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    高效液相色譜法測定青稞紅曲中內(nèi)酯式和酸式洛伐他汀的含量

    2016-12-03 02:36:17陳發(fā)貴張丹劉敏熊燕張森林趙輝
    中國釀造 2016年10期
    關(guān)鍵詞:洛伐他汀紅曲青稞

    陳發(fā)貴,張丹,劉敏,熊燕,張森林,趙輝*

    (1.青藏高原微生物國家地方聯(lián)合工程中心,西藏拉薩850000;2.西藏月王生物技術(shù)有限公司,西藏拉薩850000)

    高效液相色譜法測定青稞紅曲中內(nèi)酯式和酸式洛伐他汀的含量

    陳發(fā)貴1,2,張丹2,劉敏1,2,熊燕1,2,張森林2,趙輝2*

    (1.青藏高原微生物國家地方聯(lián)合工程中心,西藏拉薩850000;2.西藏月王生物技術(shù)有限公司,西藏拉薩850000)

    采用高效液相色譜法測定青稞紅曲中內(nèi)酯和酸式洛伐他汀的含量,以體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇作為提取劑,在室溫條件下超聲提取青稞紅曲中的洛伐他汀1 h。使用Eclipse Plus C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),調(diào)整柱溫30℃,流動相為甲醇∶0.1%磷酸=73∶27;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;紫外檢測器波長238 nm。內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液在20~100 μg/mL時(shí)呈良好的線性(r2=0.999 7),內(nèi)酯式洛伐他汀的平均回收率為99.30%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.67%;酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液在20~100 μg/mL時(shí)呈良好的線性(r2=0.999 9),酸式洛伐他汀的平均回收率為98.50%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.65%。因此高效液相色譜法能夠簡便、快捷、準(zhǔn)確測定青稞紅曲中內(nèi)酯式和酸式洛伐他汀的含量。

    青稞紅曲;洛伐他??;酸式洛伐他汀;高效液相色譜

    青稞[1]是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物,因其內(nèi)外穎殼分離,籽粒裸露,故又稱裸大麥、元麥、米大麥。紅曲[2]別名赤曲、丹曲、紅米、福曲、紅大米、紅槽、紅曲米,以秈米為原料,接種優(yōu)質(zhì)的紅曲霉菌經(jīng)深層發(fā)酵而成,是一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑和藥材[3],其中含有的洛伐他汀具有優(yōu)良的降脂功能[4]。青稞紅曲[5]是以禾本科植物青稞的果實(shí)為原料,接種紅曲菌,經(jīng)固態(tài)發(fā)酵而成的功能性紅曲,具有藥食兼用的特性。青稞紅曲主要含有豐富的色素[6]、他汀類(主要為洛伐他?。ⅵ?氨基丁酸和β-葡聚糖[7]等物質(zhì)。

    紅曲發(fā)酵產(chǎn)生的洛伐他汀有酸式和內(nèi)酯式兩種形態(tài)[8-10],其中酸式洛伐他汀為藥理活性形態(tài),因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中開環(huán)羥基酸部分與3-羥基-3-甲基-戊二酰CoA(HMG-CoA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分類似,可用于膽固醇合成的早期階段,競爭性地抑制膽固醇生物合成限速酶——HMG-CoA還原酶。因此,在評價(jià)紅曲洛伐他汀含量時(shí)不能單獨(dú)測定內(nèi)酯的含量或者將內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為酸式進(jìn)行測定,應(yīng)當(dāng)同時(shí)測定內(nèi)酯式和酸式洛伐他汀的含量,這樣才能真實(shí)反映紅曲中洛伐他汀的含量[11-15],對紅曲的品質(zhì)做出全面的評價(jià)。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    甲醇(色譜純):成都市科隆化學(xué)品有限公司;磷酸、乙醇(均為分析純):成都市科龍化工試劑廠;洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品(C24H36O5,99.4%,批號100600-201003)中國食品藥品檢定研究院;實(shí)驗(yàn)用水為超純水;青稞紅曲藥材:西藏月王藏藥有限責(zé)任公司。

    1.2儀器與設(shè)備

    安捷倫1260 infinity高效液相色譜(high performanceliquid chromatography,HPLC)儀,可變波長VWD檢測器:安捷倫科技有限公司;BSA224S電子天平:賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;SB-5200D超聲波清洗機(jī):寧波新芝生物科技有限公司。

