膠原蛋白提取工藝和臨床應(yīng)用進(jìn)展

王譯偉，陳治梁

(四川醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000)

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膠原蛋白提取工藝和臨床應(yīng)用進(jìn)展

王譯偉，陳治梁

(四川醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000)

摘要：指出了膠原蛋白是一種功能性蛋白，應(yīng)用廣泛。簡(jiǎn)要概述了膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和提取，對(duì)膠原蛋白的臨床應(yīng)用及其成效進(jìn)行了著重介紹，并展望了今后膠原蛋白的研究前景和應(yīng)用趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：膠原蛋白；臨床應(yīng)用；成效；進(jìn)展

1引言

膠原蛋白是一種白色、不透明、無(wú)支鏈的纖維蛋白質(zhì)，主要存在于動(dòng)物的皮、骨、軟骨、肌腱和韌帶等中，是結(jié)締組織極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的作用[1]。皮膚是所有動(dòng)物的最大的器官，也是膠原蛋白最豐富的蘊(yùn)藏之處；在真皮蛋白質(zhì)中，膠原蛋白占85%～90%[2]。

國(guó)家統(tǒng)計(jì)局資料顯示，2010年全國(guó)肉類總產(chǎn)量7 925萬(wàn)t，其中，豬肉產(chǎn)量5 070萬(wàn)t(64.20%)；牛肉產(chǎn)量653萬(wàn)t(9.50%)；羊肉產(chǎn)量398萬(wàn)t(6.45%)，然而，目前我國(guó)的豬皮除少量制成皮革外，絕大部分沒(méi)得到合理利用。例如大部分牛羊皮被用于皮革業(yè)，但在加工過(guò)程中仍然會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料。再者，我國(guó)也是漁業(yè)大國(guó)，商品加工過(guò)程中也產(chǎn)生大量廢料，如魚皮、魚鱗、魚鰭、魚尾、魚骨等，約占原料魚質(zhì)量的40%～55%。如能從這些廢棄物中提取膠原蛋白加以利用，不僅能夠減少環(huán)境污染，而且也是一種新型膠原資源的開(kāi)發(fā)途徑。膠原蛋白被廣泛的應(yīng)用于食品、營(yíng)養(yǎng)保健、美容以及生物醫(yī)學(xué)材料等諸多領(lǐng)域，其提取、性能和應(yīng)用等方面的研究也一直備受關(guān)注。本文主要對(duì)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及臨床應(yīng)用成效進(jìn)行了概述，并展望了今后膠原蛋白的研究應(yīng)用趨勢(shì)。

2膠原蛋白的結(jié)構(gòu)

膠原蛋白是一個(gè)龐大的家族，種類繁多，機(jī)構(gòu)高度復(fù)雜[3]，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ5種類型[5]?，F(xiàn)以動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的Ⅰ型膠原蛋白為例介紹其各級(jí)結(jié)構(gòu)：一級(jí)結(jié)構(gòu)是組成膠原蛋白多肽鏈的氨基酸序列，每條肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量約為10萬(wàn)，由1 052個(gè)氨基酸殘基組成，直徑約1.5 nm，長(zhǎng)300 nm，螺旋區(qū)含有388個(gè)(Gly—X—Y)重復(fù)序列，X常為脯氨酸，Y常羥脯氨酸或羥賴氨酸，其中脯氨酸是膠原特有的氨基酸。二級(jí)結(jié)構(gòu)是膠原蛋白多肽鏈的左手螺旋，螺距為0.87 nm，每轉(zhuǎn)一圈約有3.3個(gè)氨基酸殘基，這是因?yàn)閍鏈中吡咯環(huán)的存在使N—C鍵不能自由旋轉(zhuǎn)。三級(jí)結(jié)構(gòu)是3條具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈依靠側(cè)鏈殘基相連并相互纏繞形成一個(gè)在中心分子軸周圍的右手三股份螺旋，螺距96 nm，每圈友36個(gè)氨基酸殘基[2，4，6，7]。具有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)的膠原才能發(fā)揮其功效。

