不同耐濕性長豇豆開花結(jié)莢期和苗期葉片全蛋白電泳分析

， ， (江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430056)

不同耐濕性長豇豆開花結(jié)莢期和苗期葉片全蛋白電泳分析

胡志輝，杜振海，陳禪友
(江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430056)

采用改進(jìn)的低溫液氮樣品制備技術(shù)，運(yùn)用SDS-PAGE方法對24個不同耐濕性基因型豇豆在開花結(jié)莢期和苗期做葉片全蛋白電泳圖譜分析。根據(jù)兩個時期各參試品種的亞基信息分別進(jìn)行聚類分析，獲得了2個系統(tǒng)聚類樹。結(jié)果表明：在開花結(jié)莢期受濕澇害后，24個不同耐濕性的長豇豆品種葉片蛋白質(zhì)亞基分布存在著明顯差異。其聚類成4個品種群，中等耐濕的16個品種在0.40距離處首先聚為一類，對濕澇極敏感的美國地豆獨(dú)成一簇且在最大距離0.81處才與其余23個品種最終聚為一類。在開花結(jié)莢期和苗期兩個時期間，長豇豆品種葉片蛋白質(zhì)亞基分布差異很大，而同一時期內(nèi)差異較小，12個品種的聚類樹明顯依兩個時期聚為不同的簇，在0.39距離處苗期所有品種聚為一簇，而在0.63距離處開花結(jié)莢期所有品種聚為另一簇，兩簇在0.75距離時聚為一類。說明長豇豆植株蛋白質(zhì)表達(dá)的時序性差異大于基因型差異，因此不同時期鑒定可能會得出不一致的結(jié)論。苗期葉片蛋白質(zhì)類型豐富，是植物生長發(fā)育最活躍而復(fù)雜的時期，故選擇苗期鑒定具有鑒定方便和信息豐富等優(yōu)勢。

豇豆基因型； 苗期； 結(jié)莢期； 耐濕性； 葉片全蛋白； SDS-PAGE

total leaf proteins; SDS-PAGE

在世界許多地方，如中國、日本、印度、巴基斯坦、澳大利亞等國家及濕潤地區(qū)和半干旱地區(qū)，濕澇危害嚴(yán)重威脅著農(nóng)作物的生產(chǎn)，影響高產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)，成為廣泛關(guān)注的嚴(yán)重問題。迄今，國內(nèi)外學(xué)者已就不結(jié)球白菜、芝麻、大豆、黃瓜、玉米等作物濕害的癥狀、鑒定方法及濕害的機(jī)理、耐濕性資源的篩選及耐濕的遺傳改良等方面問題做了大量的研究[1-6]。

表1 供試品種信息和葉片全蛋白顯帶數(shù)

編號名稱 來源 主要性狀特征 耐濕性 顯帶數(shù)結(jié)莢期苗期1鄂豇豆二號江漢大學(xué)極早熟、蔓生、淺綠莢高抗17292美國地豆引自美國中熟、矮生、淺綠莢極敏感11313五號豇豆湖北武漢早熟、蔓生、淺綠莢中抗20234白胖子四川渠縣白花、白綠莢、黑籽敏感12215香港粉豆引自英國淺紫花、細(xì)長條莢高抗15306之豇19浙江杭州早熟、蔓生、淺綠莢低抗17307開魯線豆內(nèi)蒙古開魯中熟、蔓生、綠莢細(xì)長極敏感15348象牙白河北青縣綠莢、土紅籽極敏感15319長白豇豆四川漢源淺黃花、淺綠莢極敏感133410之豇28浙江杭州中熟、蔓生、淺綠莢中抗183211菲律賓?7引自菲律賓半蔓生、白花、深綠莢中抗123212矮虎江漢大學(xué)早熟、矮生、淺綠莢中抗193213泰國豇豆引自泰國淺藍(lán)紫花、細(xì)長條莢高抗1814特長青條901廣東澄海中熟、蔓生、淺綠莢中抗2015皖青512安徽界首蔓生、綠莢細(xì)長中抗2016壓草豆海南瓊海紅花、綠莢、籽肉紅色中抗2017銀雁江漢大學(xué)早熟、蔓生、白綠莢中抗2118牛角彎湖北武漢中熟、綠莢中抗2119柳翠江漢大學(xué)蔓生、淺綠莢、莢細(xì)長中抗2320長青豇豆引自孟加拉國深綠莢、褐籽中抗2121港頭占陽福建福清黃綠莢、茶褐色籽敏感2122花皮湖北鄂州紅綠莢、紅褐籽中抗1823杜豇湖北仙桃蔓生、白綠莢、紫紅籽敏感1824湛江七葉籽廣東湛江蔓生、綠莢、莢細(xì)長敏感18

