重組畢赤酵母產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

郭文文，陳獻(xiàn)忠，沈微，許菲，楊海泉*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

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重組畢赤酵母產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

郭文文1，陳獻(xiàn)忠1，沈微1，許菲2，楊海泉2*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

果糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.9)是利用蔗糖為底物制備低聚果糖的關(guān)鍵酶。利用前期構(gòu)建的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組畢赤酵母為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。最適發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：裝液量30 mL/250 mL、V(甘油)∶V(甲醇)=1∶20、初始pH為5.5、誘導(dǎo)溫度為30 ℃、初始甲醇濃度為1.0%、后續(xù)甲醇濃度為1.5%、硫酸銨濃度10 g/L、誘導(dǎo)時間為120 h。在優(yōu)化的發(fā)酵產(chǎn)酶條件下，重組果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力達(dá)218.3 U/mL，較優(yōu)化前提高了5倍。

果糖基轉(zhuǎn)移酶；畢赤酵母；發(fā)酵條件；優(yōu)化

低聚果糖(fructooligosaccharides)是一種新型保健食品[1]，可促進(jìn)人體腸道中益生菌的增殖、礦物質(zhì)元素的吸收、抑制有害細(xì)菌和病源菌的生長等[2-3]。近年來，因其優(yōu)越的生理功能而成為國際食品市場中廣泛流行的功能性食品配料[4]。

果糖基轉(zhuǎn)移酶(fructosyltransferase，EC 2.4.1.9)，作為一種合成低聚果糖的酶類，是一種具有轉(zhuǎn)移果糖基活力的水解酶[5]。果糖基轉(zhuǎn)移酶具有廣泛受體活性，能以乳糖、蔗糖為原料，合成果乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖等低聚糖。因此，人們對果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)低聚果糖越來越關(guān)注。微生物來源的果糖轉(zhuǎn)移酶，因其不受季節(jié)限制，極具工業(yè)生產(chǎn)意義[6]。已報道的關(guān)于果糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)主要集中在野生型微生物發(fā)酵、固定化[7]及少量關(guān)于重組酶表達(dá)方面的研究。LATEEF等[8]對黑曲霉(Aspergillusniger)菌株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶分別進(jìn)行了液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶研究。在液態(tài)發(fā)酵過程中，30 ℃發(fā)酵120 h，發(fā)酵至48 h時酶活力達(dá)到最大酶，為24.49 U/mL。A.niger來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中異源表達(dá)，在YPD培養(yǎng)基中30 ℃發(fā)酵48 h后重組果糖基轉(zhuǎn)移酶最高酶活力可達(dá)19.8 U/mL[3]。

在前期研究工作中，我們構(gòu)建了1株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組畢赤酵母(Pichiapastoris)GS-fru-4菌株，并對重組酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測定與分析[9]。本研究對上述已構(gòu)建生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株進(jìn)行了系列發(fā)酵條件優(yōu)化以提高酶的產(chǎn)量，這對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

重組菌株P(guān).pastorisGS-fru-4為實驗室前期構(gòu)建、保藏[9]。

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：1% 酵母提取物、2% 胰蛋白胨、2% 葡萄糖。BMGY培養(yǎng)基：1% 酵母提取物、2% 胰蛋白胨、0.34% YNB、1%硫酸銨、1%甘油、4×10-5g/L 生物素、0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.0)。BMMY培養(yǎng)基：除了用1%甲醇代替甘油外，其余成分均與BMGY相同。

YPD培養(yǎng)基在115 ℃滅菌15 min。BMGY、BMMY培養(yǎng)基均在110 ℃滅菌10 min, 生物素與甲醇均過濾除菌，待滅菌后加入。

1.3 培養(yǎng)方法

將重組P.pastorisGS-fru-4在YPD固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃靜置培養(yǎng)72 h。挑取重組P.pastoris單菌落，接種于BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h。離心收集菌體，轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h補(bǔ)加甲醇使其終體積分?jǐn)?shù)為1%，誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h，停止發(fā)酵。

1.4 酶活定義及測定方法

將發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，收集上清，參照文獻(xiàn)報道方法測定酶活力[10-11]。用pH 5.5的0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制25%的蔗糖溶液為底物750 μL，加入250 μL稀釋合適倍數(shù)的酶液，45 ℃反應(yīng)30 min，沸水浴加熱15 min，終止反應(yīng)。酶活力單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，酶催化蔗糖每分鐘產(chǎn)生1 μmol蔗果三糖所需的酶量為1個酶活單位(U)[12]。

1.5 裝液量對產(chǎn)酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉(zhuǎn)接至不同裝液量的發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL三角瓶裝液量分別為15、20、25、30、35、40、45、50 mL)誘導(dǎo)培養(yǎng)，取樣測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力。

