氧化去木質(zhì)素玉米芯同步糖化發(fā)酵產(chǎn)2,3-丁二醇

崔有志，杜麗平,2，馬立娟,2*，宋盼，姜風(fēng)超，馬清，肖冬光,2

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津，300457)2(天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津， 300457)

?

氧化去木質(zhì)素玉米芯同步糖化發(fā)酵產(chǎn)2,3-丁二醇

崔有志1，杜麗平1,2，馬立娟1,2*，宋盼1，姜風(fēng)超1，馬清1，肖冬光1,2

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津，300457)2(天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津， 300457)

2,3-丁二醇是一種重要的平臺(tái)化合物。選取經(jīng)過(guò)堿性高錳酸鉀(APP)預(yù)處理后的玉米芯為底物，采用陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeCICC10011通過(guò)同步糖化發(fā)酵工藝(SSF)發(fā)酵產(chǎn)2,3-丁二醇。通過(guò)對(duì)SSF主要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最適宜工藝條件為：底物濃度120 g/L，纖維素酶添加量40 FPU/g，木聚糖酶添加量12 000 U/g，發(fā)酵溫度35 ℃，初始發(fā)酵pH 5.5，轉(zhuǎn)速180 r/min。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，以APP預(yù)處理后的玉米芯為底物連續(xù)發(fā)酵36 h，2,3-丁二醇的濃度為21.5 g/L，轉(zhuǎn)化率為0.27 g/g(以纖維素和半纖維素為參照)；分別是未處理的玉米芯為底物時(shí)的8.41倍和8.71倍。

玉米芯；去木質(zhì)素；同步糖化發(fā)酵；2,3-丁二醇；工藝優(yōu)化

2,3-丁二醇(2,3-butanediol，2,3-BD)是一種無(wú)色無(wú)味的透明液體，廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料和航空航天領(lǐng)域[1]。作為一種重要的平臺(tái)化合物，2,3-丁二醇的研究越來(lái)越受到重視。目前，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2,3-丁二醇的報(bào)道較多，但原料大多以成本較高的葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖等為主[2]，因此，采用自然界中資源豐富的可再生資源木質(zhì)纖維素為原料，是實(shí)現(xiàn)生物法低成本工業(yè)化生產(chǎn)2,3-丁二醇的可行策略。

目前，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用的經(jīng)典技術(shù)路線為原料預(yù)處理、酶解糖化、發(fā)酵轉(zhuǎn)化為生物燃料和其他高附加值化學(xué)品[3]。由于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中纖維素組分通常被木質(zhì)素層層包裹，并與半纖維素交聯(lián)纏繞，這種復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的天然抗降解屏障[4]。因此，去木質(zhì)素是解除木質(zhì)纖維素天然抗降解屏障、提高糖苷水解酶作用效率的首要任務(wù)。在目前常用的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法(離子液法、酸堿預(yù)處理法、蒸汽爆破法、臭氧預(yù)處理法等)中[5]，堿性試劑和強(qiáng)氧化劑組合的預(yù)處理方法可有效去除生物質(zhì)中的木質(zhì)素，同時(shí)破壞半纖維素、纖維素之間的氫鍵和纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，從而破壞生物質(zhì)中的頑抗結(jié)構(gòu)[6-7]。據(jù)報(bào)道，堿性過(guò)氧化氫作為一種堿性氧化劑應(yīng)用于玉米芯的處理中，木質(zhì)素去除效果明顯[8]。

在我們的前期研究中，首次采用堿性高錳酸鉀(APP)預(yù)處理木質(zhì)纖維素，結(jié)果表明，該方法能夠有效破壞木質(zhì)纖維素3個(gè)組分之間的化合鍵連接，去除玉米芯中大部分木質(zhì)素，利于后期的酶解[9]。由于強(qiáng)氧化劑高錳酸鉀普遍應(yīng)用于給水處理，既可以將水中的有機(jī)物氧化，也可以對(duì)水中有機(jī)物進(jìn)行吸附等，起到除臭、除錳以及除鐵等作用[10-11]，與臭氧、二氧化氯以及氯等氧化劑相比，高錳酸鉀的安全性更高[12]，較堿性過(guò)氧化氫穩(wěn)定性更高、成本更低，因此，具有可行的工業(yè)化應(yīng)用前景。

