茶樹良種場不同品種的SSR鑒定研究

姜燕華，張成才，成 浩*

(1.寧波市寧?？h農林局，浙江 寧波 315600；2.中國農業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008)

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茶樹良種場不同品種的SSR鑒定研究

姜燕華1，張成才2，成 浩2*

(1.寧波市寧?？h農林局，浙江 寧波 315600；2.中國農業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008)

以寧?？h橋頭胡鎮(zhèn)汶溪茶葉良種場的15個茶樹品種的葉片為試驗材料，每個待鑒定品種隨機選擇3～4個單株作為待測樣本，以國家茶樹種質資源圃品種作為標準品種，采用SSR技術檢測待測品種與檔案記載情況是否相符。試驗結果表明：通過21對SSR引物的PCR擴增，良種場中的‘龍井43’、‘安吉白茶’和‘迎霜’的SSR標記數與其對應的標準品種完全一致，說明這3個品種保持原品種的特征特性；‘歌樂茶’、‘勁峰’和‘平陽特早’3個品種部分樣本的標記數與其對應的標準品種一致，說明這3個品種中的部分單株出現某種程度的變異；‘早逢春’、‘碧云’、‘竹紫春’、‘烏牛早’、‘水谷茶’和‘福鼎大白茶’6個品種的標記數與其對應的標準品種出現不一致，說明這6個品種在良種場繁育過程中出現同名異物或同物異名的錯誤；良種場中的‘銀片’、‘鳩坑種’和‘紫筍’無法確定其是否屬于相應的標準品種，說明在良種收集過程中，無法弄清品種的來源。通過本研究糾正了品種收集過程中出現的錯誤，指出了品種繁育過程中出現的突變。

茶樹；SSR；品種鑒定；無性系

茶樹是重要的經濟作物，在我國的種植栽培歷史悠久。19世紀以前，我國的茶產業(yè)一直處于世界領先地位，而后逐漸衰落，直到新中國成立之后才進入蓬勃發(fā)展的時期。近50年來，我國茶產業(yè)的發(fā)展基本可以分為3個階段：擴大種植面積階段(1950～1978年)、提高單產階段(1979～1989年)和提高質量階段(1990年至今)[1]。在第一階段中，我國的茶園面積成倍增加，各地開辟了大量的新茶園。其中，一部分為生產茶園；另一部分為茶樹良種場，陸續(xù)引種有不同的茶樹良種，為一定區(qū)域內的茶園提供種苗保障。長期以來，一些當時成立的茶樹良種場，由于人員流動和疏于管理，已經失去了作為良種場的功能，轉而成為生產茶園，造成了資源的浪費。如何對這些良種場進行評價，特別是如何對其所種茶樹良種進行鑒別，以考察其是否具有恢復茶樹良種場功能的潛質，成為一個亟待解決的問題。

近年來，隨著生物技術的發(fā)展，分子標記技術已被廣泛應用于小麥[2-3]、水稻[4]、玉米[5-7]、茶葉[8-13]等多種作物研究，尤其是在遺傳多樣性、親緣關系、品種鑒別領域使用最多。其中，簡單重復序列標記(SSR，simple sequence repeats)，由于檢測方便、鑒別能力高，成為最好的品種鑒別方法之一[5,14]。在茶樹品種鑒別方面，楊陽等使用SSR標記、劉本英等使用ISSR(inter simple sequence repeats)標記，分別構建了湖南省和云南省主要茶樹品種的指紋圖譜，為這些茶樹品種的鑒別提供了依據[15-16]。張成才等使用SSR標記對浙江省主要無性系茶樹品種的鑒定進行了研究，并且提出了相應的鑒定標準[17]。

寧?？h橋頭胡汶溪茶葉良種場位于寧波市寧海縣橋頭胡鎮(zhèn)，始建于1974年，陸續(xù)引種有‘勁峰’、‘迎霜’、‘烏牛早’等10余個茶樹良種，直至20世紀90年代初達到如今的規(guī)模。多年來，該良種場由于人員流動、檔案不全，一直沒能得到很好地利用。為了確定該良種場所種茶樹品種與部分檔案記載是否一致，藉此評估其對當前寧?？h茶葉生產、種苗繁育等方面的潛在意義，本實驗使用SSR標記的方法，根據部分檔案推測的品種名稱，對該良種場種植的15個茶樹品種進行驗證。

