藍(lán)莓組織RNA提取方法的研究*

余柯達(dá)，葉美娟，陳文榮，朱凱麗，張常晶，郭衛(wèi)東

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

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藍(lán)莓組織RNA提取方法的研究*

余柯達(dá)，葉美娟，陳文榮，朱凱麗，張常晶，郭衛(wèi)東

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

為建立藍(lán)莓組織RNA提取方法，以藍(lán)莓幼果為材料，比較了5種RNA提取方法，建立了改良的十六烷基三甲基溴化銨-乙酸鉀(CTAB-KAc)提取方法，并比較了CTAB-KAc法對(duì)藍(lán)莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實(shí)組織RNA的提取效果．結(jié)果表明：CTAB-KAc法提取RNA的過程只需3 h，藍(lán)莓幼果RNA的A260/A280和A260/A230值分別達(dá)到2.02和2.46，且無基因組DNA污染，RNA產(chǎn)量達(dá)到143.37 μg·g-1；用CTAB-KAc法成功提取了藍(lán)莓成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實(shí)組織的RNA，但是根的RNA提取方法還需優(yōu)化.把上述RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的片段，可滿足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求．

藍(lán)莓；RNA提??；十六烷基三甲基溴化銨-乙酸鉀法；多糖；逆轉(zhuǎn)錄PCR

高質(zhì)量RNA的提取是進(jìn)行藍(lán)莓轉(zhuǎn)錄組、基因芯片及Northern分析等分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵前提．由于多年生木本植物含有較多的多糖和多酚、單寧等次生代謝物，其中:多酚會(huì)與蛋白質(zhì)和核酸形成高分子量復(fù)合物，減少總RNA的得率[1-3];在醇沉步驟中,多糖會(huì)與RNA共沉淀干擾后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄等反應(yīng)[3-4].因此,一些常見的RNA提取方法(如Trizol法與十二烷基硫酸鈉(SDS)法)和用于提取植物RNA的試劑盒提取的總RNA的含量低且質(zhì)量差[5-6]．目前,越橘屬的藍(lán)莓和黑果越桔主要使用LiCl沉淀RNA以分離多糖和DNA，以得到品質(zhì)較高的總RNA[6-8].但是,LiCl沉淀RNA需要過夜，極其耗時(shí)，且不能沉淀小分子RNA，殘留的Li+還會(huì)抑制RNA的反轉(zhuǎn)錄．在提取云杉[9]和酸模[10]等核酸時(shí)用醋酸鹽可有效去除多糖.Lewinsohn等[11]認(rèn)為在提取裸子植物RNA時(shí)在上清液中加入低濃度的乙醇可有效沉淀多糖；而在提取芒果[12]、鐵皮石斛[13]、云杉和白楊[14]RNA時(shí)醋酸鹽和乙醇結(jié)合使用效果更佳．

本研究以藍(lán)莓幼果為實(shí)驗(yàn)材料，綜合比較了5種不同的RNA提取方法，并用其中效果最佳的十六烷基三甲基溴化銨-乙酸鉀(CTAB-KAc)法提取了藍(lán)莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實(shí)中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR，以期為藍(lán)莓不同組織RNA的提取提供有效方法，并為其他木本植物RNA的提取提供借鑒．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藍(lán)莓樣品于2013年3-6月在浙江師范大學(xué)試驗(yàn)基地3年生藍(lán)莓“比洛克西”上取樣，田間采集后立即放入冰盒，回實(shí)驗(yàn)室后用液氮速凍，置-80 ℃超低溫冰箱中備用．本研究以藍(lán)莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料．

本研究所有試劑和離心管等耗材經(jīng)0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理24 h，滅菌烘干后使用；研缽、藥匙等經(jīng)180 ℃烘烤6 h．

1.2 RNA提取方法

1.2.1 CTAB-KAc法

取藍(lán)莓幼果材料0.1～0.2 g于研缽中，用液氮研磨成粉末狀并快速轉(zhuǎn)移至65 ℃預(yù)熱的2 mL離心管(含有0.9 mL CTAB提取液：20 g/L CTAB，20 g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25 mmol/L EDTA，2 mol/L NaCl+30 μLβ-巰基乙醇)中，用渦旋震蕩儀震蕩均勻,于65 ℃水浴中加熱10 min，期間顛倒混勻3次；水浴后7 000 r/min離心5 min；取上清液，加入1/3體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)，混勻后冰浴30 min，再加入700 μLV氯仿∶V異戊醇=24∶1混合試劑，渦旋混勻，4 ℃下12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入500 μL水飽和酚溶液(pH 5.2),混勻后再加入500 μLV氯仿∶V異戊醇=24∶1混合試劑，渦旋混勻，4 ℃下12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入等體積的V氯仿∶V異戊醇=24∶1混合試劑，渦旋混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入等體積的異丙醇,混勻后冰浴沉淀30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；去上清，加入1 mL 75%乙醇溶液洗滌沉淀2次，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min,室溫自然干燥10 min，適量DEPC水溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2 CTAB-EtOH法