本研究利用APP預(yù)處理后的玉米芯為發(fā)酵原料，采用同步糖化發(fā)酵工藝(SSF)生產(chǎn)平臺(tái)化合物2,3-丁二醇，探究堿性氧化劑處理后的木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的能力，分析不同因素對(duì)APP預(yù)處理玉米芯發(fā)酵的影響，以期為木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的高效生物轉(zhuǎn)化提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

玉米芯(纖維素 35.34%，半纖維素 34.32%，木質(zhì)素 15.81%)購(gòu)自天津周邊郊區(qū)，粉碎至粒度大小為0.18 mm，備用。取玉米芯按照固液比例1∶20加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%堿性高錳酸鉀溶液(pH11～12)，50 ℃下預(yù)處理6 h，所得玉米芯殘?jiān)米詠?lái)水洗至中性并烘干至恒重[9]，備用。

1.1.2 菌種

陰溝腸桿菌(EnterobactercloacaeCICC10011)，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.3 酶制劑

纖維素酶液: 190 FPU/mL；木聚糖酶液: 32 000 U/mL，湖南尤特爾生化有限公司贈(zèng)予。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母浸粉10，葡萄糖20，pH自然。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母浸粉5.0，KH2PO46.0，K2HPO414.0，(NH4)2SO42.0，檸檬酸鈉 1.0，MgSO4·7H2O 0.4，EDTA-Na 0.05，pH 6.0。

同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米芯殘?jiān)?80，酵母粉 10，(NH4)2SO42，KH2PO414.0，K2HPO46.0，MgSO4·7H2O 0.4，檸檬酸鈉 1.0，pH 5.5。

以上培養(yǎng)基均在115 ℃下，濕熱滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 底物混合酶解

準(zhǔn)確稱取2.0 g玉米芯(或玉米芯殘?jiān)?絕干樣品于250 mL三角瓶中，按照一定固液比加入0.05 mol/L、pH 4.8的檸檬酸緩沖液?；旌弦褐欣w維素酶添加量為30 FPU/g，木聚糖酶添加量為 8 000 U/g，水解體系總體積為40 mL。在50 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下振蕩酶解72 h。離心，獲得酶解上清液進(jìn)行單糖和還原糖的測(cè)定。

1.2.2 同步糖化發(fā)酵

在250 mL三角瓶中，分別裝入 45 mL同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基和5 mL種子液，初始同步糖化發(fā)酵條件為：玉米芯底物濃度80 g/L，初始pH 5.5，溫度35 ℃，揺瓶轉(zhuǎn)速為150 r/min，木聚糖酶添加量為8 000 U/g，纖維素酶添加量30 FPU/g。對(duì)同步糖化發(fā)酵各條件分別進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 分析方法

1.3.1 玉米芯中各組分含量的測(cè)定

玉米芯中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的測(cè)定參照美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)標(biāo)準(zhǔn)分析規(guī)程LAP-002[13]。

1.3.2 還原糖的測(cè)定

酶解液中的總還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定[14]，取l.0 mL稀釋液至25 mL具塞試管中，加入3 mL DNS試劑，放入沸水浴中反應(yīng)5 min，迅速冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，混勻。測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下酶解液的吸光值(OD)，同時(shí)用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 2,3-丁二醇質(zhì)量濃度和糖組分的測(cè)定

葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖、2,3-丁二醇的定量分析采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定，使用Bio-Rad HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm)，柱溫65 ℃，流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，上樣量20 μL，使用RI示差折光檢測(cè)器，外標(biāo)法定量。

1.4 底物混合酶水解糖得率

葡萄糖得率計(jì)算公式為：

(1)

其中，YG為葡萄糖得率，%；V酶為酶解液的體積，mL；CG為酶解液中葡萄糖濃度，g/L；W樣為所取玉米芯樣品的質(zhì)量，g；PG為玉米芯樣品中纖維素百分含量，%。

木糖得率計(jì)算公式為：

(2)