1 材料和方法

1.1 取樣

‘勁峰’、‘迎霜’、‘烏牛早’等15個待鑒定品種，每個品種分別從茶行中隨機選3～4個單株共59個單株，取葉片作為待鑒定樣品(表1)。

從茶樹國家種質資源圃中，取與待鑒定材料相應的各品種1芽2葉嫩梢，作為品種鑒定的標準樣。資源圃沒有保存‘銀片’品種，因此沒有取到該品種的標準樣；資源圃沒有保存‘水谷茶’品種，保存有‘水古茶’，因此采‘水古茶’為標準樣(表1)。

表1 供試材料信息

1.2 基因組DNA的提取及PCR擴增

采樣后，將樣品迅速放于液氮中冷凍，使用天根生化科技有限公司(DP305)的植物基因組DNA試劑盒提取各份材料的基因組DNA。檢測濃度后，稀釋到20 ng·μL-1保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增使用10 μL反應體系，包括DNA模板2 μL，上下游引物各0.2 μL，Taq酶0.2 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP 0.5 μL，加ddH2O至10 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性4 min，94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3 電泳檢測及數據處理

使用10%聚丙烯酰胺凝膠，在120 V的電壓下電泳90 min，銀染顯色[18-19]。顯色后，人工讀帶，條帶由大到小分別記為A、B、C、D等，無條帶或者帶型難以辨認記為“..”，在Excel中進行數據處理，使用Popgen32軟件構建遺傳聚類圖。

1.4 品種判定標準

本試驗，參考水稻[20]和茶樹[17]品種鑒定方法對樣品品種進行判定：①某一單株與標準品種差異標記數=0，則判定該單株屬于這一品種；②某一單株與標準品種差異標記數=1，則判定該單株疑似屬于這一品種；③某一單株與標準品種差異標記數≥2，則判定該單株不屬于這一品種。

2 結果與分析

本研究使用實驗室前期篩選過的多態(tài)性高、帶型清晰的21對SSR引物(表2)，分別對15個待鑒定品種的59個單株和14個標準樣進行PCR擴增。然后，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物，銀染顯色(圖1)。人工讀帶并構建帶型模擬圖(圖2)，然后使用Popgen32軟件構建遺傳聚類圖(圖3)。差異標記數統(tǒng)計結果見表3，檢測結果匯總見表4。

表2 21對引物信息

待鑒定品種‘安吉白茶’(AJBC)，4個樣本相互之間的帶型完全一致，而且與標準樣品完全一致，因此認為這4個樣本所代表的群體為無性系群體，并且屬于‘安吉白茶’品種；同樣地，待鑒定品種‘龍井43’(LJ43)，4個樣本相互間帶型一致，且與標準樣品一致，認為這4個樣本所代表的群體為‘龍井43’的無性系群體。待鑒定品種‘迎霜’(YS)，4個樣本間帶型一致，同時與標準樣品帶型一致，認為這4個樣本所代表的群體為‘迎霜’的無性系群體。

圖1 引物5077部分樣品譜帶Fig.1 SSR fingerprints of samples using primer 5077

圖2 21個SSR標記在待定品種及標準品種中的帶型模擬圖Fig.2 Simulating diagrams of 21 SSR markers on farm collection and standard varieties注：左側第一列為待鑒定品種編號，每個編號對應的一行為該品種4個樣本和標準樣品的帶型；圖頂部的一行數字為SSR標記引物編號，每個編號所對應的列，為這個標記在每個樣本中的帶型。Note: Codes on left column are cultivars to be identified, corresponding row for each code shows banding patterns of 4 samples of each cultivars and its reference standard; numbers on top of diagram indicate SSR markers, each column underneath shows marker banding patterns for each corresponding sample.