3膠原蛋白的功能

膠原蛋白具有許多獨(dú)特的生化性質(zhì)和生理功能。

3.1靜電學(xué)性能

膠原分子約有240個(gè)賴氨酸、羥賴氨酸和精氨酸的氨基和胍基，以及230個(gè)天門冬氨酸和谷氨酸的羧基。這些基團(tuán)在生理?xiàng)l件下都帶電荷，通過(guò)改變環(huán)境的pH值可以改變膠原纖維內(nèi)靜電狀態(tài)[3]。

3.2離子和大分子結(jié)合性能

在自然狀態(tài)和生理?xiàng)l件下，膠原分子約有60個(gè)自由羧基，其有結(jié)合陽(yáng)離子(如鈣)的能力，并在易溶鹽(如硫氰酸鉀)存在時(shí)，該性能將會(huì)提高。

3.3成纖維性能

天然的膠原在組織中以特定的順序組織起來(lái),具有良好的細(xì)胞適應(yīng)性，加速細(xì)胞增殖和促進(jìn)傷口愈合的作用[8]。

3.4止血功能

膠原蛋白有具有良好的凝聚能力，能夠促進(jìn)血小板黏附于其表面，誘導(dǎo)血小板釋放，進(jìn)而產(chǎn)生止血栓。

3.5細(xì)胞功能調(diào)節(jié)性能

在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)與細(xì)胞膜成分之間的相互作用關(guān)系中,膠原蛋白能直接與細(xì)胞膜受體或間接與ECM中的糖蛋白或糖胺聚糖作用,從而對(duì)細(xì)胞膜受體施加影響以達(dá)到參與細(xì)胞行為的調(diào)控作用[9]。

3.6低免疫原性

膠原雖然是大分子物質(zhì)，但結(jié)構(gòu)重復(fù)性大，與其它具有免疫性的蛋白質(zhì)相比，其免疫原性非常低。因而慢性排斥反應(yīng)少見(jiàn)[10]。

3.7可生物降解性

膠原肽鍵能在膠原蛋白酶的水解作用下被打斷，螺旋結(jié)構(gòu)隨之破壞，這樣膠原蛋白就可以被蛋白酶徹底水解。

3.8促進(jìn)骨的形成

食膠原多肽，可增強(qiáng)低鈣水平下的骨膠原結(jié)構(gòu)，從而提高骨強(qiáng)度，達(dá)到促進(jìn)骨形成的作用。

3.9增強(qiáng)皮膚代謝作用

纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及毛細(xì)血管向植入膠原蛋白的部位移動(dòng)，并組合成自身膠原蛋白，從而形成新的正常的結(jié)締組織，活化真皮。

4膠原蛋白的提取

對(duì)膠原蛋白的提取研究，最早來(lái)自魚類膠原的研究，可追溯至20世紀(jì)50年代。其后，陸續(xù)有了學(xué)者開(kāi)展了對(duì)動(dòng)物中膠原蛋白提取技術(shù)的研究。膠原蛋白的提取工藝過(guò)程大致包括選材、除雜、溶出和純化；提取方法有酸法、減法、鹽法、酶法以及上述各發(fā)的混合使用等[1～3]。各種方法根據(jù)條件的不同，所得的膠原蛋白產(chǎn)物可分為膠原、明膠和水解膠原蛋白。它們雖然具有同源性，但在結(jié)構(gòu)和性能上卻有很大差異：在低溫下提取得到的膠原，仍然保持三股螺旋結(jié)構(gòu)，形成的膜具有較好的柔韌性、彈性和強(qiáng)度，在模擬生理?xiàng)l件下能再形成纖維，明顯激活細(xì)胞的生長(zhǎng)。明膠能成凍、成膜，但明膠膜性脆、強(qiáng)度較差。水解膠原蛋白是多肽混合物且不能成膜。明膠和水解膠原蛋白均不能再度形成纖維，而且細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)證明，它們不具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的性質(zhì)，即明膠和水解膠原蛋白不具有生物活性[10]。因此，提取方法成功的關(guān)鍵在于能使膠原不致過(guò)度水解成明膠，保證所提取膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)的完整。