其中，YX為木糖得率，%；V酶為酶解液的體積，mL；CX為酶解液中木糖質(zhì)量濃度，g/L；W樣為所取玉米芯樣品的質(zhì)量，g；PH為玉米芯樣品中半纖維素百分含量，%。

還原糖得率計(jì)算公式為：

(3)

其中，YR為還原糖得率，%；V酶為酶解液的體積，mL；CR為酶解液中還原糖濃度，g/L；W樣為所取玉米芯樣品的質(zhì)量，g；PZ為玉米芯樣品中綜纖維素(纖維素及半纖維素)百分含量，%。

1.5 2,3-丁二醇轉(zhuǎn)化率

轉(zhuǎn)化率(Y)的計(jì)算公式為：

(4)

其中，C1為2,3-丁二醇質(zhì)量濃度，g/L；C2為發(fā)酵液中綜纖維素(纖維素及半纖維素)的質(zhì)量濃度，g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理前后玉米芯的酶解比較

堿性高錳酸鉀預(yù)處理(APP)后玉米芯各組分的含量分別為：纖維素 36.33%，半纖維素 30.40%，木質(zhì)素 9.14%。由此可見(jiàn)，木質(zhì)素脫除率為53.21%，纖維素和半纖維素保留率分別為94.56%和81.47%。將APP預(yù)處理前后的玉米芯分別按照不同的固液比進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，酶解后糖的得率結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同固液比條件下的酶解結(jié)果

由表1可知，不同固液比條件下，APP預(yù)處理后玉米芯酶解液中葡萄糖得率均高于未經(jīng)預(yù)處理玉米芯的。當(dāng)酶解固液比為1∶40時(shí)，APP預(yù)處理后玉米芯酶解12 h，酶解液中葡萄糖得率是未處理玉米芯酶解液中的1.75倍，還原糖得率是未處理的1.6倍；72 h時(shí)APP預(yù)處理玉米芯的葡萄糖得率為未處理的1.25倍，還原糖得率是未處理的1.38倍。但隨著固液比增加，APP預(yù)處理前后葡萄糖和還原糖得率相差不明顯。APP預(yù)處理后玉米芯酶解液中木糖得率在低固液比時(shí)比未處理玉米芯中高，但在高固液比時(shí)低于未處理的玉米芯。當(dāng)固液比提高至1∶10時(shí)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)APP預(yù)處理玉米芯酶解液中纖維二糖濃度遠(yuǎn)大于未處理的，表明高固狀態(tài)下APP預(yù)處理后玉米芯在酶解過(guò)程受阻，大量纖維二糖無(wú)法進(jìn)一步水解為葡萄糖單糖。

在高固狀態(tài)下酶解效率降低的原因很多，一方面對(duì)于堿性高錳酸鉀預(yù)處理來(lái)說(shuō)，KMnO4中的Mn7+在反應(yīng)過(guò)程中降至Mn6+和Mn4+，在玉米芯的預(yù)處理過(guò)程中可能生成例如MnO2之類的氧化物，此類氧化物具有吸附有機(jī)物的功能[15]。酶解過(guò)程中低價(jià)態(tài)錳氧化物可能吸附纖維素酶和木聚糖酶，從而影響酶解效果。另一方面，酶解“固體效應(yīng)”廣泛存在，可能與底物效應(yīng)、產(chǎn)物抑制、纖維素酶吸附等許多因素有關(guān)[16]。另外，在固體濃度較高條件下，APP預(yù)處理后玉米芯酶解液中存在pH升高現(xiàn)象，溶液pH值的較大改變可能阻礙玉米芯進(jìn)一步酶解。而在較小的酶解固液比條件下時(shí)，酶解液中pH值變化較小，對(duì)酶與玉米芯接觸影響較小，從而相比未處理玉米芯酶解出更多的還原糖。

