，增強腫瘤細胞對γ-干擾素的敏感性，且對奧沙利鉑化療藥物的IC50值明顯變小[10]，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，人膀胱癌T24細胞SOCS1基因沉默后顯著抑制細胞的增殖和體外侵襲，并增強其對化療藥物的敏感性，提示基因SOCS1可能是影響人膀胱癌治療效果的重要靶點。SOCS1可以作為一種腫瘤標記物，來判斷腫瘤的惡性程度、分期，甚至是否有遠處轉(zhuǎn)移等。但是因為大部分腫瘤都有SOCS1的改變，故特異性較差，可只應(yīng)用于已明確診斷的腫瘤，或者用于判斷預(yù)后。目前，SOCS1在腫瘤治療方面雖初見成效，但仍需要通過大量的動物實驗和臨床研究來證實SOCS1在腫瘤治療方面的機制和作用。

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Effects of silencing SOCS1 gene on proliferation, invasion and chemosensitivity of human bladder cancer T24 cells

YANJun,ZHUXiaojun,SIQinbuhe,WANGGuoqiang,CHENLigang,HUANGYong

(TheAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,China)

Objective To investigate the effects of suppressor of cytokine signaling-1 (SOCS1) gene silencing on cell proliferation, invasion and chemotherapeutic drugs sensitivity of human bladder cancer cells.Methods Human bladder cancer cell line T24 cells were randomly divided into three groups: the interference group (which was transfected by recombinant plasmid pU-SOCS1-siRNA), control group (which was transfected by negative control plasmid) and blank group without any treatment. RT-PCR and Western blotting were used to detect the SOCS1 mRNA and protein expression in human bladder cancer cell line (T24) after transfection. The cell proliferation rate was detected by MTT assay, flow cytometry was used to detect the cell cycle and cell apoptosis rate; the invasive ability of T24 cells in vitro was evaluated by Transwell migration assay and the change of chemosensitivity was determined by MTT. Results Compared with the other groups, after silencing SOCS1 in the interference group, the expression levels of SOCS1 mRNA and protein were significantly decreased (allP<0.05), and the cell proliferation rate was decreased significantly (allP<0.05); the cells at the G0/G1phase increased, but the cells in S phase and G2/M decreased (allP<0.05); the cell apoptosis rate of gemcitabine-induced T24 cells significantly increased after SOCS1 gene silencing (P<0.05) and the invasive ability of T24 cells in vitro was decreased (allP<0.05); and the sensibility to chemotherapeutic drugs (carboplatin and gemcitabine) increased significantly (allP<0.05). Conclusion After SOCS1 gene silencing, the proliferation ability and invasion ability in vitro of human bladder cancer cell line T24 decrease and the sensitivity of T24 cells to chemotherapeutic drugs increases.

human bladder neoplasms; suppressor of cytokine signaling protein 1; gene silencing; cell proliferation; cell invasion; chemosensitivity

R737.14

A

1002-266X(2016)37-0021-04

閆駿(1972-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要研究方向為泌尿系統(tǒng)腫瘤。E-mail：147206358@qq.com

簡介：黃勇(1970-)，男，主任醫(yī)師，碩士，主要研究方向為泌尿系統(tǒng)腫瘤。E-mail:swjs231@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.007

2016-03-13)