    1.3方法

    1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

    內(nèi)酯洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:準(zhǔn)確稱取洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg,用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇定容至100 mL,即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

    酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:準(zhǔn)確稱取洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg,用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液定容至100 mL,在50℃條件下超聲轉(zhuǎn)化1 h,自然冷卻至室溫后靜置1 h,即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液[16]。

    1.3.2樣品溶液制備

    取適量青稞紅曲,粉碎,過40目篩,取篩下粉末混合均勻。準(zhǔn)確稱取約0.5 g,試樣置于50 mL容量瓶中。加入30 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇,搖勻,室溫條件下超聲提?。üβ?40 W,40 kHz)50 min。加體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇接近刻度,再超聲10 min,冷卻至室溫,用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇定容至50mL。搖勻后4 000 r/min離心10 min,取上清液過0.24 μm微孔濾膜,收集濾液用于高效液相色譜測定。

    1.3.3色譜條件

    色譜柱:Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm);柱溫:30℃;流動相:甲醇∶0.1%磷酸=73∶27;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;紫外檢測器波長:238 nm。

    1.3.4方法學(xué)驗(yàn)證

    (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線

    準(zhǔn)確量取1.3.1中的內(nèi)酯洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分別于10 mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇稀釋至刻度,制成20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的內(nèi)酯洛伐他汀溶液;準(zhǔn)確量取1.3.1中的酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分別于10 mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇稀釋至刻度,制成20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的酸式洛伐他汀溶液。兩種溶液分別經(jīng)過0.24 μm微孔濾膜過濾,取濾液,進(jìn)HPLC測定。記錄色譜圖,以質(zhì)量濃度為X軸、峰面積為Y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    (2)精密度實(shí)驗(yàn)

    分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為20 μg/mL的內(nèi)酯洛伐他汀溶液和酸式洛伐他汀溶液,各重復(fù)進(jìn)樣6次(進(jìn)樣量20 μL)測定,記錄色譜圖,計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

    (3)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    取適量粉碎后的同一批次青稞紅曲藥材,準(zhǔn)確稱取6份,每份約0.5 g。按照1.3.2中樣品溶液制備方法進(jìn)行處理并測定,記錄色譜圖,分別計(jì)算樣品中內(nèi)酯洛伐他汀和酸式洛伐他汀含量及RSD。

    (4)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    取按照1.3.2中樣品制備方法制備的供試品溶液,分別于0、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣測定,記錄色譜圖,計(jì)算RSD。

    1.3.5加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

    內(nèi)酯洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn):取適量已知含量的青稞紅曲藥材粉末,準(zhǔn)確稱取9份,每份約0.5 g,分別置于50 mL容量瓶中,分別加入6 mL、8 mL、10 mL按1.3.1方法配制的內(nèi)酯洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液各3份,其余按照1.3.2處理并測定,記錄色譜圖,計(jì)算平均回收率。

    酸式洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn):取適量已知含量的青稞紅曲藥材粉末,準(zhǔn)確稱取9份,每份約0.5 g,分別置于50 mL容量瓶中,分別加入6.5 mL、9.0 mL、11.5 mL按1.3.1方法配制的酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)貯備液各3份,其余按照1.3.2處理并測定,記錄色譜圖,計(jì)算平均回收率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

    內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

    回收率=

    圖1 內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of lovastatin

    由圖1可知,內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液在20~100 μg/mL時(shí)呈良好的線性,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=76.872x-5.948(R2=0.999 7)。

    酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

    由圖2可知,酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液在20~100 μg/mL時(shí)呈良好的線性,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=73.766x-53.678(R2=0.999)。

    2.2精密度實(shí)驗(yàn)

    方法的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

    由表1可知,內(nèi)酯洛伐他汀的對照品重復(fù)進(jìn)樣6次,峰面積RSD為0.52%,酸式洛伐他汀的對照品重復(fù)進(jìn)樣6次,峰面積RSD為0.56%,結(jié)果表明,系統(tǒng)精密度良好。

    2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

    表2 方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability results of the method

    由表2可知,內(nèi)酯洛伐他汀平均含量為2.31 mg/g,RSD為1.33%;酸式洛伐他汀平均含量為3.02 mg/g,RSD為1.67%。表明方法重復(fù)性良好。

    2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    方法的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