2.2 同步糖化發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 纖維素酶添加量

陰溝腸桿菌主要利用葡萄糖代謝產(chǎn)2,3-丁二醇，在玉米芯殘?jiān)拿附庖褐?，葡萄糖是主要的單糖成分。纖維素酶的添加量主要影響玉米芯殘?jiān)欣w維素的酶解，在同步糖化發(fā)酵過(guò)程中改變纖維素酶的用量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。2,3-丁二醇的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率隨纖維素酶的添加量增加而增大，但當(dāng)纖維素酶添加量超過(guò)40 FPU/g時(shí)，2,3-丁二醇的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率沒(méi)有明顯的變化。當(dāng)纖維素酶添加量超過(guò)60 FPU/g時(shí)，2,3-丁二醇的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率反而呈下降趨勢(shì)。纖維素酶添加量主要影響同步糖化發(fā)酵過(guò)程中酶解葡萄糖量，這與陰溝腸桿菌利用酶解葡萄糖發(fā)酵時(shí)間與酶解量協(xié)同作用有緊密的關(guān)系?？紤]到成本問(wèn)題，選取40 FPU/g作為下一步優(yōu)化纖維素酶用量，此時(shí)，2,3-丁二醇產(chǎn)量為12.05 g/L，轉(zhuǎn)化率為0.15 g/g。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)SSF的影響Fig.1 Effects of cellulase dosage on SSF

2.2.2 木聚糖酶添加量

在同步糖化過(guò)程中，木聚糖酶不僅可以酶解玉米芯殘?jiān)邪肜w維素分解出木糖，還可以促進(jìn)纖維素酶對(duì)纖維素組分的酶解。圖2顯示了不同木聚糖酶添加量條件下的發(fā)酵結(jié)果。當(dāng)木聚糖酶添加量從1 600 U/g升高至12 000 U/g時(shí)，2,3-丁二醇的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率均隨之升高，單位產(chǎn)量從0.16升至0.27 g/g。這與木聚糖酶能破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)混合酶解效率有關(guān)。當(dāng)木聚糖酶添加量為16 000 U/g時(shí)，2,3-丁二醇產(chǎn)量略微下降，過(guò)量的木聚糖酶會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物抑制，從而不利于糖的酶解，間接導(dǎo)致2,3-丁二醇產(chǎn)量的下降。綜合考慮，選取12 000 U/g作為下一步優(yōu)化工藝的木聚糖酶活用量。

圖2 木聚糖酶添加量對(duì)SSF的影響Fig.2 Effects of xylanase dosage on SSF

2.2.3 底物質(zhì)量濃度

由于發(fā)酵底物為固體，其濃度影響發(fā)酵體系中的酶解、物質(zhì)的傳遞和溶解氧，是2,3-丁二醇發(fā)酵過(guò)程中的重要影響因素。不同底物濃度對(duì)2,3-丁二醇產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 底物濃度對(duì)SSF的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on SSF

由圖3可見(jiàn)，當(dāng)?shù)孜餄舛葟?0 g/L逐漸升高至140 g/L時(shí)，2,3-丁二醇產(chǎn)量也不斷地提高，轉(zhuǎn)化率在濃度為80 g/L時(shí)達(dá)到最大值0.27 g/g。但是當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?20 g/L時(shí)，發(fā)酵混合液十分黏稠，不利于控制pH，嚴(yán)重影響了氧的溶解，使得發(fā)酵體系中傳質(zhì)受阻，2,3-丁二醇的轉(zhuǎn)化率下降。綜合2,3-丁二醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，選取120 g/L作為適宜的同步糖化發(fā)酵底物濃度。

2.2.4 初始pH值

發(fā)酵液體系中，纖維素酶、木聚糖酶酶解最適pH值范圍為4.8～5.0，而陰溝腸桿菌最適生長(zhǎng)pH為5.5～6.0。適宜的pH值能提高陰溝腸桿菌的代謝轉(zhuǎn)化效率，提高2,3-丁二醇的產(chǎn)量[17]。