1.6 誘導(dǎo)階段甘油添加對產(chǎn)酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉(zhuǎn)接至分別添加不同濃度(0、0.2%、0.5%、0.7%、1%)的甘油和1%甲醇的發(fā)酵培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，取樣測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力。

1.7 初始pH對產(chǎn)酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉(zhuǎn)接至不同初始pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，取樣測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力。初始pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。

1.8 誘導(dǎo)溫度對產(chǎn)酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，在不同溫度下(28、30、37 ℃)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，取樣測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力。

1.9 甲醇初始添加量對產(chǎn)酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，選用不同的甲醇濃度(0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%)進(jìn)行第一次甲醇誘導(dǎo)，每隔24 h添加1%濃度的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，取樣測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力。

1.10 甲醇添加量對產(chǎn)酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉(zhuǎn)接至不同甲醇濃度(0.5%、1%、1.5%、2%)的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，取樣測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力。

1.11 誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基中硫酸銨的濃度對產(chǎn)酶的影響

將重組P.pastorisGS-fru-4轉(zhuǎn)接至不同硫酸銨濃度(3、5、7、10、12 g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，取樣測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力。

1.12 誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響

采用上述最優(yōu)化培養(yǎng)條件，將重組P.pastorisGS-fru-4轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，每24 h取樣測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力和菌體干重變化情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 導(dǎo)階段裝液量對產(chǎn)酶的影響

在重組P.pastoris誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，溶氧控制是重要的一個因素。由于P.pastoris是好氧微生物，溶解氧濃度對菌體的生長和產(chǎn)物的生成均有較大影響。因此，較高的溶氧條件是提高發(fā)酵效率和產(chǎn)酶的一個重要保證。在搖瓶培養(yǎng)條件下，裝液量對培養(yǎng)基中的溶解氧濃度具有重要影響。實驗中分析了誘導(dǎo)階段不同裝液量對產(chǎn)酶和干重的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)裝液量低于30 mL時，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力和干重逐漸增高。裝液量為30 mL時，重組P.pastorisGS-fru-4發(fā)酵產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力到達(dá)最大，為79.4 U/mL。此時，菌體干重也達(dá)到最高，為5.5 g/L。當(dāng)裝液量大于30 mL時，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力和干重隨著裝液量的增加而逐漸降低。這是因為裝液量過大，會直接導(dǎo)致溶氧不足，進(jìn)而影響菌體生長和果糖基轉(zhuǎn)移酶的分泌表達(dá)。

圖1 裝液量對發(fā)酵產(chǎn)酶及菌體生長的影響Fig.1 Effect of the medium volume on producing fructosyltransferase and cell growth

2.2 誘導(dǎo)階段甘油添加量對產(chǎn)酶的影響

為考察誘導(dǎo)階段甘油添加對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響，在誘導(dǎo)階段改變了單一的甲醇誘導(dǎo)方式，采取了甲醇(M)、甘油(G)混合補(bǔ)料。實驗過程中，每隔24 h分別補(bǔ)加1% (v/v)的甲醇以及0、0.2%、0.5%、0.7%、1.0%的甘油。結(jié)果如圖2所示，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力在G/M=0.5時達(dá)到最大，為82.5 U/mL。但在其他G/M比例條件下，重組P.pastorisGS-fru-4表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力均呈下降趨勢。在G/M比例分別為0、0.2、0.7、1.0時，重組P.pastorisGS-fru-4表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力分別為73.2、76.9、58.3、51.2 U/mL。從圖2可以看出，隨著G/M的增大，重組P.pastorisGS-fru-4菌體干重也逐漸增大。在G/M分別為0、0.2、0.5、0.7、1.0時，重組P.pastorisGS-fru-4的干重分別為5.76、6.89、8.56、9.31、9.78 g/L。這主要是因為甘油的添加能夠提供有利于重組菌株生長所需的碳源和能量，但不宜過量否則會產(chǎn)生底物抑制效應(yīng)[13]。

圖2 甘油添加對產(chǎn)酶及菌體生長的影響Fig.2 Effect of glycerin addition on producing fructosyltransferase and cell growth

2.3 初始pH對產(chǎn)酶的影響

實驗中分析了初始pH對重組P.pastorisGS-fru-4產(chǎn)酶及菌體生長的影響。如圖3所示，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5.5時，重組P.pastorisGS-fru-4產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力最高，達(dá)到92.1 U/mL。發(fā)酵培養(yǎng)基的pH過高或過低時，均導(dǎo)致重組P.pastorisGS-fru-4產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力有所下降。智曉燕等[14]對P.pastoris重組菌表達(dá)白地霉脂肪酶(Geotrichumcandidumlipase，GCL)的初始pH等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最適初始pH為7.0。在該pH條件下，GCL酶活力最高(600 U/mL)，比初始pH 6.0時提高了40%。如圖3所示，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.0時，重組P.pastorisGS-fru-4細(xì)胞干重(DCW)最高，達(dá)到13.1 g/L。但是pH為6.0時，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力為87.1 U/mL，低于pH 5.5時的酶活力。說明pH 6.0更有利于重組P.pastoris菌體生長，卻不利于產(chǎn)酶。