豇豆(VignaunguiculataLinn.) 為豆科(Leguminosae)豇豆屬(Vigna)植物，可攀緣生長，是耐熱耐旱的一年生作物[7]。我國南方地區(qū)夏季降雨量較大，長豇豆生長季節(jié)，常出現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其生理需水量的情況，極易造成濕害，最終導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。前人從形態(tài)學(xué)和生理學(xué)等角度進(jìn)行過豇豆品種耐濕特征的描述[8-10]，Sangakkara等[11]研究了土壤水分和鉀肥對綠豆和豇豆幼苗生長的影響；Timsina等[12-13]研究了淹水處理下豇豆品種的植株水分關(guān)系與生長，以及早熟性與淹水程度的互作效應(yīng)。Ogbonnaya等[14]則通過水培、盆栽和田間試驗，證明不同基因型耐旱性有差異，基因型方差占表型總方差的比例高，因而對豇豆耐旱性基因型篩選是可行的。陳禪友等[15]對60份豇豆品種耐鹽性能進(jìn)行了評判，長豇豆品種耐濕性的鑒定和篩選尚缺乏研究，對具遺傳差異耐濕性的豇豆基因型受脅迫后其遺傳表達(dá)物——蛋白質(zhì)的變化等也缺乏研究，影響品種利用工作，有必要研究不同基因型的耐濕性。聚丙烯酰胺凝膠電泳方法常用來分析鑒別植物遺傳表達(dá)物的差異。豇豆葉片全蛋白在正?；驖駶趁{迫后表達(dá)產(chǎn)物的變化可能反映出不同豇豆品種的遺傳基因功能組差異，暗示著品種耐濕能力的差別。本研究觀測了田間自然鑒定結(jié)果并開展室內(nèi)苗期實驗，對豇豆開花結(jié)莢期和苗期葉片全蛋白電泳圖譜的亞基分布和位點(diǎn)進(jìn)行分析，比較不同耐濕性豇豆基因型和不同時期在蛋白質(zhì)表達(dá)上的差異，以揭示豇豆耐濕性遺傳多樣性，并為耐濕豇豆資源判別和新品種選育提供依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

實驗以24個長豇豆品種(見表1)為材料。

注：M為Marker，序號1～24表示編號1～24的豇豆品種(見表1)。圖1 24個不同耐濕性基因型豇豆開花結(jié)莢期葉片全蛋白電泳圖譜

1.2 試劑配制

實驗試劑盡量選用高標(biāo)準(zhǔn)的國產(chǎn)或進(jìn)口化學(xué)藥品，按照常規(guī)方法配置。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(Marker)來自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所。

