大蒜皮降解芽孢桿菌屬細(xì)菌J-5發(fā)酵條件優(yōu)化

梁寶東，魏海香，姜淑喆，楊永濤

（1.濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東 曲阜 273155；2.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250013）

大蒜皮降解芽孢桿菌屬細(xì)菌J-5發(fā)酵條件優(yōu)化

梁寶東1，魏海香1，姜淑喆2，楊永濤1

（1.濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東 曲阜 273155；2.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250013）

利用響應(yīng)面法對芽孢桿菌屬細(xì)菌J-5菌株產(chǎn)羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。通過單因素試驗(yàn)，研究了氮源、碳氮比、初始pH值、料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、輔助碳源等對產(chǎn)CMCase酶活性的影響，再此基礎(chǔ)上選擇料水比、碳氮比、初始pH值三因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，考察各因素對CMCase酶活性的影響及相互作用。確定最佳產(chǎn)酶條件為碳氮比25∶1（m/m）、初始pH 3.2、料水比

大蒜皮；羧甲基纖維素酶；響應(yīng)面分析

在自然界中，纖維素是最廣泛存在的可再生資源[1]。在大蒜加工過程中，其秸稈及大蒜皮只有少數(shù)作為牛、羊的食料，多數(shù)作為廢棄物隨意丟棄。大蒜秸稈、蒜皮等廢棄物含有豐富的有機(jī)物質(zhì)，經(jīng)檢測大蒜的普通干秸稈中（以總質(zhì)量計(jì)）各組分含量為粗纖維24.63%、粗蛋白8.68%、粗脂肪0.96%、粗灰分14.51%、水分12.62%、鈣2.29%、磷0.25%、無氮浸出物38.59%、總糖沒有檢出[2]。但是，大蒜秸稈及皮中含有的抗菌物質(zhì)，如大蒜素等，不利于微生物的生長，是限制其被利用的關(guān)鍵[3]?，F(xiàn)在利用秸稈的方法主要有一些物理、化學(xué)和生物的方法，其都存在不能充分利用、處理成本高等問題，只有生物降解法是利用秸稈的最佳途徑[4]。眾多國內(nèi)外專家學(xué)者一直致力于尋找并改造能高效降解纖維素的菌種。因此，產(chǎn)纖維素酶菌種的分離、篩選及優(yōu)化其產(chǎn)酶條件一直是相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[5-7]。據(jù)報(bào)道，里氏木霉（Trichlderma ressiei）、綠色木霉（Trichoderma viride）、康氏木霉（Trichoderma koniggii）等微生物具有較高的纖維素降解能力[8-11]。但受制于這些菌株較高的產(chǎn)酶條件，同時(shí)由于秸稈中天然纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、高惰性，處理大蒜廢棄物時(shí)依然存在轉(zhuǎn)化率低、時(shí)間長、成本偏高等諸多問題，難以利用纖維素酶進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[12-13]。研究菌種產(chǎn)酶條件是提高纖維素酶活性、增加產(chǎn)酶量的重要途徑之一[14-15]。本實(shí)驗(yàn)擬研究大蒜皮降解菌株的產(chǎn)酶條件，以期將大蒜皮高效降解為糖和蛋白質(zhì)，為蒜皮降解提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

J-5菌株（野生）篩選自大蒜皮自然降解物，革蘭氏陽性，桿狀，有芽孢，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn），濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存。

液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨3 g、硫酸銨2 g、酵母膏0.5 g、KH2PO44 g、CaCl20.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、吐溫-80 0.2 g、羧甲基纖維素鈉10 g、蒸餾水1 000 mL，初始pH 5.0。

固體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：粉碎的無霉變大蒜皮粉（取自加工廠的新鮮大蒜皮，烘干后粉碎10目）20.0 g、(NH4)2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、K2HPO40.1 g、蒸餾水70 mL，初始pH 5.0，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min。