將“加入1/3體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)”改為“加入1/5體積的無水乙醇”，其他操作按照CTAB-KAc法進(jìn)行．

1.2.3 CTAB-KAc-EtOH法

將“加入1/3體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)”改為“加入1/5體積的無水乙醇和1/10體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)”，其他操作按照CTAB-KAc法進(jìn)行．

1.2.4 SDS-KAc法

取藍(lán)莓幼果材料0.1～0.2 g于研缽中，用液氮研磨成粉末狀并快速轉(zhuǎn)移至65 ℃預(yù)熱的2 mL離心管中(含有0.9 mL SDS提取液：5 g/L SDS，20 g/L PVP，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25 mmol/L EDTA，0.2 mol/L NaCl+30 μLβ-巰基乙醇)，用渦旋震蕩儀震蕩均勻，室溫放置5 min,然后7 000 r/min離心5 min；其他操作按照CTAB-KAc法,從“取上清液，加入1/3體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)”這步開始進(jìn)行．

1.2.5 Trizol-KAc法

根據(jù)Life Technologies公司提供的操作說明進(jìn)行并適當(dāng)改良:取藍(lán)莓幼果材料0.1～0.2 g于研缽中，用液氮研磨成粉末狀并快速轉(zhuǎn)移至含有1 mL Trizol試劑的2 mL離心管中，充分混勻，室溫放置5 min；加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入1/3體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)，混勻后冰浴30 min，再加入500 μLV氯仿∶V異戊醇=24∶1混合試劑，劇烈混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻后室溫放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；去上清，加入1 mL 75%乙醇溶液洗滌沉淀2次，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，自然干燥10 min，適量DEPC水溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3 CTAB-KAc法提取藍(lán)莓不同組織的RNA

用CTAB-KAc法提取藍(lán)莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實(shí)6種不同器官的RNA．

1.4 測(cè)定方法

用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)藍(lán)莓總RNA的完整度.RNA的含量和純度采用NanoDrop2000C測(cè)定，記錄其濃度、A260/A280和A260/A230的值．

1.5 RT-PCR檢測(cè)

以藍(lán)莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實(shí)6種不同器官的RNA為模板，按TaKaRa公司PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit操作手冊(cè)進(jìn)行cDNA的合成．以上述6種cDNA和藍(lán)莓幼果RNA為模板，并用ddH2O為陰性對(duì)照．根據(jù)藍(lán)莓過氧化氫酶(CAT)基因序列設(shè)計(jì)PCR檢測(cè)所需引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，上游引物CAT-F：5′-ATGGTGGTTGTTGTGATG-3′，下游引物CAT-R：5′-TGATTTCCTTCGTGCC-3′．PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性4 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃保溫10 min．?dāng)U增結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)．

2 結(jié)果與分析

2.1 5種方法提取藍(lán)莓果實(shí)RNA的比較

5種方法對(duì)藍(lán)莓幼果RNA的提取在耗時(shí)方面均為3 h以內(nèi)．除Trizol-KAc法外，其他4種方法從藍(lán)莓果實(shí)中提取的總RNA在異丙醇沉淀離心后為白色沉淀，干燥后為無色沉淀；而Trizol-KAc法在異丙醇沉淀離心后為無色膠狀沉淀．電泳結(jié)果(見圖1)表明：CTAB-KAc法、CTAB-EtOH法、CTAB-KAc-EtOH法和SDS-KAc法均能看到藍(lán)莓果實(shí)RNA的28S，18S和5S rRNA條帶，而Trizol-KAc法幾乎看不到rRNA條帶；CTAB-EtOH法、CTAB-KAc-EtOH法和SDS-KAc法所提RNA中還存在基因組DNA污染，尤其以CTAB-KAc-EtOH法和SDS-KAc法所提RNA中基因組DNA含量最高；RNA含量和質(zhì)量方面，以CTAB-KAc法和SDS- KAc法為最佳，尤其是CTAB-KAc法提取的RNA的28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA條帶的2倍，表明所提RNA無降解且較完整．

1：Trizol-KAc法；2：SDS-KAc法；3：CTAB-EtOH法；4：CTAB -KAc-EtOH法；5：CTAB-KAc法圖1 5種提取方法所得RNA的電泳圖