1.3 取 樣

1) 開花結(jié)莢期田間取樣。調(diào)查地點(diǎn)在武漢市什湖農(nóng)場，該地塊排水性較差，土質(zhì)為粘壤土(粉質(zhì)粘土)，地經(jīng)過翻耕后蓋上薄膜。用地面積為700 m2，共播種56個品種，每個品種約10 m2。開長約50 cm，深約15 cm的播種行，根據(jù)種子量和試驗田的具體情況進(jìn)行播種。畦植2行，每隔20 cm播1窩，每窩3～4粒種子。2015年5月7日播種，6月17日武漢市普降暴雨到大暴雨，試驗地平均降雨量為115 mm，造成嚴(yán)重積水，形成了對長豇豆品種的濕害，此時正值開花結(jié)莢期。分別于6月29日和7月6日分2次調(diào)查各品種30株豇豆的濕害受害情況。植株的濕澇害的抗性水平分為5級，高抗：無病植株；中抗：0.1%～25%葉片發(fā)病的植株；低抗：25%～50%葉片發(fā)病的植株；敏感：50%～75%葉片發(fā)病的植株；極敏感：75%以上葉片發(fā)病的植株。從中選用24個不同耐濕性基因型(表1)作為試驗材料。并在7月6日田間采摘其植株中、上部葉片放入冰壺，快速帶回實驗室及時處理取樣。

2) 苗期實驗室取樣。于2015年7月7日在實驗室播種其中12個豇豆品種(表1中編號為1-12的品種)，取21天苗齡的幼苗第一個三出復(fù)葉的葉片制樣。

1.4 樣品制備

按Masako等[16]和何瑞峰等[17]的方法并加以改進(jìn)。取各品種不同時期的新鮮葉片300 mg，重復(fù)3次，加鮮樣重的15%即45 mg PVP(PVP攝入量為鮮樣重的15%時效果最好[18])及少許石英砂于液氮中碾成粉末。加入3 mL10%(w/v)三氯乙酸(用丙酮配制，其丙酮中含0.07%β-巰基乙醇)，用磁力攪拌器震蕩混勻后懸浮其中，-20 ℃ 沉淀1 h，于4 ℃，13 000 r/min條件下離心15 min棄上清液。加入3 mL冷丙酮(其中含0.07%β-巰基乙醇)，用磁力攪拌器震蕩混勻后懸浮其中，-20 ℃沉淀2 h或過夜，期間每隔一定時間振蕩1次，換液1～2次，以達(dá)到充分去色素的目的。 同上離心棄上清液，加入80%冷丙酮(其中含0.07%β-巰基乙醇)，用磁力攪拌器震蕩混勻后懸浮其中-20 ℃沉淀1 h。 同上離心棄上清液，取沉淀用真空干燥機(jī)真空干燥12 h制成干粉(使樣品充分干燥散去丙酮)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 電泳方法

制膠—點(diǎn)樣—電泳—膠版固定—染色—脫色—凝膠成像等均參照生物化學(xué)技術(shù)[19]和豇豆種子蛋白質(zhì)分析技術(shù)方法[20-21]。

1.6 實驗數(shù)據(jù)處理

采用南京大學(xué)捷達(dá)凝膠成像系統(tǒng)輔助人工讀帶，以“1”和“0”系統(tǒng)記錄譜帶，有帶的賦值為1，無帶的賦值為0，建立數(shù)據(jù)庫，以DPS軟件系統(tǒng)按照J(rèn)accard 相似系數(shù)法的UPGMA方法進(jìn)行品種聚類分析，依24個品種開花結(jié)莢期和12個品種2個時期(開花結(jié)莢期、苗期)分別建立系統(tǒng)聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同耐濕性基因型長豇豆葉片全蛋白電泳圖譜分析

實驗選用的24個長豇豆品種具有耐濕代表性，葉片全蛋白提取上采用了改進(jìn)的低溫液氮研磨和丙酮沉降技術(shù)，蛋白質(zhì)圖譜經(jīng)過反復(fù)實驗具有穩(wěn)定的重復(fù)性。圖譜顯帶比較清晰，較為全面準(zhǔn)確地反映了供試材料的遺傳表達(dá)物差異。