(1)酸法[2]提取是用酸浸泡預(yù)處理后的材料，再經(jīng)離心等操作提純的提取方法。常用的酸有：乙酸、鹽酸、草酸、檸檬酸、醋酸以及乳酸等，主要是利用低離子濃度酸性條件破壞分子間鹽鍵和Schiff堿，從而引起纖維膨脹，降低膠原內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)間的連接作用，最終使其溶解，但是其溶解量很少。

(2)堿法多用于從皮革廢棄物中提取膠原蛋白，其中最關(guān)鍵的是脫鉻。該法操作簡(jiǎn)便，水解作用強(qiáng)，脫鉻率比酸法高，但只能得到相對(duì)分子量較小的水解膠原蛋白，應(yīng)用價(jià)值并不太高。若堿對(duì)肽鍵水解非常嚴(yán)重的話，還會(huì)產(chǎn)生D型氨基酸消旋混合物，即旋光性化合物。而有些D型氨基酸是有毒的，甚至有致癌、致畸和致突變作用[2，3]。顯然，要得到具有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原蛋白，并用于食品醫(yī)藥生產(chǎn)，堿法幾乎是不可取的。

(3)膠原蛋白作為蛋白質(zhì)的一種，也具有鹽溶和鹽析性質(zhì)。依據(jù)不同類型膠原蛋白溶解度與NaCl濃度的關(guān)系，可采取鹽法對(duì)混合膠原蛋白進(jìn)行分離。常用的中性鹽主要有鹽酸-三羥甲基氨基甲烷、NaCl、檸檬酸鹽等。中性鹽種類對(duì)膠原蛋白的溶解和鹽析影響較大，有的鹽可以提高膠原蛋白的穩(wěn)定性，而有的則可降低膠原蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性[3]，加之提取率不是很理想，因此該方法沒(méi)得到普及。

(4)酶具有特異性和高效性，能快速準(zhǔn)確的提取膠原蛋白；不同的原料選擇酶類和確定酶解的最佳條件組合，是提高工業(yè)生產(chǎn)膠原蛋白量的關(guān)鍵。酶的種類有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、鳳梨酶等。其中胃蛋白酶最常用，且只作用于膠原的端肽，不影響螺旋區(qū)段，保持了膠原的生物學(xué)特性，又能使膠原從皮組織中溶出[6]。其最佳條件主要有酶解溫度、pH值、時(shí)間、酶量以及酶和原料的理化狀態(tài)等。該法節(jié)約原材料，能大大提高膠原蛋白的品質(zhì)和創(chuàng)造了更豐厚的利潤(rùn)，使得其在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中使用最為普遍。

5膠原蛋白的臨床研究、應(yīng)用及其成就

(1)臨床應(yīng)用。針對(duì)臨床應(yīng)用的適宜性和可操作性，膠原蛋白經(jīng)不同的加工工藝制備成不同劑型的膠原蛋白生物材料。目前，應(yīng)用較多的劑型有膜劑型、多孔基質(zhì)、凝膠劑型、溶液劑型、纖維狀劑型、管狀劑型、復(fù)合劑型。1976年美國(guó)將膠原蛋白制品列入醫(yī)療器械進(jìn)行管理及審批并批準(zhǔn)上市，近30年來(lái)膠原蛋白制品及其膠原蛋白基生物醫(yī)用材料在臨床上的應(yīng)用正與日俱增[7]。如膜片型膠原在燒傷整形科用作人工皮膚，腦外科替代硬腦膜，普外擴(kuò)增與修復(fù)聲帶，眼耳鼻喉科替換鼓膜、移植角膜；管型膠原能引導(dǎo)引導(dǎo)周圍神經(jīng)再生而被用于神經(jīng)外科，管型還是心血管外科的良好人造血管移植物；凝膠型膠原于泌尿外科可輔助治療尿失禁、修復(fù)腎；海綿型作為傷口敷料在各大科室應(yīng)用廣泛；顆粒型用途較多，可作為藥物輸送載體、生長(zhǎng)因子和生物活性大分子輸送載體、組織和器官再生的細(xì)胞載體；溶液型在各科主要用作膠原涂層；復(fù)合型也常制成各種組織用于相應(yīng)的科室。