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉 北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；羧甲基纖維素鈉、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4、檸檬酸、檸檬酸三鈉（均為分析純） 天津市英博生化試劑有限公司；剛果紅 天津市津北精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；XB120A電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HZQ-X160恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；723PC可見光分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；TD6離心機(jī) 常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；YXQ-SL-50SLL立式壓力滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；雷磁PHS-3C型pH計(jì) 南京互川電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固體發(fā)酵產(chǎn)酶的單因素試驗(yàn)

1.3.1.1 氮源對羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）產(chǎn)量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液，加入到以2 g/100 g蛋白胨、1 g/100 g蛋白胨加1 g/100 g硫酸銨、2 g/100 g硫酸銨分別作為氮源的不同固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，其他成分不變，每組3 個(gè)平行，料水比1∶4（m/V）、35 ℃培養(yǎng)5 d，測其酶活力。

1.3.1.2 料水比對CMCase產(chǎn)量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到料水比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（m/V）的不同固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，振動(dòng)混合均勻，每組3 個(gè)平行，35 ℃培養(yǎng)5 d，測其酶活力。

1.3.1.3 碳氮比對CMCase產(chǎn)量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到碳氮比為5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1（m/m）的不同固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。每組3 個(gè)平行，料水比1∶4（m/V），35 ℃培養(yǎng)5 d，測其酶活力。

1.3.1.4 初始pH值對CMCase產(chǎn)量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到初始pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的不同固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，每組3 個(gè)平行，料水比1∶4（m/V）、35 ℃培養(yǎng)5 d，測其酶活力。

1.3.1.5 發(fā)酵溫度對CMCase產(chǎn)量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到15 個(gè)相同條件的固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，每組3 個(gè)平行，料水比1∶4（m/V），分別于29、32、35、38、41 ℃條件下培養(yǎng)5 d，測其酶活力。

1.3.1.6 發(fā)酵時(shí)間對CMCase產(chǎn)量的影響

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到15 個(gè)相同條件的固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，每組3 個(gè)平行，料水比1∶4（m/V）、35 ℃分別培養(yǎng)72、96、120、144、168 h，測其酶活力。

1.3.1.7 輔助碳源（葡萄糖）對CMCase產(chǎn)量的影響

自我教育是指個(gè)體根據(jù)需求，有目的、有計(jì)劃地對自我提出要求，把自我作為認(rèn)識(shí)、驅(qū)動(dòng)、調(diào)控與改造的對象，為提高和完善自我而進(jìn)行的一種教育活動(dòng)。自我認(rèn)識(shí)、自我驅(qū)動(dòng)、自我踐行、自我調(diào)控、自我實(shí)現(xiàn)是自我教育的五要素，這些要素之間是相互聯(lián)系、互為作用的動(dòng)態(tài)合作關(guān)系。自我教育作為一種自主學(xué)習(xí)的教育方式，具有其他教育形式不可替代的作用——讓受教育者從學(xué)習(xí)客體轉(zhuǎn)變?yōu)閷W(xué)習(xí)主體。在提倡終身教育的時(shí)代背景下，自我教育是現(xiàn)代人儲(chǔ)備知識(shí)、提升能力不可或缺的一種教育與學(xué)習(xí)方式。

分別取2 mL菌株J-5的菌懸液加入到葡萄糖含量為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/100 g的不同固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。每組3 個(gè)平行，料水比1∶4（m/V）、35 ℃培養(yǎng)6 d，測其酶活力。

1.3.2 固體發(fā)酵產(chǎn)酶條件的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理[16]，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料水比、碳氮比、初始pH值3 個(gè)關(guān)鍵因素作為自變量[17-18]，以-1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平，以CMCase酶活力為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，各因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平編碼Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

1.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)化組合，降解大蒜皮，測定其CMCase酶活力。

1.3.4 指標(biāo)測定

1.3.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照文獻(xiàn)[19]方法。取9 支洗凈烘干的25 mL具塞刻度試管，分別加入1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，再分別向各試管中加入蒸餾水至溶液總體積為2.0 mL，配制成一系列不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，搖勻后沸水浴5 min。取出立即流水冷卻后用蒸餾水定容至25 mL，充分混勻。用723分光光度計(jì)在波長520 nm處，以1號(hào)試管溶液作為空白對照，調(diào)零點(diǎn)，測定其他各管溶液的光密度值并記錄結(jié)果。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的光密度值為縱坐標(biāo)，繪制曲線即為葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得光密度值（y）與葡萄糖質(zhì)量（x）的線性關(guān)系為：y＝0.618 6x-0.000 8。