用NanoDrop2000C測(cè)定5種提取方法所得RNA的產(chǎn)量、A260/A280和A260/A230，結(jié)果見表1．Trizol-KAc法無法從藍(lán)莓果實(shí)中提取出RNA．其他4種方法在RNA產(chǎn)量方面,以CTAB-KAc法和SDS-KAc法最高，均在100 μg·g-1以上．4種方法的A260/A280均為1.90～2.10，A260/A230都在2.0以上，表明無蛋白質(zhì)、酚類和多糖等污染．結(jié)合電泳結(jié)果(見圖1)進(jìn)行綜合分析，提取藍(lán)莓果實(shí)RNA以CTAB-KAc法為最佳．

表1 5種提取方法所得RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量

2.2 CTAB-KAc法對(duì)不同藍(lán)莓組織RNA的提取

用CTAB-KAc法提取了不同藍(lán)莓組織的RNA.由表2可知：CTAB-KAc法在提取藍(lán)莓成熟葉、綠莖和幼果組織RNA時(shí)，RNA產(chǎn)量達(dá)到100 μg·g-1以上，花的RNA產(chǎn)量也在80 μg·g-1以上，且A260/A280為2.00～2.10，A260/A230都在2.30以上，說明無蛋白質(zhì)、酚類和多糖等污染；成熟果的RNA產(chǎn)量?jī)H為18.95 μg·g-1，A260/A280為1.98，A260/A230僅為1.64，可能所得RNA含有多糖等雜質(zhì)；根的RNA產(chǎn)量最低，只有9.36 μg·g-1，且A260/A280和A260/A230僅為1.77和1.44，A260/A280為1.70～2.00，在cDNA合成的可用范圍內(nèi)，但A260/A230過低，說明存在大量的蛋白質(zhì)、酚類和多糖等雜質(zhì)．電泳結(jié)果(見圖2)也與上述結(jié)論一致．

表2 CTAB-KAc法提取藍(lán)莓不同組織中RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量

1：成熟果實(shí)；2：幼果；3：花；4：成熟葉；5：綠莖；6：根
圖2 CTAB-KAc法提取各藍(lán)莓組織RNA的電泳圖

2.3 RT-PCR分析

以CTAB-KAc法提取的6種不同藍(lán)莓組織RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA、藍(lán)莓幼果RNA和ddH2O為模板，用藍(lán)莓CAT基因特異引物CAT-F和CAT-R進(jìn)行PCR，幼果RNA和ddH2O為模板的對(duì)照中沒有擴(kuò)增出條帶，6種不同藍(lán)莓組織的cDNA中，成熟葉、綠莖、花、幼果和成熟果擴(kuò)增出了預(yù)期的約850 bp的CAT基因片段，根沒有擴(kuò)增出任何條帶(見圖3)．由此進(jìn)一步說明CTAB-KAc法對(duì)藍(lán)莓葉、莖、花和不同成熟度果實(shí)提取的RNA質(zhì)量較好，且不存在基因組DNA污染，可以直接用于后續(xù)研究，但對(duì)根的RNA提取有難度．

1:幼果RNA；2:ddH2O；3:成熟果cDNA；4:幼果cDNA；5:花cDNA；6:成熟葉cDNA；7:綠莖cDNA；8:根cDNA；M:Marker 2000
圖3 不同藍(lán)莓組織RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的5種RNA提取方法中，以CTAB-KAc法為最佳．本實(shí)驗(yàn)室目前已將CTAB-KAc法成功地應(yīng)用于番茄、煙草、佛手和香櫞的葉片、花瓣、雌蕊、雄蕊及櫻桃花芽的RNA提取，用該方法提取的各種植物的RNA樣品可用于RT-PCR和熒光定量PCR(結(jié)果未列)．

3 討 論

完整性好、純度高的RNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)．本實(shí)驗(yàn)采用5種方法提取藍(lán)莓幼果RNA，通過比較發(fā)現(xiàn)，將以CTAB為主要成分的RNA提取液和多糖沉淀試劑KAc結(jié)合的CTAB-KAc法是提取藍(lán)莓幼果RNA的最佳方案．多糖是影響藍(lán)莓RNA提取的主要干擾因素.多糖的許多理化性質(zhì)與RNA極其相似，用一般方法很難將它們分開，去除多糖的同時(shí)RNA也會(huì)被部分帶走，造成RNA產(chǎn)量降低[15];且RNA中殘余的多糖還會(huì)抑制后續(xù)基因操作過程中的多種酶反應(yīng)[16]．本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)KAc，EtOH和KAc-EtOH進(jìn)行了比較，以探求最佳的藍(lán)莓多糖去除試劑．結(jié)果顯示：3種試劑獲得RNA的A260/A230值相近，表明在多糖去除能力上3種試劑效果相近；但利用EtOH和KAc-EtOH得到的RNA產(chǎn)量遠(yuǎn)低于KAc(見表1)，且EtOH和KAc-EtOH去除多糖后獲得的RNA中存在基因組DNA污染(見圖1).因此，KAc去除多糖的效果優(yōu)于EtOH和KAc-EtOH．本實(shí)驗(yàn)還分別對(duì)CTAB提取液、SDS提取液和Trizol試劑進(jìn)行了比較，以尋求最佳的RNA提取液．Trizol試劑無法從藍(lán)莓幼果中提出RNA，可能與Trizol試劑所含的酚和異硫腈酸胍等組分的緩沖能力較差有關(guān)[17-18].CTAB提取液比SDS提取液在RNA產(chǎn)量上略優(yōu)，且不存在基因組DNA污染.因此，CTAB提取液是提取藍(lán)莓RNA的最佳提取液.其他植物RNA提取多以SDS等試劑與KAc，EtOH或KAc-EtOH組合的方法所得RNA質(zhì)量較好[9-14]，說明不同植物材料RNA提取的干擾因素不同，使用的RNA提取方法也可能不同[19]．

