43例食管癌患者不同部位DNA聚合酶β基因檢測臨床分析

許興和，曹 娟，寧召鋒

(泰安市腫瘤醫(yī)院，山東 泰安 271000)

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43例食管癌患者不同部位DNA聚合酶β基因檢測臨床分析

許興和，曹 娟，寧召鋒

(泰安市腫瘤醫(yī)院，山東 泰安 271000)

目的 比較觀察食管癌患者不同分化程度癌組織、癌旁組織及正常食管黏膜組織中DNA聚合酶的表達(dá)差異。方法 采用RT-PCR檢測方法對臨床確診并手術(shù)病理證實(shí)的43例食管癌患者進(jìn)行癌組織、癌旁組織及正常食管黏膜組織進(jìn)行polβ mRNA定量分析。結(jié)果 不同分化程度癌組織之間及癌旁組織中polβ mRNA表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，而正常食管黏膜組織中polβ mRNA表達(dá)水平均低于癌組織及癌旁組織(P均<0.05)。結(jié)論 食管癌中存在polβ基因啟動(dòng)子突變現(xiàn)象，且隨距瘤體距離變化，polβ表達(dá)可能存在梯度差異。

食管癌；DNA聚合酶β；基因檢測；RT-PCR

DNA聚合酶(DNA polβ)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要的堿基切除修復(fù)酶，參與DNA損傷的修復(fù)，在體內(nèi)正常情況下呈低表達(dá)，polβ異常表達(dá)的細(xì)胞顯示堿基切除修復(fù)功能的缺乏及增加對堿基損傷物質(zhì)的敏感性，也會(huì)增加抑癌基因、原癌基因等其他與控制生長有關(guān)的重要基因的突變頻率，從而使腫瘤的發(fā)生概率升高。在人類前列腺癌、膀胱癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌及結(jié)直腸癌中都有DNA polβ基因突變[1]。食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，趙國強(qiáng)等[2]報(bào)道食管癌高發(fā)區(qū)河南省林州市食管癌組織中polβ基因突變情況，并報(bào)道突變率為36%。本課題組分析研究我院43例手術(shù)患者polβ基因突變情況，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取我院2012年3月至2014年6月收治并確診的食管癌患者43例，均經(jīng)手術(shù)治療，其中男29例，女14例；術(shù)后病理示高分化癌5例，中分化鱗癌22例，低分化鱗癌16例。組織選取癌組織、腫瘤邊緣0.5 cm內(nèi)組織、腫瘤切緣部分組織(正常食管黏膜組織)，腫瘤切緣嚴(yán)格按照腫瘤切除原則距腫瘤邊緣>5 cm，且術(shù)后病理證實(shí)切緣陰性。組織切除標(biāo)本離體后15 min內(nèi)放入液氮中保存，標(biāo)本均經(jīng)山東省泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理室檢驗(yàn)證實(shí)。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol試劑(德國QI-AGEN公司)；β-actin引物(上海寶萊生物科技技術(shù)有限公司)；PCR儀(德國Peqlab公司)；AMV、Taq酶、dNTP(美國Promega公司)；PCR引物(北京索萊寶科技有限公司)；PCR Marker(DL2000)(上海凱斯泰爾生物科技有限公司)；凝膠自動(dòng)成像儀、水浴式電轉(zhuǎn)印槽、電泳儀(美國Bio-Rad公司)；高速臺式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器廠家)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏有限公司)；穩(wěn)壓恒流電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 檢測方法 polβ mRNA檢測：1)總RNA的提取: 術(shù)中取得的新鮮病理組織,加液氮研碎,用總RNA提取試劑盒提取總RNA，將其溶于滅菌純水中,用紫外分光分度計(jì)測定所取總RNA的濃度、純度，瓊脂糖電泳觀察完整性；2)RT-PCR:AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下完成逆轉(zhuǎn)錄，詳細(xì)過程參考文獻(xiàn)[3-4]；3)產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE)分析,以目的基因/β-actin積分灰度值作為目的基因mRNA的相對表達(dá)量，根據(jù)正常黏膜表達(dá)水平推斷若該比值>0.446 9為高表達(dá)，反之為低表達(dá)。合成引物的序列及PCR產(chǎn)物片段長度見表1。