從圖4數(shù)據(jù)可知，在pH為4.5～5.0時(shí)，2,3-丁二醇產(chǎn)量較低，主要是由于陰溝腸桿菌在較低pH環(huán)境中代謝受到抑制。當(dāng)pH值大于6時(shí)，發(fā)酵初始酶解效率變低，2,3-丁二醇產(chǎn)量也隨之下降。經(jīng)過(guò)APP預(yù)處理后的玉米芯，部分醚鍵、酯鍵結(jié)構(gòu)被堿性高錳酸鉀氧化，甲氧基和羰基會(huì)結(jié)合發(fā)酵液中的H+使得發(fā)酵環(huán)境pH的回復(fù)在某一數(shù)值。在以APP預(yù)處理后玉米芯為底物的同步糖化發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵體系中pH值會(huì)慢慢的回復(fù)至6.5。pH值緩慢升高至6.0～6.5時(shí)有利于協(xié)同陰溝腸桿菌的代謝發(fā)酵，但當(dāng)前期發(fā)酵條件不適合酶解或者前期發(fā)酵環(huán)境pH較快回復(fù)到6.0～6.5時(shí)，發(fā)酵菌種則會(huì)由于缺少足夠的酶解糖源而導(dǎo)致菌種自溶，整體代謝受到抑制，導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng)或者2,3-丁二醇產(chǎn)量降低。當(dāng)pH值為5.5時(shí)，2,3-丁二醇產(chǎn)量為19.28 g/L，2,3-丁二醇轉(zhuǎn)化率為0.24 g/g?？梢缘贸?，在pH 5.5的條件下，玉米芯酶解糖化與2,3-丁二醇發(fā)酵協(xié)同效率最大。

圖4 初始pH值對(duì)SSF的影響Fig.4 Effects of initial pH on SSF

2.2.5 轉(zhuǎn)速

陰溝腸桿菌是兼性厭氧菌微生物，在微氧條件下代謝生成2,3-丁二醇。搖床轉(zhuǎn)速?zèng)Q定著發(fā)酵液中的溶氧，不同轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)SSF的影響Fig.5 Effects of rotate speed on SSF

當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min和250 r/min時(shí)，2,3-丁二醇產(chǎn)量迅速降低，轉(zhuǎn)化率接近0。這可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)速過(guò)大，產(chǎn)生的剪切力對(duì)陰溝腸桿菌細(xì)胞起到了損壞作用。另一方面，菌體在以APP預(yù)處理玉米芯為底物的培養(yǎng)基中高溶氧狀態(tài)中可能發(fā)生自溶，無(wú)法利用后期發(fā)酵液中酶解糖，從而導(dǎo)致2,3-丁二醇產(chǎn)量降低。轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，2,3-丁二醇的產(chǎn)量為21.50 g/L，2,3-丁二醇的轉(zhuǎn)化率為0.27 g/g。以未處理玉米芯為底物同步糖化發(fā)酵36 h時(shí)，2.3-丁二醇產(chǎn)量為2.56 g/L轉(zhuǎn)化率為0.031 g/g。結(jié)果表明，在APP預(yù)處理?xiàng)l件下玉米芯的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化利于同步糖化發(fā)酵。在最優(yōu)條件下，預(yù)處理后玉米芯發(fā)酵產(chǎn)2,3-丁二醇產(chǎn)量是未處理的8.41倍，轉(zhuǎn)化率是未處理的8.71倍。

2.2.6 同步糖化發(fā)酵結(jié)果比較

為綜合比較APP預(yù)處理后玉米芯殘?jiān)l(fā)酵性能，根據(jù)已報(bào)道的稀酸、稀堿處理方法[18]，對(duì)玉米芯進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理后玉米芯殘?jiān)附饨Y(jié)果如表2所示。經(jīng)稀酸、稀堿、APP預(yù)處理和未處理玉米芯在上述優(yōu)化SSF條件下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同方法預(yù)處理后玉米芯發(fā)酵2,3-丁二醇產(chǎn)量-時(shí)間曲線Fig.6 The time curve ofthe yield of 2,3-butanediol with corncob pretreated by different pretreatment methods

由圖6可知，在相同發(fā)酵條件下，以未處理玉米芯為底物的SSF過(guò)程中，2,3-丁二醇的產(chǎn)量一直較低。在72 h時(shí)，未處理玉米芯同步糖化發(fā)酵2,3-丁二醇的產(chǎn)量為3.33 g/L。在0-60 h內(nèi)，APP預(yù)處理發(fā)酵2,3-丁二醇產(chǎn)量高于稀酸預(yù)處理，可能在SSF過(guò)程中的pH值緩慢回復(fù)與細(xì)菌發(fā)酵協(xié)同更利于2,3-丁二醇的發(fā)酵，也可能與錳離子可以促進(jìn)微生物的代謝有關(guān)[19]。綜合表1數(shù)據(jù)可知，相比APP預(yù)處理，稀酸預(yù)處理后玉米芯更易于酶解糖化，所以SSF后期稀酸預(yù)處理玉米芯發(fā)酵產(chǎn)量大于APP預(yù)處理，發(fā)酵108 h時(shí)發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到23.09 g/L。稀堿預(yù)處理后玉米芯SSF過(guò)程中2,3-丁二醇產(chǎn)量最高，堿預(yù)處理可以大量溶解去除玉米芯中木質(zhì)素，并且酶解液中葡萄糖和木糖含量較高，利于陰溝腸桿菌的同步代謝利用。