參照文獻(xiàn)[21-22]方法。取4 支洗凈烘干的25 mL具塞刻度試管，編號(hào)后各加入1.0 mL酶液和1.5 mL pH 4.4、5 g/L羧甲基纖維素鈉的檸檬酸緩沖液，1號(hào)試管加入1.5 mL的DNS溶液鈍化酶活性，作為參比溶液。50 ℃水浴保溫30 min。取出后立即向2、3、4號(hào)試管各加入1.5 mL DNS溶液終止酶反應(yīng)，充分搖勻，沸水浴5 min，取出立即流水冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻，參比溶液調(diào)零，波長520 nm處測2、3、4號(hào)試管的光密度值，求平均值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查出對應(yīng)的葡萄糖含量，酶活力計(jì)算見下式：

式中：m1為葡萄糖質(zhì)量/mg；V1為酶液定容體積/mL；V2為反應(yīng)液中酶液的加入量/mL；m2為樣品質(zhì)量/g；t為時(shí)間/h；5.56為l mg葡萄糖微摩爾數(shù)（1 000/180＝5.56）。

1.3.4.3 殘余還原糖含量的測定

取4 支洗凈烘干的25 mL具塞刻度試管，編號(hào)后向2、3、4號(hào)試管中各加入1.0 mL酶液和1.5 mL DNS溶液，1號(hào)中只加DNS作為參比溶液，充分搖勻沸水浴5 min，取出立即流水冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻，參比溶液調(diào)零，波長520 nm處測2、3、4號(hào)試管的光密度值，求平均值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查出對應(yīng)的葡萄糖含量[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 氮源對CMCase產(chǎn)量的影響

圖1 氮源種類對CMCase產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of nitrogen source on CMCase production

由圖1可知，在上述3 個(gè)組合中，蛋白胨為唯一氮源時(shí)，產(chǎn)CMCase量最少，CMCase酶活力只有21.145 U/g；蛋白胨和硫酸銨同時(shí)做氮源時(shí)，CMCase酶活力略有提高；無機(jī)氮源硫酸銨為唯一氮源時(shí)，CMCase酶活力最高為30.309 U/g。結(jié)果表明，菌株J-5受氮源影響不大，均能有效的利用，且無機(jī)氮源更有利于CMCase酶的合成。硫酸銨價(jià)格低，更適合工業(yè)化生產(chǎn)，因此選用硫酸銨為唯一氮源。

2.1.2 料水比對CMCase產(chǎn)量的影響

圖2 料水比對CMCase產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of solid-to-liquid ratio on CMCase production

由圖2可知，隨著水含量的增大CMCase酶活力逐漸提高，在料水比為1∶4（m/V）時(shí)，達(dá)到最大值。當(dāng)料水比超過1∶4（m/V）時(shí)CMCase酶活力出現(xiàn)下降趨勢，由34.080 U/g下降到19.157 U/g。這是因?yàn)樗俏⑸锷L的必要條件之一，大蒜皮吸水膨脹軟化，有利于降解纖維素菌株J-5的生長和代謝。但當(dāng)水含量過大時(shí)導(dǎo)致一些營養(yǎng)物質(zhì)（某些纖維素和無機(jī)離子）的濃度下降，從而使CMCase酶活力產(chǎn)生下降趨勢。因此在固體發(fā)酵培養(yǎng)中，確定一個(gè)最佳的料水比對產(chǎn)酶尤為重要。

2.1.3 碳氮比對CMCase產(chǎn)量的影響

圖3 碳氮比對CMCase產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of carbon/nitrogen ratio on CMCase production