本實(shí)驗(yàn)從5種方法中篩選出藍(lán)莓RNA提取的最佳方法——CTAB-KAc法，并用該方法對(duì)藍(lán)莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實(shí)的RNA進(jìn)行了提取，其中：對(duì)成熟葉、綠莖、花和幼果組織RNA的提取效果最佳，而成熟果RNA的A260/A280為1.98，A260/A230僅為1.64，可能有多糖等雜質(zhì)污染，5種藍(lán)莓組織的RNA可用于RT-PCR及其他后續(xù)研究；對(duì)根RNA的提取效果最差，不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)．表明CTAB-KAc法并不適于所有藍(lán)莓組織RNA的提取.這與Ainsworth[10]的觀點(diǎn)一致,即：同一種植物不同組織的RNA提取方法會(huì)有很大的差異，主要原因是不同組織中的主要干擾物不同，對(duì)其高質(zhì)量RNA的提取方法需進(jìn)一步優(yōu)化．孫瑩等[6]和Vashisth等[8]用LiCl沉淀RNA的方法對(duì)藍(lán)莓幼果提取得到的總RNA產(chǎn)量約為25 μg·g-1，而本實(shí)驗(yàn)CTAB-KAc法的RNA產(chǎn)量比之高出約110 μg·g-1，在成熟葉、幼莖和成熟果的RNA產(chǎn)量上也比文獻(xiàn)[8]略高或相近．

藍(lán)莓等多年生木本植物在分子生物學(xué)方面的研究目前仍處于起步階段，且尚無高效的RNA提取方法的報(bào)道．使用目前較通用的LiCl法對(duì)木本植物材料進(jìn)行RNA提取，不僅實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)達(dá)20 h，且會(huì)造成小分子RNA的丟失[6,8]．本研究建立的CTAB-KAc法只需0.1～0.2 g實(shí)驗(yàn)材料，用時(shí)3 h，且可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行RNA提取；此外，CTAB-KAc法中用異丙醇沉淀RNA，預(yù)計(jì)還可以用于小分子RNA的提?。瓹TAB-KAc法適用于藍(lán)莓葉、幼莖、花、果實(shí)等各種組織RNA的提取，可為深入進(jìn)行藍(lán)莓分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)．

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

Methods for RNA isolation from blueberry tissues

YU Keda,YE Meijuan,CHEN Wenrong,ZHU Kaili,ZHANG Changjing,GUO Weidong

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

Tissues of blueberry were generally rich in polysaccharides,proteins,and polyphenols,resulting in the difficulties of RNA isolation with both high quantity and quality.To optimize the technology of RNA isolation from blueberry tissues,five methods for RNA extraction from immature fruit of blueberry were evaluated.The results showed that the most efficient technique for RNA isolation from blueberry fruits was the optimized CTAB-KAc-based method.A subsequent experiment showed that the optimized CTAB-KAc-based technique was also efficient in successful RNA isolation from full-expanded leaf,green stem,flower,immature fruit and mature fruit of blueberry,although protocol for roots still needed to be optimized.The method yielded 143.37 μg·g-1high-quality RNA without DNA contamination within 3 h.The ratios ofA260/A280andA260/A230of the total RNA from immature fruit of blueberry were 2.02 and 2.46,respectively.Reverse transcription-PCR confirmed that the isolated RNA was of appropriate quality and integrity for subsequent molecular biology studies.

blueberry; RNA isolation; CTAB-KAc method; polysaccharides; RT-PCR

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.01.011

??2015-03-19；

2015-04-09

浙江省科技計(jì)劃公益技術(shù)研究項(xiàng)目(2013C32074)；浙江省重大科技專項(xiàng)(2013C02004)

余柯達(dá)(1990-)，男，浙江余姚人，碩士研究生.研究方向:分子生物學(xué).通信作者：郭衛(wèi)東.E-mail:gwd@zjnu.cn

S663.9

A

1001-5051(2016)01-060-05