(2)膠原蛋白與臨床止血。手術(shù)創(chuàng)傷必然會(huì)引起不同程度的出血和滲血，血海綿狀的膠原蛋白制品具有良好的滲水和吸水能力，可吸附大量血液，從而對(duì)滲血表面造成局部壓迫，達(dá)到止血目的。海綿狀框架可被紅細(xì)胞填塞，引起血小板凝集和纖維蛋白原沉積，貼敷在血管破損處堵塞血液外流，促進(jìn)血栓形成，加速局部血液凝固；它可引起血管痙攣，促使血栓形成，起到血管栓塞的作用；膠原蛋白海綿還可促使血小板破裂，釋放出凝血激活酶，加速凝血；它還有支架作用，使血塊不易脫落而止血。同時(shí)，膠原蛋白對(duì)創(chuàng)面有很好的黏附性，能與組織緊密粘連在一起，一般情況下只需較短時(shí)間的壓迫就可達(dá)到滿意的止血效果，使用十分方便。而且膠原蛋白海綿無(wú)異物反應(yīng)，降解速度也非?？臁Ｒ虼伺c其它止血材料單純的止血作用相比，膠原蛋白在促進(jìn)組織再生和功能恢復(fù)方面也具有獨(dú)特的效果[7～11]。

(2)膠原蛋白與美容。具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白分子相互交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)后，與彈力蛋白及多糖類形成富有彈性的結(jié)締組織，提供支持、保護(hù)功能及各種機(jī)械性質(zhì)，并賦予皮膚彈性與強(qiáng)度。膠原蛋白的生物兼容性使植入的分散膠原蛋白分子具有柔軟性、粘性，從而停留在植入部，持續(xù)修補(bǔ)效果；數(shù)月后，人體的結(jié)締組織能同化植入的膠原蛋白，使其成為人體組織的一部分。又由于膠原蛋白具有生物分解性，能被體內(nèi)的膠原蛋白酶分解，而不至于永久留在植入部。自2009年11月至2010年5月，金寶玉[12]等采用雙美膠原蛋白對(duì)30例求美者面部行面部年輕化填充治療，效果滿意且沒(méi)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)或嚴(yán)重的并發(fā)癥。

(3)膠原蛋白及其改性產(chǎn)物也已大量用于制備生物敷料，如將膠原蛋白覆蓋在燒、燙傷病患的傷口上，可促進(jìn)表皮細(xì)胞的移人與生長(zhǎng)，利于傷口的愈合，可大幅縮短愈合時(shí)間，提高燒傷病人的存活能力。馬慧軍[13]等的膠原蛋白凝膠促皮膚創(chuàng)面修復(fù)的臨床研究結(jié)果表明為，膠原蛋白凝膠可促進(jìn)美容性皮膚創(chuàng)面的修復(fù)，減少創(chuàng)面色素沉著發(fā)生，療效好，安全性高，值得臨床大力推廣應(yīng)用。

(4)膠原蛋白可用于治療皺紋等其他美容治療。隨著年齡增長(zhǎng)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，成纖維細(xì)胞合成能力降低，皮膚中膠原蛋白缺乏，導(dǎo)致皮膚失去彈性并變薄，同時(shí)可導(dǎo)致真皮的纖維斷裂、脂肪萎縮、汗腺及皮脂腺分泌減少，皮膚出現(xiàn)皺紋、皮膚松弛、干燥等老化現(xiàn)象。祝霞[14]等就用膠原蛋白液治療人眼周皮膚皺紋，取得了良好的效果。