由圖3可知，隨著碳氮比的逐漸增大CMCase酶活力逐漸提高，在碳氮比約為20∶1（m/m）時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)碳氮比大于20∶1（m/m）時(shí)，其CMCase酶活力開始降低，由20∶1（m/m）時(shí)的33.367 U/g降為40∶1（m/m）時(shí)的18.245 U/g。這是由于碳氮比直接影響菌株生長和代謝，一般降解纖維素的菌株對氮源的需求量有一個(gè)很低的最佳值。

2.1.4 初始pH值對CMCase產(chǎn)量的影響

圖4 初始pH值對CMCase產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of initial medium pH on CMCase production

由圖4可知，隨著初始pH值的增大CMCase酶活力逐漸提高。CMCase酶活力在初始pH值為4.0時(shí)達(dá)到最大值，在pH 3.0～4.0時(shí)變化較顯著，由30.032 U/g增加到37.099 U/g。當(dāng)初始pH值大于4.0時(shí)CMCase酶活力降低比較明顯，其后隨pH值增大一直緩慢的降低。說明了CMCase酶為一種酸性酶，偏向于較酸的環(huán)境，更有利于該菌株CMCase酶的生產(chǎn)代謝和積累，最適發(fā)酵pH值為4.0。

2.1.5 發(fā)酵溫度對CMCase產(chǎn)量的影響

圖5 發(fā)酵溫度對CMCase產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of fermentation temperature on CMCase production

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高CMCase酶活力逐漸提高。CMCase酶活力在發(fā)酵溫度為38 ℃時(shí)達(dá)到最大值，約33.25 U/g。當(dāng)發(fā)酵溫度為41 ℃時(shí)，CMCase酶活力較38 ℃時(shí)的顯著降低，降至18.35 U/g。每個(gè)菌種都有最適產(chǎn)酶的發(fā)酵溫度，在此溫度條件下該菌株能更好地進(jìn)行胞外酶的生產(chǎn)和積累。該菌種最適宜發(fā)酵溫度為38 ℃，明顯高于常見產(chǎn)CMCase霉菌適宜的發(fā)酵溫度。

2.1.6 發(fā)酵時(shí)間對CMCase產(chǎn)量的影響

圖6 發(fā)酵時(shí)間對CMCase產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of fermentation duration on CMCase production

由圖6可以看出，在144 h以前，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長CMCase酶活力逐漸提高。在72 h，CMCase酶活力處于較低的水平，合成和代謝比較緩慢。發(fā)酵至72～96 h，CMCase酶活力變化較為明顯，由12.759 U/g增長到20.192 U/g。發(fā)酵時(shí)間至120 h時(shí)，CMCase酶活力為32.27 U/g，酶的合成處于加速時(shí)期。在144 h時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，約37.818 U/g。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于144 h時(shí)CMCase酶活力開始降低。因此控制發(fā)酵時(shí)間尤為重要，這是因?yàn)槊總€(gè)菌種都有生長周期，要先測定好菌株的生長周期才能更好地找到CMCase積累最多的時(shí)間。

2.1.7 葡萄糖含量對CMCase產(chǎn)量的影響

由圖7可知，在加入少量輔助碳源時(shí)，CMCase酶活力比大蒜皮做唯一碳源時(shí)低，如在含有0.5 g/100 g的葡萄糖時(shí)，CMCase酶活力比不加時(shí)低。在輔助碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)到達(dá)1 g/100 g時(shí)，CMCase酶活力最高達(dá)到31.706 U/g。當(dāng)輔助碳源超過1 g/100 g時(shí)CMCase酶活力出現(xiàn)下降趨勢。這由葡萄糖效應(yīng)引起，即初始的少量葡萄糖被菌體生長利用，一段時(shí)間后，菌體分泌CMCase，此酶分解纖維素生成葡萄糖，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)積累的葡萄糖抑制菌株J-5對CMCase的分泌。也就是說葡萄糖等速效碳源能引起CMCase的阻遏效應(yīng)。因此應(yīng)控制葡萄糖的加入量，使加入的葡萄糖剛好被利用促進(jìn)前期菌種的生長，而又不影響CMCase的合成。

圖7 葡萄糖含量對CMCase產(chǎn)量的影響Fig. 7 Effect of glucose concentration on CMCase production