待鑒定品種‘歌樂茶’(GL)，4個樣本中GL3和GL4帶型一致且與標準樣品帶型一致，與GL1有1個標記存在差異，與GL2有2個標記存在差異，聚類結果發(fā)現以上4個樣本與標準樣品一起聚為一類。以上結果表明，這4個樣本所代表的群體為無性系群體，其中混雜有親緣關系較近的單株，該群體屬于‘歌樂茶’品種。

待鑒定品種‘勁峰’(JF)，4個樣本中JF3和JF4與標準樣品帶型完全一致，JF2與標準樣品有2個標記差異，而JF1與標準樣品差異標記數為13個。因此JF3和JF4為‘勁峰’；而JF1和 JF2不屬于‘勁峰’品種，而且聚類分析結果表明，JF1與其他3個樣本以及標準樣品間的親緣關系較遠，JF2與JF3、JF4和標準樣品聚為一類。以上結果表明，這4個樣本所代表的群體為‘勁峰’的無性系群體，但是群體里面混雜有親緣關系較遠的單株。

待鑒定品種‘平陽特早’(PYTZ)，4個樣本中，PYTZ1、PYTZ2和PYTZ4之間的帶型一致，且與標準樣品存在1個標記的差異；PYTZ3與其他3個樣本存在2個標記的差異，與標準樣品存在3個標記的差異，聚類分析發(fā)現PYTZ3與其他3個樣本以及標準樣品的親緣關系較近。因此認為PYTZ1、PYTZ2和PYTZ4疑似屬于‘平陽特早’品種；PYTZ3不屬于‘平陽特早’品種。以上結果表明，這4個樣本所代表的群體，疑似屬于‘平陽特早’品種的無性系群體，但其中混雜有親緣關系較近的單株。

表3 15個待鑒定品種的59個單株與標準樣品差異標記數統(tǒng)計

待鑒定品種‘早逢春’(ZFC)，4個樣本中，ZFC2和ZFC3之間的帶型一致，但與標準樣品存在13個標記的差異；ZFC1與以上兩個樣本存在9個標記的差異，與ZFC4存在7個標記的差異，與標準樣本存在12個標記的差異；ZFC4與ZFC2和ZFC3之間存在8個標記的差異，與標準樣品存在13個標記的差異；聚類分析發(fā)現4個樣本聚為一類，但與標準樣品親緣關系較遠。以上結果表明，這4個樣本所代表的群體為無性系群體但不屬于‘早逢春’，而且其中混雜了親緣關系較近的單株。

待鑒定品種‘碧云’(BY)，4個樣本中，BY3和BY4帶型一致，與BY2存在1個標記的差異，與BY1存在7個標記的差異；4個樣本與標準樣品存在5～9個標記的差異；聚類分析發(fā)現，4個樣本與標準樣品一起聚為一類。以上結果表明，這4個樣本所代表的群體，為無性系群體，該群體里面混雜有親緣關系較近的單株，該群體與‘碧云’品種親緣關系較近，但是不屬于‘碧云’品種。

待鑒定品種‘水谷茶’(SG)，4個樣本中SG2和SG3帶型一致，與SG1和SG4均存在1個標記的差異；SG1和SG4間存在2個標記的差異；4個樣本與標準樣品‘水古茶’存在13～14個標記的差異，聚類分析發(fā)現4個樣本與標準樣品‘水古茶’親緣關系較遠。以上結果表明，這4個樣本所代表的群體屬于無性系，但是與標準樣品‘水古茶’并非一個品種。

待鑒定品種‘竹紫春’(ZZC)，4個樣本中ZZC1和ZZC3帶型一致，與ZZC2存在一個標記的差異，與ZZC4存在10個標記的差異；ZZC2和ZZC4存在11個標記的差異；4個樣本與標準樣品存在10～14個標記的差異；聚類分析發(fā)現ZZC1、ZZC2和ZZC3聚為一類，ZZC4和標準樣品均與它們的遺傳關系較遠。以上結果表明，這4個樣本所代表的群體，為無性系群體，但混雜有親緣關系較遠的個體，而且該群體不屬于‘竹紫春’品種。