對(duì)比表1和圖6，APP預(yù)處理與未處理玉米芯在相同酶解條件下，APP酶解總還原糖產(chǎn)量低于未處理玉米芯，但2,3-丁二醇發(fā)酵產(chǎn)量一直大于未處理玉米芯。APP預(yù)處理法能除去木質(zhì)纖維素原料中抑制發(fā)酵的木質(zhì)素、酚類等物質(zhì)，未處理玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)基pH值發(fā)酵過(guò)程中會(huì)回復(fù)至4.5-5.0，這個(gè)pH范圍會(huì)抑制 2,3-丁二醇的發(fā)酵。所以，在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵抑制物和pH值在2,3-丁二醇的SSF發(fā)酵過(guò)程十分重要，是限制生物質(zhì)發(fā)酵的主要影響因素。同步糖化發(fā)酵108 h，APP預(yù)處理后玉米芯發(fā)酵2,3-丁二醇產(chǎn)量為18.34 g/L，是未處理玉米芯發(fā)酵產(chǎn)量的5.5倍。

3 結(jié)論

目前，國(guó)內(nèi)外在木質(zhì)纖維素的預(yù)處理中，對(duì)堿性氧化劑預(yù)處理方法的研究文獻(xiàn)較少。本研究表明，堿性高錳酸鉀作為一種堿性強(qiáng)氧化劑，對(duì)玉米芯進(jìn)行去木質(zhì)素預(yù)處理后能顯著改變玉米芯的酶解效果。以堿性高錳酸鉀預(yù)處理后的玉米芯為發(fā)酵底物，采用同步糖化發(fā)酵工藝，通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵抑制物和pH值是限制生物質(zhì)發(fā)酵的主要影響因素。在最優(yōu)條件下，2,3-丁二醇的產(chǎn)量為21.50 g/L，轉(zhuǎn)化率為0.27 g/g，分別是未處理的8.41和8.71倍。堿性高錳酸鉀預(yù)處理能顯著提高以玉米芯為底物的發(fā)酵2,3-丁二醇的產(chǎn)量。上述研究結(jié)果為提高木質(zhì)纖維素降解率、降低酶解糖化成本提供了可行的方案和理論指導(dǎo)，對(duì)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的高效降解和生物轉(zhuǎn)化具有重要的意義。

[1] 徐尤勇,高健,徐虹,等.PaenibacilluspolymyxaZJ-9混合發(fā)酵菊粉和葡萄糖合成R,R-2,3-丁二醇[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015, 41(3): 8-13.

[2] JI XJ,HUANG H,OUYANG PK.Microbial 2,3-butanediol production : a state-of-the-art review[J].Biotechnology Advances, 2011, 29(3): 351-364.

[3] LYND LR,ZYL WH,MCBRIDE JE,et al.Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass: an update[J].Current Opinion in Biotechnology, 2005,16(5):577-583.

[4] DONOHOE BS, RESCH MG. Mechanisms employed by cellulase systems to gain access through the complex architecture of lignocellulosic substrates[J].Current Opinionin Chemical Biology,2015,29:100-107.

[5] SINGH J, SUHAG M, DHAKA A. Augmented digestion of lignocellulose by steam explosion, acid and alkaline pretreatment methods: A review [J]. Carbohydrate Polymers,2015,117:624-631.

[6] HUMPULA JF,UPPUGUNDLA N,VISMEH R,et al.Probing the nature of AFEX-pretreated corn stover derived decomposition products that inhibit cellulase activity [J]. Bioresource Technology,2014,152:38-45.