由因素與指標(biāo)的關(guān)系圖判斷該因素的影響程度：點(diǎn)的分散程度越大，點(diǎn)的高低相差越大，任意兩點(diǎn)的斜率越大，則影響越顯著[24]。采用以上原則，根據(jù)關(guān)系圖上點(diǎn)的散布情況來分析這些因素的影響程度?？梢缘贸觯禾嫉扔绊懽铒@著，初始pH值次之，料水比第三，其他在有效因素區(qū)間影響不顯著。由此采用響應(yīng)面分析料水比、碳氮比和初始pH值3 個(gè)因素對產(chǎn)酶的影響。

2.2 產(chǎn)酶條件的響應(yīng)面設(shè)計(jì)與方差分析

選用A（料水比）、B（碳氮比）、C（初始pH值）3 個(gè)因素為自變量，CMCase酶活力為因變量，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及CMCase酶活力結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and responses of Box-Behnken design

2.2.1 響應(yīng)面方差分析

用Design-Expert程序?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析見表3，并得出回歸模型（1）：

由方差分析可知：模型的校正決定系數(shù)R2Adj為0.942 2，變異系數(shù)為4.58%，說明該模型只有0.597 1的變異不能由該模型解釋，因此，該模型的擬合性良好。模型的F值為30.00，P值小于0.000 1，表明該模型受外界干擾的幾率只有0.01%，是極其顯著的，模型擬合程度良好，自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，可用于CMCase產(chǎn)量的預(yù)測和分析。

A、B、A2、B2和C2的P值均小于0.01說明其對CMCase產(chǎn)量影響極其顯著；而交互項(xiàng)AB、BC和AC對CMCase產(chǎn)量的影響都不顯著。

由表3的P值可以得知，在所選的各因素范圍內(nèi)，對CMCase產(chǎn)量的影響排序?yàn)椋築（碳氮比）＞A（料水比）＞C（初始pH值）。對回歸模型的回歸方程進(jìn)行優(yōu)化得式（2）：

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for regression equation

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

通過Design-Expert軟件繪制響應(yīng)面曲線圖與等高線圖進(jìn)行分析可進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果見圖8～10。

圖8 碳氮比和料水比對CMCase酶活力的影響Fig. 8 Effects of carbon/nitrogen ratio and solid-to-liquid ratio on CMCase production

由圖8可知，碳氮比對產(chǎn)CMCase量的影響較為顯著，CMCase酶活力隨碳氮比的升高先升高再降低。在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，料水比和碳氮比分別在1∶3～1∶4（m/V）和20∶1～30∶1（m/m）范圍內(nèi)時(shí)，CMCase酶活力可以達(dá)到試驗(yàn)中的最大值。

圖9 初始pH值和料水比對CMCase酶活力的影響Fig. 9 Effects of initial medium pH and solid-to-liquid ratio on CMCase production

由圖9可知，初始pH值對CMCase產(chǎn)量的影響較為顯著，CMCase酶活力隨初始pH值的升高先升高再降低。在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，料水比和初始pH值分別在1∶3～1∶3.5（m/V）和3.5～4.0范圍內(nèi)時(shí)，CMCase酶活力可以達(dá)到試驗(yàn)中的最大值。

圖10 碳氮比和初始pH值比對CMCase酶活力的影響Fig. 10 Effects of carbon/nitrogen ratio and initial medium pH on CMCase production

由圖10可知，CMCase酶活力隨碳氮比和初始pH值的升高先升高再降低，碳氮比對CMCase酶活力的影響較初始pH值大。在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，碳氮比和初始pH值分別在20∶1～30∶1（m/m）和3.0～3.5范圍內(nèi)時(shí)，CMCase酶活力可以達(dá)到試驗(yàn)中的最大值。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Design-Expert軟件分析得出3 個(gè)影響因素的最佳組合為：碳氮比25∶1（m/m）、初始pH值3.2、料水比1∶3.25（m/V），該條件下CMCase酶活力預(yù)測值為58.15 U/g。為檢驗(yàn)其可靠性，在該條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，得到CMCase酶活力為57.996 U/g，實(shí)測值與理論值基本吻合，說明響應(yīng)面分析法得到的固體產(chǎn)酶的工藝條件真實(shí)可靠，具有一定使用價(jià)值。