2.1.1 24個品種開花結(jié)莢期葉片全蛋白電泳結(jié)果分析

從24個豇豆品種開花結(jié)莢期葉片全蛋白質(zhì)圖譜(圖1)中共檢測出26條亞基帶，其中17條多態(tài)性帶，多態(tài)性率為65.38%，9條共有譜帶，分別為79.2，64.2，29.6，28.9，25.7，22.1，17.6，16.6，13.8 kD。總體上，亞基分布范圍為97.4～11.3 kD，亞基出現(xiàn)頻率變化幅度為0.04～1。品種平均顯帶數(shù)為17.6條，其中柳翠最多，為23條，美國地豆最少，為11條(圖1)。

注：M為Marker，序號1～12表示編號1～12的豇豆品種開花結(jié)莢期，序號13～24表示編號1～12的豇豆品種苗期(見表1)。圖2 12個不同耐濕性基因型豇豆開花結(jié)莢期和苗期葉片全蛋白電泳圖譜

表2 12個不同耐濕性基因型豇豆開花結(jié)莢期和苗期葉片全蛋白亞基分布情況

位點(diǎn)出現(xiàn)點(diǎn)位帶數(shù)出現(xiàn)頻度分子量(kD)位點(diǎn)出現(xiàn)點(diǎn)位帶數(shù)出現(xiàn)頻度分子量(kD)110．04107．519120．5030．92100．4297．420241．0029．63100．4289．821241．0028．94180．7579．222180．7527．85100．4269．923150．6326．56200．8364．224241．0025．77120．559．82560．2525．18241．0052．326140．5824．0990．3846．127180．7522．610230．9642．428241．0022．111140．5841．629100．4220．712120．539．430120．5019．213120．538．63130．1318．514100．4236．632241．0017．615190．7935．433170．7116．616230．9633．834120．5015．417120．5033．035241．0013．818160．6732．23610．1711．3

2.1.2 12個品種苗期和開花結(jié)莢期葉片全蛋白電泳結(jié)果分析

從12個豇豆品種苗期和開花結(jié)莢期的葉片全蛋白質(zhì)圖譜(圖2)中共檢測出36條蛋白質(zhì)亞基帶，其中16條多態(tài)性帶，多態(tài)性率為44.44%，20條共有譜帶，分別為79.2，59.8，52.3，42.4，39.4，33.8，33.0，32.2，30.9，29.6，28.9，27.8，26.5，25.7，22.6，22.1，19.2，18.5，15.5，13.8 kD，總體上，亞基分布范圍是107.5～11.3 kD，亞基出現(xiàn)頻率變化幅度為0.04～1。品種平均顯帶28.9條，亞基數(shù)最多的開魯線豆為34條，最少的美國地豆為21條(表1 )。

比較開花結(jié)莢期和苗期電泳圖譜差異(圖2)，苗期的12個豇豆品種葉片全蛋白質(zhì)圖譜中檢測出32條蛋白質(zhì)亞基帶，12條多態(tài)性帶，多態(tài)性率為37.5%，16條共有譜帶，其蛋白質(zhì)亞基相對分子量和出現(xiàn)頻率見表2，亞基分布范圍是107.5～13.8 kD，亞基出現(xiàn)頻率變化幅度為0.04～1。而同樣的12個品種在結(jié)莢期的葉片全蛋白質(zhì)圖譜中只檢測出26條蛋白質(zhì)亞基帶，反而有14條多態(tài)性帶，多態(tài)性率為53.84%，9條共有譜帶，其蛋白質(zhì)亞基相對分子量和出現(xiàn)頻率也列于表2，亞基分布范圍是97.4～11.3 kD，亞基出現(xiàn)頻率變化幅度為0.04～1?？梢娒缙诘膩喕鶙l帶數(shù)量明顯較開花結(jié)莢期多，其品種間的共有性也較開花結(jié)莢期大，多態(tài)性較小，其分布范圍偏于高分子量，而開花結(jié)莢期偏于低分子量。這說明苗期植株蛋白質(zhì)表達(dá)物更豐富，同時可能與開花結(jié)莢期受濕害脅迫增加了不同基因型表達(dá)物的差異有關(guān)?？梢姴煌瑫r期和方法進(jìn)行基因型鑒定可能會得出不同的結(jié)論，因此在鑒定長豇豆品種耐濕性時，選擇適當(dāng)?shù)臅r期和脅迫處理方法十分重要。