圖3 初始pH對產(chǎn)酶和菌體生長的影響Fig.3 Effect of the initial pH on producing fructosyltransferase and cell growth

2.4 誘導(dǎo)溫度對產(chǎn)酶的影響

溫度主要通過影響發(fā)酵動力學(xué)特性、微生物代謝調(diào)節(jié)機(jī)制、菌體代謝產(chǎn)物合成的方向和發(fā)酵液的理化性質(zhì)等方面，從而影響產(chǎn)物的合成和菌體的生長[15-17]。實驗結(jié)果如圖4所示，重組P.pastorisGS-fru-4菌株發(fā)酵生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適誘導(dǎo)溫度是30 ℃，此溫度下果糖基轉(zhuǎn)移酶最高酶活力為93.2 U/mL。此時重組P.pastorisGS-fru-4細(xì)胞干重達(dá)到最大，為12.0 g/L。這說明重組P.pastorisGS-fru-4在30 ℃時，最適合該重組菌株的生長和生產(chǎn)重組果糖基轉(zhuǎn)移酶。誘導(dǎo)溫度為37 ℃時，重組P.pastorisGS-fru-4細(xì)胞干重和菌株產(chǎn)酶量都有所下降。

圖4 溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶和菌體生長的影響Fig.4 Effect of the temperature on producing fructosyltransferase and cell growth

2.5 誘導(dǎo)階段甲醇添加量對產(chǎn)酶的影響

甲醇濃度過高會使細(xì)胞中毒，且產(chǎn)生的過量過氧化氫也會使細(xì)胞中毒。因此，在誘導(dǎo)初期要控制培養(yǎng)基甲醇的初始濃度，使酵母逐漸適應(yīng)甲醇環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞生長與產(chǎn)酶。實驗中考察了不同初始甲醇添加量對重組P.pastorisGS-fru-4表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響，如圖5所示。

圖5 初始甲醇添加量對產(chǎn)酶和菌體生長的影響Fig.5 Effect of the initial methanol concentration on producing fructosyltransferase and cell growth

在250 mL搖瓶發(fā)酵過程中，當(dāng)初始甲醇添加量為1.0% (v/v)時，重組P.pastorisGS-fru-4表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力最高，達(dá)到94.2 U/mL。但其他初始甲醇添加濃度條件下，重組果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力均會下降。同時，當(dāng)初始甲醇添加量為1.0% (v/v)時，重組P.pastorisGS-fru-4細(xì)胞干重最大，為10.4 g/L。隨著初始甲醇添加量的增加，重組P.pastorisGS-fru-4細(xì)胞干重下降。當(dāng)初始甲醇添加量為2.0% (v/v)時，重組P.pastorisGS-fru-4細(xì)胞干重降為5.0 g/L。

在誘導(dǎo)中后期，這時菌體已經(jīng)適應(yīng)了甲醇環(huán)境，可以適當(dāng)增加甲醇的添加量，實現(xiàn)重組酶過量表達(dá)。研究過程中，考察了誘導(dǎo)階段不同甲醇添加量對重組P.pastorisGS-fru-4表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響。如圖6所示，當(dāng)甲醇添加量控制在1.0%～1.5% (v/v)時，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力較高。但當(dāng)甲醇添加量較高(>1.5%)或較低(< 1.0%)時，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力下降則比較顯著，最多下降30%以上。當(dāng)甲醇添加量為1.5% (v/v)時，重組P.pastorisGS-fru-4誘導(dǎo)產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力最高，達(dá)到101.2 U/mL。同時，甲醇添加量對細(xì)胞生長會造成一定的影響。如圖6所示，甲醇添加量為1.0% (v/v)最有利于重組P.pastorisGS-fru-4細(xì)胞生長，誘導(dǎo)96 h后其干重達(dá)到最大，為8.0 g/L。因此，1.5% (v/v)甲醇添加量更適合重組P.pastorisGS-fru-4表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶，而1.0% (v/v)甲醇添加量更適合重組P.pastorisGS-fru-4菌體生長。

圖6 甲醇添加量對產(chǎn)酶及菌體生長的影響Fig.6 Effect of the methanol concentration on producing fructosyltransferase and cell growth