[7] SAHARE P,SINGH R,LAXMAN S,et al.Effect of alkali pretreatment on the structural properties and enzymatic hydrolysis of corn cob [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2012,168(7):1 806-1 819.

[8] MARTIN C,THNOMSEN AB.Wet oxidation pretreatment of lignocellulosic residues of sugarcane, rice, cassava and peanuts for ethanol production [J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2007,82(2):174-181.

[9] MA LJ,CUI YZ,Cai R, et al.Optimization and evaluation of alkaline potassium permanganate pretreatment of corncob[J].Bioresouce Technology,2015,180:1-6.

[10] ANTONIOUS EA, HARTOG N, van BREUKEL BM, et al. Aquifer pre-oxidation using permanganate to mitigate water quality deterioration during aquifer storage and recovery [J]. Applied Geochemistry,2014,50:25-36.

[11] WU C,ZHANG GM,ZHANG PY,et al.Disintegration of excess activated sludge with potassium permanganate: Feasibility, mechanisms and parameter optimization [J].Chemical Engineering Journal,2014,240:420-425.

[12] WU JN,EIN-MOZAFFAIR F,UPRITI S.Effect of ozone pretreatment on hydrogen production from barley straw[J].Bioresource Technology,2013,144:344-349.

[13] SLUITER A,HAMES B,RUIZ R,et al.Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass [M]. In: Laboratory Analytical Procedure. Golden, CO, National renewable energy laboratory，2008.

[14] MILLER G.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J].Analytical Chemistry，1959, 31: 426-428.

[15] CHEN JJ, YEH HH. The mechanisms of potassium permanganate on algae removal [J].Water Research, 2005, 39(18): 4 420-4 428.

[16] JONSSONL J,ALRIKSSON B,NILVEBRANT NO.Bioconversion of lignocellulose: inhibitors and detoxification[J].Biotechnology for Biofuels,2013,6(1):16-28.

[17] 楊套偉,饒志明,張顯,等.pH與溶氧控制對(duì)解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵粗甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2013, 29(12):1 860-1 864.

[18] BAADHE RR,POTUMARTHI R,MEKALA NK. Influence of dilute acid and alkali pretreatment on reducing sugar production from corncobs by crude enzymatic method: a comparative study[J].Bioresource Technology,2014,162: 213-217.

[19] CHO S,KIM T,WOO HM,et al.Enhanced 2,3-butanediol production by optimizing fermentation conditions and engineeringKlebsiellaoxytocaM1 through overexpression of acetoin reductase [J].PLoS One,2015,10(9): e0138109.

Optimization of 2,3-butanediol production using simultaneous saccharification and fermentation from corncob after delignification by oxidant

CUI You-zhi1, DU Li-ping1,2, MA Li-juan1,2*, SONG Pan1, JIANG Feng-chao1, MA Qing1, XIAO Dong-guang1,2

1(Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China) 2(Tianjin Food Safety & Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center, Tianjin 300457, China)

2,3-butanediol is an important potential platform chemical. In this work, corncob delignified by alkaline potassium permanganate pretreatment (APP) was used as the substrate to produce 2,3-butanediol byEnterobactercloacaeCICC10011 through simultaneous saccharification and fermentation (SSF) process. The optimal conditions for SSF were as follows: substrate concentration 120 g/L, cellulase loading 40 FPU/g, xylanase loading 12 000 U/g, initial pH 5.5, temperature 35 ℃, and the rotate speed 180 r/min. After 36 h fermentation under the optimal SSF conditions, the yield of 2,3-butanediol was 21.5 g/L and the conversion rate was 0.27 g/g (based on cellulose and hemicellulose) with the APP-pretreated corncob as the substrate, which were 8.41 and 8.71 times of those with the un-pretreated corncob as the substrate respectively.

corncob; delignification; simultaneous saccharification and fermentation; 2,3-butanediol; optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610002

碩士研究生(馬立娟博士為通訊作者,E-mail：malj@tust.edu.cn)。

天津科技大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金資助(2014CXLG10)；工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))開(kāi)放基金資助(2014IM101)；天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(16JCZDJC31800)

2016-05-04，改回日期：2016-06-07