3 結(jié) 論

本研究以菌株J-5為研究對象，接種于以大蒜皮為唯一碳源的產(chǎn)酶固體培養(yǎng)基，單因素試驗(yàn)最佳降解條件為：氮源為硫酸銨、碳氮比20∶1（m/m）、初始pH值4.0、料水比1∶3（m/V）、發(fā)酵溫度38 ℃、發(fā)酵時(shí)間144 h、輔助碳源1 g/100 g。影響菌種產(chǎn)酶的因素較多，響應(yīng)面法可同時(shí)對影響生物產(chǎn)量的因子水平及相互作用進(jìn)行優(yōu)化和評價(jià)，可快速確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[25]。響應(yīng)面試驗(yàn)表明各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：B（碳氮比）＞A（料水比）＞C（初始pH值），最終最佳優(yōu)化條件為：碳氮比25∶1（m/m），初始pH值3.2，料水比1∶3.25（m/V）。此條件下，CMCase酶活力預(yù)測值為58.15 U/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)酶活力為57.996 U/g。研究證實(shí)該菌株J-5對大蒜素等有抵抗作用，可正常生長并高效降解大蒜皮。

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Optimization of Study on Fermentation Conditions of Bacillus J-5 for Degrading Garlic Peel

LIANG Baodong1, WEI Haixiang1, JIANG Shuzhe2, YANG Yongtao1

(1. Department of Life Science and Engineering, Jining University, Qufu 273155, China; 2. College of Life Sciences, Shandong University, Jinan 250013, China)

Response surface methodology was applied to optimize the fermentation conditions of Bacillus J-5 for the production of carboxymethyl cellulase (CMCase). Firstly, the effect of medium components and culture conditions such as nitrogen source, carbon/nitrogen ratio, solid-to-liquid ratio, fermentation temperature, fermentation duration and supplementary carbon source on CMCase activity was examined by the one-factor-at-a-time method. Secondly, carbon/ nitrogen ratio, solid-to-liquid ratio and initial medium pH were selected for the investigation of their effects on CMCase activity as well as the interaction among them by response surface analysis (RSA). The optimal conditions for CMCase production were established as follows: carbon/nitrogen ratio, 25:1 (m/m); initial medium pH, 3.2; solid-to-liquid ratio, 1:3.25 (m/V), fermentation temperature, 38 ℃; fermentation duration, 144 h; and supplementary carbon source concentration, 1 g/100 g. Under these conditions, the predicted value of CMCase activity was 58.15 U/g, agreeing with the experimental value of 57.996 U/g. The high CMCase activity from Bacillus J-5 could effectively degrade garlic peel.

garlic peel; carboxymethyl cellulase; response surface analysis

10.7506/spkx1002-6630-201621034

Q939.97

A

1002-6630（2016）21-0202-07

梁寶東, 魏海香, 姜淑喆, 等. 大蒜皮降解芽孢桿菌屬細(xì)菌J-5發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 202-208.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621034. http://www.spkx.net.cn

LIANG Baodong, WEI Haixiang, JIANG Shuzhe, et al. Optimization of study on fermentation conditions of Bacillus J-5 for degrading garlic peel[J]. Food Science, 2016, 37(21): 202-208. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621034. http://www.spkx.net.cn

2016-01-24

濟(jì)寧市產(chǎn)學(xué)研合作發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014JNKJ02）

梁寶東（1979—），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。E-mail：liangbaodong@126.com

1∶3.25（m/V）、發(fā)酵溫度38 ℃、發(fā)酵時(shí)間144 h、輔助碳源1 g/100 g，此條件下，CMCase酶活力預(yù)測值為58.15 U/g，

實(shí)測值為57.996 U/g。該菌株可產(chǎn)生較高酶活力的CMCase，可有效地降解大蒜皮。