2.6 誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基中不同硫酸銨添加量對產(chǎn)酶的影響

硫酸銨作為重組P.pastoris菌株在誘導(dǎo)階段的氮源之一，有助于細(xì)胞生長，同時對合成重組蛋白質(zhì)也具有重要意義。實驗中分析了不同硫酸銨濃度對重組P.pastorisGS-fru-4產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響。結(jié)果如圖7所示，不同濃度的硫酸銨添加對重組P.pastorisGS-fru-4產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶具有明顯影響。隨著硫酸銨濃度的增加，重組P.pastorisGS-fru-4產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力逐漸增大，細(xì)胞干重也逐漸增加。當(dāng)硫酸銨濃度為10 g/L時，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力達(dá)到最高，為102.3 U/mL。此時，重組P.pastorisGS-fru-4細(xì)胞干重也達(dá)到最大，為13.3 g/L。

圖7 不同硫酸銨添加量對產(chǎn)酶和菌體生長的影響Fig.7 Effect of the ammonium sulfate concentration on producing fructosyltransferase and cell growth

2.7 誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響

綜合上述優(yōu)化結(jié)果，對誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響進(jìn)行了測定分析。如圖8所示，隨著誘導(dǎo)時間的延續(xù)，重組P.pastorisGS-fru-4菌株發(fā)酵生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力逐漸提高，菌體干重也出現(xiàn)了相應(yīng)趨勢。甲醇誘導(dǎo)120 h時，重組P.pastorisGS-fru-4菌株發(fā)酵生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力達(dá)到最高(218.3 U/mL)，此時P.pastoris細(xì)胞干重為8.7 g/L。在甲醇誘導(dǎo)144 h時，重組P.pastorisGS-fru-4細(xì)胞干重達(dá)到最大(9.7 g/L)，此時果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力下降為94.4 g/L。繼續(xù)誘導(dǎo)發(fā)酵，果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力和細(xì)胞干重都下降，這可能是因為營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的積累、生長空間限制等導(dǎo)致了菌體衰退、老化。

圖8 誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶和菌體生長的影響Fig.8 Effect of inducing time on producing fructosyltransferase and cell growth

3 結(jié)論

P.pastoris是甲醇營養(yǎng)型酵母，能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源進(jìn)行代謝。以甲醇為碳源，P.pastoris會代償性地產(chǎn)生大量的酶。調(diào)控生產(chǎn)醇過氧化氫酶的啟動子也是驅(qū)動P.pastoris外源基因表達(dá)的啟動子。實驗中采用已構(gòu)建可表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組P.pastorisGS-fru-4為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化研究。研究發(fā)現(xiàn)裝液量、甘油:甲醇、pH、溫度、甲醇濃度、硫酸銨濃度等條件對P.pastorisGS-fru-4生產(chǎn)重組果糖基轉(zhuǎn)移酶具有重要意義。其中，獲得的最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：裝液量30 mL、甘油∶甲醇=1∶20、初始pH 5.5、誘導(dǎo)溫度30℃、初始甲醇濃度為1.0%、后續(xù)甲醇濃度為1.5%、硫酸銨濃度10 g/L、誘導(dǎo)時間為120 h。在該最優(yōu)條件下，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力為218.3 U/mL。由實驗結(jié)果可以看出，重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)與P.pastoris菌體的生長基本成正相關(guān)關(guān)系。過高或過低的甲醇濃度均不利于重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)，這主要是因為甲醇濃度過低時碳源不足，菌體生長欠佳影響了產(chǎn)酶量；甲醇濃度過高時，過高的甲醇濃度對菌體細(xì)胞具有毒害作用，影響了細(xì)胞的生產(chǎn)和產(chǎn)酶量。研究結(jié)果對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。

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Optimization of fermentation conditions for fructosyltransferase production by recombinant Pichia pastoris

GUO Wen-wen1, CHEN Xian-zhong1, SHEN Wei1, XU Fei2, YANG Hai-quan2*

1 (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2 (Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Fructosyltransferase (EC 3.2.19) is used in the production of fructooligosaccharides using sucrose as the substrate. A recombinantP.pastorisstrain previously constructed as original strain was optimized to over-express fructosyltransferase. In this study, the optimal fermentation conditions were as follows: medium volume 30 mL/250 mL, glycerol∶methanol=1∶20 (v/v), the initial pH 5.5, inducing temperature 30 ℃, the initial methanol concentration 1.0%, the subsequent methanol concentration 1.5%, ammonium sulfate concentration 10 g/L and inducing time 120 h. Under the optimal condition, the yield of recombinant fructosyltransferase reached 218.3 U/mL, which was 5-fold higher than that before optimization.

fructosyltransferase;Pichiapastoris;fermentation conditions; optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610007

碩士研究生(楊海泉副教授為通訊作者，E-mail: haiquanyang@jiangnan.edu.cn)。

工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))開放課題基金(KLIB-KF201404)

2016-02-25，改回日期：2016-04-13