待鑒定品種‘烏牛早’，3個樣本中WNZ1和WNZ2有2個標記存在差異，與WNZ3存在5個標記的差異；WNZ2和WNZ3存在6個標記的差異；3個樣本與標準樣品有11～13個標記存在差異；聚類分析發(fā)現3個樣本聚為一類，但與標準樣品親緣關系較遠。以上結果表明，這3個樣本所代表的群體可能屬于無性系群體，但其中混雜有親緣關系較近的單株，而且該群體并非‘烏牛早’品種。

待鑒定品種‘銀片’(YP)，4個樣本中YP1、YP2和YP4帶型完全一致，與YP3存在1個標記的差異。由此，認為這4個樣本所代表的是一個無性系群體，但由于本試驗沒有‘銀片’標準樣品，不能確定該群體是否屬于‘銀片’品種。

待鑒定品種‘紫筍’(ZS)，4個樣本中ZS1、ZS2和ZS4間的帶型一致，與ZS3存在1個標記的差異，與標準樣品存在7個標記的差異，聚類分析發(fā)現4個樣本均與標準樣品‘紫筍群體’(群體種)聚為一類。結果表明，這4個樣本所代表的群體為無性系群體，該群體可能由紫筍群體種中的某一單株擴繁而成，因而與標準品種親緣關系較近，根據本實驗結果難以確定該待測品種為‘紫筍群體’品種。

待鑒定品種‘福鼎大白’(FDDB)，4個樣本相互之間的差異標記數為14～17個，與標準樣品的差異標記數為9～15個，聚類分析發(fā)現FDDB2與標準樣品聚為一類，而其余樣本散見于聚類圖中。結果表明，這4個樣本所代表的群體為群體種，由于群體種遺傳背景復雜，因此無法根據SSR標記確定這4個樣本是否屬于‘福鼎大白’。同樣類似的還有待鑒定品種‘鳩坑’(JK)，4個樣本間差異標記數為10～15個，與標準樣品存在13～14個標記的差異，聚類分析發(fā)現，4個樣本聚為一類，因此認為此4個樣本所代表的群體為群體種，但無法確定這4個樣本是否屬于‘鳩坑群體種’。

圖3 使用popgen32軟件構建的遺傳聚類圖。Fig.3 Cluster diagrams of cultivars constructed using Popgen 32 software based on data of 21 SSR loci注：紅色圓圈表示標準樣品位置。Note: Red dots represent standard varieties.

表4 驗證結果匯總

3 討論

本試驗在取樣過程中發(fā)現，部分茶樹品種混雜有表型明顯不一致的單株，結果也表明，部分品種的確存在雜株。在茶樹種苗繁育過程中，良種場通常作為母本園，為種苗繁育提供扦插穗條。茶樹繁殖系數大，這些雜株會同真實品種一起大量擴繁，經銷售流入生產茶園，導致茶樹間存在性狀差異，最終影響茶葉產量和品質。近年來，本實驗室在多地取樣的過程中，發(fā)現有些品種存在名稱與事實不符的情況，給生產者和研究者帶來了很大的困擾。因此，在建立良種場的過程中，對新引種的品種一定要嚴格篩查，首先要保證該品種確為目標品種，然后要剔除那些非目標品種的單株，保證所種植品種的真實性和純度，從源頭上保證擴繁后的茶苗性狀一致。

研究發(fā)現，‘龍井43’、‘安吉白茶’、‘歌樂茶’、‘迎霜’、‘勁峰’和‘平陽特早’等6個待鑒定品種與檔案記載的標準樣品一致，然而‘歌樂茶’、‘勁峰’和‘平陽特早’3個品種中混雜有其他品種單株。‘早逢春’、‘碧云’、‘竹紫春’、‘烏牛早’和‘福鼎大白茶’等5個待鑒定品種，與檔案記載的標準樣品不一致，并非檔案所述品種。待鑒定品種‘水谷茶’的4個樣本均非‘水古茶’。另外，待鑒定品種‘銀片’沒有取到相應的標準樣品，因此不能確定其4個樣本是否屬于‘銀片’品種。