6展望

盡管膠原蛋白具有諸多良好的理化性質(zhì)和生物學(xué)性能，但必須清醒地看到其本身的不足和缺陷。如膠原蛋白的抗原性仍然存在，即使很低，有臨床應(yīng)用研究表明，少數(shù)患者對(duì)膠原制品有輕微的過(guò)敏反應(yīng)。為了使膠原蛋白及其制品更安全有效的造福人類，科研工作者們將繼續(xù)用物理或化學(xué)方法交聯(lián)和修飾膠原蛋白，增強(qiáng)純化后天然膠原蛋白的性能，提高和改善其它性能。目前，不少科研人員正致力于尋找高產(chǎn)率、清潔化的膠原蛋白提取方法，為研究其性能和應(yīng)用提供更有利的條件。總之，優(yōu)化膠原蛋白提取工藝、改善膠原蛋白各種性能將繼續(xù)備受廣泛關(guān)注。又由于膠原蛋白制品及其衍生產(chǎn)物具有巨大的市場(chǎng)發(fā)展空間和潛力，其在高附加值領(lǐng)域(如食品、醫(yī)藥材料工業(yè))的應(yīng)用研究將必然成為今后的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]藍(lán)蔚青,李燕,周培根.豬肉膠原蛋白的提取與應(yīng)用淺析[J].肉類研究，2006(3):44～48.

[2]肖世維,但年華,曾睿,等.從動(dòng)物皮中提取膠原蛋白的方法[J].西部皮革，2009,31(15):17～21.

[3]刁雪洋.豬皮膠原蛋白提取及理化特性的研究[D].重慶:西南大學(xué),2010.

[4]許艷琳,馬兆國(guó),孫靜,等.膠原蛋白改性的研究進(jìn)展[J].皮革與化工，2009,26(3):24～28.

[5]藍(lán)蔚青.豬皮膠原蛋白的提取及應(yīng)用研究[D].上海:上海水產(chǎn)大學(xué),2006.

[6]王娜,林煒,穆暢道.皮膠原的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與提取方法[J].皮革科學(xué)與工程，2006,16(2):42～47.

[7]顧其勝.膠原蛋白的臨床應(yīng)用[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2006,20(10):1052～1058.

[8]何理平.海貍鼠尾部肌腱制作醫(yī)用可吸收縫合線的研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[9]張慧君,羅倉(cāng)學(xué),張新申,等.膠原蛋白的應(yīng)用[J].皮革科學(xué)與工程，2003,13(6):37～46.

[10]李國(guó)英,張忠楷,雷蘇,等.膠原、明膠和水解膠原蛋白的性能差異[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)：工程科學(xué)版，2005,37(4):54～58.

[11]段志廣.類人膠原蛋白止血海綿的性能研究[D].西安:西北大學(xué),2008.

[12]金寶玉,王潔晴,鐘李明,等.膠原蛋白微創(chuàng)面部年輕化的臨床應(yīng)用[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2010,21(11):667～668.

[13]馬慧軍,賈赤字,魏蓉,等.膠原蛋白凝膠促皮膚創(chuàng)面修復(fù)的臨床研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2011,20(2):235～236.

[14]祝霞,李遠(yuǎn)宏,吳嚴(yán),等.類人膠原蛋白治療眼周皮膚皺紋的臨床觀察[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2010,19(3):361～363.

Progress of Extraction Technologyand Clinical Application of Collagen

Wang Yiwei,Chen Zhiliang

(CollegeofPreclinicalMedicine,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Abstract:Collagen is a kind of functional proteins,which is applied diffusely.Based on a brief introduction about the structure,function,and extraction of collagen,the article emphatically introducesthe clinical applications and achievements of collagen.Moreover,the article forecaststhe future research prospects and tendency of application.

Key words:collagen; clinical application; effect; progress

文章編號(hào)：1674-9944(2016)02-0180-03

中圖分類號(hào)：TS59

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：王譯偉(1984—)，女，四川瀘州人，講師，主要從事有機(jī)化學(xué)和量子化學(xué)研究。

收稿日期：2015-12-08