2.2 聚類分析

1) 根據(jù)24個參試品種開花結(jié)莢期葉片全蛋白圖譜各亞基的分布情況，運(yùn)用Jaccard 相似系數(shù)法的UPMGA進(jìn)行聚類分析，建立聚類樹(圖3)?？梢詫⒐┰嚨?4個長豇豆品種分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個品種群，較耐濕的16個品種在0.40距離處首先聚為一類，對濕澇極敏感的美國地豆獨(dú)成一簇且在最大距離0.81處才與其余23個品種最終聚為一類。

2) 根據(jù)12個參試品種開花結(jié)莢期和苗期的葉片全蛋白的各亞基分布情況，運(yùn)用Jaccard相似系數(shù)的類平均數(shù)(UPMGA)方法進(jìn)行聚類分析，建立聚類樹(圖4)。將供試的12個豇豆品種依兩個時期分為不同簇，在0.39距離時苗期所有品種聚為一簇(S簇)，而在0.63距離時開花結(jié)莢期所有品種聚為另一簇(F簇)，兩簇在0.75距離時聚為一類。充分體現(xiàn)出長豇豆植株蛋白質(zhì)表達(dá)的時序性差異大于基因型差異，同樣說明鑒定豇豆品種耐濕性時，時期的確立很重要。

注：序號1～24同表1品種編號。圖3 根據(jù)開花結(jié)莢期葉片全蛋白亞基分布繪制的24個品種UPGMA聚類圖

從圖3、圖4可以看出，苗期矮虎和美國地豆等在0.24距離時被聚為一簇(S1)，而在開花結(jié)莢期矮虎與泰國豇豆和五號豇豆等在0.43距離時被聚為一簇(F1)，美國地豆在0.63距離時獨(dú)立聚為一簇(F3)。結(jié)合前文提到的田間調(diào)查結(jié)果，從開花結(jié)莢期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個品種群來分析，品種群Ⅰ所包含的Ⅰ1和Ⅰ22個品種亞群中的品種基本上都是對濕澇有較強(qiáng)抗性的品種，品種群Ⅳ由對濕澇害極敏感的美國地豆獨(dú)立組成。矮虎和美國地豆苗期被聚為一簇(圖4)，可能是因為二者都有矮生習(xí)性(表1)等共性；在開花結(jié)莢期分散在不同品種群(圖3)，特別是美國地豆單獨(dú)成為一簇，這可能是其對濕澇害極敏感的表現(xiàn)，其蛋白質(zhì)亞基分布與其它所有品種相比缺少41.6 kD的蛋白質(zhì)亞基。

注：序號1～12代表品種編號(表1)；F表示開花期；S表示苗期。圖4 12個品種長豇豆葉片全蛋白亞基在開花結(jié)莢期和苗期分布聚類圖

但抗性相同的品種也不一定全聚在一起，因為聚類原理是根據(jù)亞基分布相似性來聚類的，所以不同抗性的品種可能有很多共有的亞基，而特異的亞基所占比例偏少。如矮虎所在的Ⅰ1品種亞群主要是對濕澇害有中等抗性的品種，但其所在的簇中泰國豇豆是高抗品種。而2個高抗品種鄂豇豆二號、香港粉豆和3個極敏感品種開魯線豆、長白豇豆、象牙白在0.42和0.50距離時分聚在品種群II和品種群III中，其中鄂豇豆二號和開魯線豆、長白豇豆在0.42距離時聚在品種群Ⅱ中，香港粉豆和象牙白在0.50距離時聚在品種群Ⅲ中。就蛋白質(zhì)亞基分布情況來看，品種群Ⅱ中3品種共有13個蛋白質(zhì)亞基，所以根據(jù)聚類原理，它們聚在一起了，但鄂豇豆二號具有的46.1 kD蛋白質(zhì)亞基，兩極敏感品種沒有。品種群Ⅲ中香港粉豆，象牙白共有13個蛋白質(zhì)亞基，但香港粉豆具有的32.2 kD和22.6 kD亞基，象牙白沒有。在開花結(jié)莢期，耐濕品種鄂豇豆二號、香港粉豆和泰國豇豆，它們之間共有13個蛋白質(zhì)亞基，鄂豇豆二號特有46.1 kD亞基，香港粉豆特有79.2 kD亞基，泰國豇豆特有33.0 kD亞基。極敏感品種美國地豆、開魯線豆、長白豇豆和象牙白，它們之間共有8個蛋白質(zhì)亞基。其中，象牙白特有11.3 kD亞基。