表1 合成引物的序列及PCR產(chǎn)物片段長度

2 結(jié)果

采用RT-PCR檢測方法對43例食管癌患者進(jìn)行癌組織、癌旁組織及正常食管黏膜組織進(jìn)行polβ mRNA定量分析，結(jié)果顯示，不同分化程度癌組織之間及癌旁組織中polβ mRNA表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P均>0.05)，而正常食管黏膜組織中polβ mRNA表達(dá)水平均低于癌組織及癌旁組織(P均<0.05)。見表2，圖1、2。

表2 不同組織中polβ mRNA表達(dá)情況

圖1 不同組織中polβ mRNA表達(dá)情況

圖2 不同分化程度癌組織中polβ mRNA表達(dá)情況

3 討論

我國是食管癌高發(fā)國家，全世界約50%的病例發(fā)生在中國，在我國，食管癌的死亡高居第4位，占全部惡性腫瘤死亡的16.05%，且發(fā)病率逐年上升[5-6]。

文獻(xiàn)研究[2,7-9]發(fā)現(xiàn)，食管癌的發(fā)生是多因素、多階段的復(fù)雜過程，在外界因素的持續(xù)影響刺激下，多種有害或有益的突變的相互作用達(dá)到機(jī)體損傷、修復(fù)的閾值時(shí)，將導(dǎo)致癌變發(fā)生。DNA polβ是一種DNA修復(fù)酶，廣泛存在于細(xì)胞核內(nèi)，是堿基切除修復(fù)系統(tǒng)中的核心成分，參與對DNA輻射損傷或化學(xué)損傷的修復(fù)合成，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制保真度最低、最不精確的DNA聚合酶[10-12]。Jelezcova等[13]及Goellner等[14]各自團(tuán)隊(duì)研究指出高表達(dá)的polβ可能參與了腫瘤細(xì)胞的增殖并同時(shí)導(dǎo)致對一些抗腫瘤藥物及射線的耐受。

鑒于大量關(guān)于polβ的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的起始、演進(jìn)，并在腫瘤細(xì)胞耐藥中可能發(fā)揮作用的報(bào)道，本文研究了polβ在食管組織中的表達(dá)情況，對比分析polβ在食管病變各階段的水平，以期尋找差異，為食管癌早診、早治提供參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，polβ在癌組織、癌旁組織中的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但明顯高于正常食管黏膜組織(P均<0.05)。分析原因可能是：癌旁組織光鏡下未見明顯病理學(xué)改變卻已存在分子基因水平的改變，其早于臨床病理學(xué)出現(xiàn)，因而不能視為正常組織。提示polβ基因啟動(dòng)變異極有可能發(fā)生在食管癌癌變之前。這一區(qū)域是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)，可能為潛在癌變區(qū)，這些組織可能是造成惡性腫瘤局部復(fù)發(fā)的重要原因，意味著現(xiàn)行腫瘤切除邊緣安全標(biāo)準(zhǔn)是否需進(jìn)一步考證。趙四敏等[1]研究發(fā)現(xiàn)，食管不典型增生組織內(nèi)已存在polβ突變，與癌組織及癌旁組織基本類同，但與正常食管黏膜組織存在顯著差異，因本組所納入患者未發(fā)現(xiàn)不典型增生存在，因而未行相關(guān)對比，但實(shí)際臨床發(fā)現(xiàn)眾多存在不典型增生的患者隨訪未出現(xiàn)癌變，其內(nèi)可能存在更細(xì)微的差異，后續(xù)還需進(jìn)一步深入研究，為不典型增生演化進(jìn)展為食管癌提供參考指標(biāo)。

總之，食管癌中存在polβ基因啟動(dòng)子突變現(xiàn)象，且隨距瘤體距離變化，polβ表達(dá)可能存在梯度差異。

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許興和(1976-)，男，主治醫(yī)師，主要從事食管癌的臨床診斷與治療工作。E-mail：33756916@qq.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.05.023

R735.1

B

1673-5412(2016)05-0442-03

2016-01-22)