    表3 方法的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Stability results of the method

    由表3可知,內(nèi)酯洛伐他汀峰面積的RSD為1.15%,酸式洛伐他汀峰面積的RSD為1.41%。在本實(shí)驗(yàn)條件下,供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.5加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

    內(nèi)酯洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

    表4 洛伐他汀內(nèi)酯加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Adding standard recovery results of lovastatin

    由表4可知,內(nèi)酯洛伐他汀的平均加標(biāo)回收率為99.31%,RSD為1.65%。樣品加標(biāo)回收率在97.08%~102.27%,表明該方法準(zhǔn)確度良好。

    酸式洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

    表5 酸式洛伐他汀加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Adding standard recovery results of lovastatin acid

    由表5可知,酸式洛伐他汀的平均加標(biāo)回收率為99.04%,RSD為1.63%。樣品加標(biāo)回收率在97.52%~102.64%,表明該方法準(zhǔn)確度良好。

    2.6實(shí)際樣品測定結(jié)果

    實(shí)際樣品測定結(jié)果見表6,內(nèi)酯、酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及樣品色譜圖見圖3。

    表6 實(shí)際樣品測定結(jié)果Table 6 Determination results of samples

    由圖3可知,樣品中2種洛伐他汀出峰時(shí)間和2種洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間相近,分離度良好,并且附近不存在干擾峰,表明檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

    3 結(jié)論

    本文所建立的高效液相色譜法測定青稞紅曲藥材中內(nèi)酯和酸式洛伐他汀的方法簡便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確,所選用的流動相毒性較低,此方法可以在青稞紅曲藥材片生產(chǎn)過程中用于洛伐他汀含量的檢測和飲片質(zhì)量控制。

    圖3 內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品(A)、酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品(B)以及樣品(C)高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatography of lovastatin standard(A), lovastatin acid standard(B)and sample(C)

    [1]臧靖巍,闞建全,陳宗道,等.青稞的成分研究及其應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國食品添加劑,2004(4):43-46

    [2]周立平.紅曲霉在中國的生產(chǎn)及其應(yīng)用(上)[J].中國釀造,2004,23(9):1-4.

    [3]周立平.紅曲霉在中國的生產(chǎn)及其應(yīng)用(下)[J].中國釀造,2004,23(10):5-7.

    [4]趙秀舉,劉志國.紅曲洛伐他汀發(fā)酵條件優(yōu)化及降脂功能[J].中國釀造,2014,33(1):32-35.

    [5]周禮紅,萬強(qiáng),劉敏,等.青稞紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝研究初探[J].中國釀造,2012,31(10):46-49.

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    Content determination of lovastatin and lovastatin acid in highland barleyMonascusby HPLC

    CHEN Fagui1,2,ZHANG Dan2,LIU Min1,2,XIONG Yan1,2,ZHANG Senlin2,ZHAO Hui2*
    (1.National United Engineering Research Center for Tibet Plateau Microbiology,Lhasa 850000,China; 2.Tibet Yuewang Biologic Technetronic Co.,Ltd.,Lhasa 850000,China)

    Lovastatin and lovastatin acid in the highland barleyMonascuswere determined by HPLC.The sample was extracted using 75%ethanol as extraction solvent at room temperature for 1 h,then detected by HPLC method with Eclipse Plus C18column(5 μm,250 mm×4.6 mm)at column temperature 30℃,methanol-0.1%phosphate solution(73∶27)as mobile phase,flow rate 1.0 ml/min,sample quantity 20 μl and detection wavelength 238 nm.The linear range of lovastatin was 20-100 μg/ml(r2=0.9997),the mean recovery was 99.30%,and the relative standard deviation was 1.67%. While the linear range of lovastatin acid was 20-100 μg/ml(r2=0.999 9),the mean recovery was 98.50%,and the relative standard deviation was 1.65%.The HPLC method to determine the content of lovastatin and lovastatin acid in the highland barleyMonascuswas convenient,rapid and accurate.

    highland barleyMonascus;lovastatin;lovastatin acid;HPLC

    O657.7

    0254-5071(2016)10-0162-04

    10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.036

    2016-07-16

    陳發(fā)貴(1988-),男,本科,研究方向?yàn)槲⑸锷锇l(fā)酵工程。

    趙輝(1969-),男,高級工程師,碩士,研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、工商行政管理。

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