本研究中部分待測品種與標準樣品存在遺傳上的差異，但在聚類時卻聚在一起，表明其親緣關系較近，推測這些混雜的單株可能是相應標準品種的有性后代(如本試驗中‘紫筍’品種)，或其品種繁殖來源于相近或同一品種。如本研究中‘碧云’品種，它是由云南大葉種天然雜種中單株選育而成。云南大葉種是茶樹育種中常用的材料，通過其育種出的后代具有相似的遺傳背景，因此在進行遺傳聚類分析時這些后代往往聚在一起。目前，我國國家級茶樹良種中，除了無性系品種，還包括‘鳩坑種’、‘祁門種’、‘龍井種’和‘紫陽種’等多個有性系品種，這些品種經自然雜交的種子擴繁而成，遺傳背景非常復雜[21]。因此，很難根據SSR標記的差異數對個別單株進行比較準確的鑒定。本研究中，4個鳩坑種的樣本聚為一類，然而與其標準樣品的遺傳關系較遠，由于其遺傳背景復雜，盡管遺傳關系較遠，仍很難明確的得出待鑒定品種是否屬于‘鳩坑種’的結論。另外，本研究中取‘紫筍群體’(群體種)作為待鑒定品種‘紫筍’的標準樣，4個樣本ZS1、ZS2和ZS4間的帶型一致，ZS3存在1個標記的差異，由此推測該品種可能為無性系品種，然而聚類分析發(fā)現，4個待鑒定樣本與標準樣聚為一類，因此無法明確認定待鑒定品種‘紫筍’是否屬于‘紫筍群體’。以上結果表明，有性系品種的鑒定方法，仍然需要進一步探索。

本研究使用SSR的方法，對寧?？h橋頭胡汶溪茶葉良種場的15個茶樹品種與檔案記載是否一致進行了研究，糾正品種收集過程中出現的錯誤，為該良種場茶樹資源的充分利用提供了理論依據，也為其他類似研究提供借鑒。然而，本次試驗每個待鑒定品種僅隨機選擇了3～4個單株作為樣本，而且并未開展形態(tài)學方面的調查研究，由于茶園部分品種混雜度較高，導致很難做到比較全面的評價。

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SSR Cultivar Identifications of Premium Teas

JIANG Yan-hua1, ZHANG Cheng-cai2, CHENG Hao2*

(1.AgriculturalandForestryBureauofNinghaiCounty,NingboZhejiang315600,China; 2.Tearesearchinstitute,ChineseAcademyofAgricultureSciences/NationalCenterforTeaImprovement,HangzhouZhejiang310008,China)

SSR was applied to determine the authenticity of 15 tea cultivars at a farm for preserving premium tea plants. The leaves from 3 to 4 individual plants of each cultivar were randomly collected for the test to compare with those from the respective standard varieties preserved at the China National Germplasm Tea Repository in Hangzhou. Twenty SSR markers were selected for the analysis and comparison. It was found that Longjing 43, Anjibaicha, and Yingshuang teas, as well as a few Gelecha, Jinfeng, and Pingyang Tezao plants, were genetically identical with the

tandards, and 6 cultivars of Zaofengchun, Biyun, Zhuzichun, Wuniuzao, Shuigucha, and Fuding Dabaicha deviated from the standards, while the identifications for Yinpian, Jiukengzhong, and Zisun could not be determined. The deviations suggested possible errors in cultivar collection, mislabeling, and/or mutation occurred during cultivation of the cultivars at the farm. The results provided the basic information for a full and accurate utilization of the collected germplasms in the repository farm. They also indicated that the genotypes and cluster diagram obtained from the SSR method could adequately be used to preliminarily identify the clonal tea cultivars. For the sexual variety, however, further study is required.

tea; SSR; cultivar identification; clonal

2016-07-01 初稿；2016-08-11 修改稿

寧波市林業(yè)科技項目(2014L02)。

姜燕華(1984-)，女，農藝師，研究方向：茶樹種質資源與遺傳育種。

*通訊作者：成浩(1962-)，男，研究員，研究方向：茶樹種質資源與遺傳育種。E-mail:chenghao@mail.tricaas.com

S571.1；Q311

A

2096-0220(2016)03-0105-08