3 討 論

由于開花結(jié)莢期與苗期發(fā)育階段的差異，以及開花結(jié)莢期受到外部不良環(huán)境條件刺激，它們?nèi)~片表達(dá)的蛋白質(zhì)種類存在明顯差異，這與其生理活動需求密切相關(guān)，盡管開花結(jié)莢期有新的蛋白質(zhì)條帶如42.0，34.5，11.3 kD亞基等，但其蛋白質(zhì)數(shù)量明顯下降，例如，共有帶由苗期的20條減少到開花結(jié)莢期的9條，品種平均顯帶帶數(shù)由苗期的28.9條下降到結(jié)莢期17.6條(表1)，因而苗期是植物生長發(fā)育最活躍而復(fù)雜的時期。開花結(jié)莢期不同品種葉片全蛋白無論從種類還是數(shù)量上都發(fā)生了較大的改變，這可能與品種遺傳背景和抵抗外界環(huán)境中濕澇害脅迫都有關(guān)系。除去所有品種都共有的9個蛋白質(zhì)亞基，高抗品種與極敏感品種的差異主要體現(xiàn)在79.2，46.1，41.6，33.0，22.1 kD和11.3 kD 6個蛋白質(zhì)亞基的有無上，推測其可能與長豇豆耐濕澇害有關(guān)。

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Comparison of Total Leaf Protein Profiles of Different Waterlogging Tolerance of Asparagus Bean in Flowering,Podding and Seedling Period as Revealed by SDS-PAGE Electrophoresis

HUZhihui,DUZhenhai,CHENChanyou
(College of Life Sciences,Jianghan University,Wuhan Hubei 430056,China)

The total leaf protein profiles in asparagus bean were revealed by SDS-PAGE electrophoresis for 24 different waterlogging tolerance genotypes at the flowering period in the field and 12 cultivars seedlings cultured in laboratory,respectively.Reproducible electrophoretic profiles of each accession were accompanied by using an improved sampling technology-the method of freezing liquid nitrogen extraction.The subunits distributions for each accession were compared to analyze the genetic relationships among cultivars in two growth stages (flowering and seedling),two dendrograms were constructed by UPGMA cluster analyses using DPS software,respectively.The result indicated that cultivars with different resistant performance in flowering and podding period to the waterlogging damage in the field had obvious different protein profiles.Results also showed that identifications of waterlogging tolerance in asparagus bean genotypes at different growth stages might lead to different conclusions.Seedling stage is the most active and complex in plant growth,and which protein types are very rich.So seedling stage appraisal was more convenient and reliable.

asparagus bean genotypes; seedling; flowering period; waterlogging tolerance;

2016-05-19

農(nóng)業(yè)部“948”項目(編號：2011-G 1-17)；省部級科技平臺(編號：鄂科技通2011-101)；武漢市科技計劃項目(編號：201250499145-12)。

胡志輝(1973—),男,湖北武漢人；高級實驗師,主要從事植物生理生化實驗教學(xué)和研究工作；E-mail：huzhihui@jhun.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.040

S 643.4

A

1001-4705(2016)11-0040-06