液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測雞蛋中8種氟喹諾酮類藥物殘留*

楊朝琳，黃方取，洪華嫦，周鴻艷

(1.浙江師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.金華市疾病預(yù)防控制中心，浙江 金華 321002)

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液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測雞蛋中8種氟喹諾酮類藥物殘留*

楊朝琳1，黃方取2，洪華嫦1，周鴻艷2

(1.浙江師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.金華市疾病預(yù)防控制中心，浙江 金華 321002)

建立了一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)快速測定雞蛋中8種氟喹諾酮類藥物殘留的方法.樣品經(jīng)磷酸-乙腈提取，冷凍離心，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，初始流動相溶解，然后用正己烷脫脂，有效地去除雜質(zhì)，隨后進(jìn)行LC-MS/MS定性定量分析.8種氟喹諾酮類藥物含量在2～50 μg/kg線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.995 6；添加量在5，10和20 μg/kg時，該方法的加標(biāo)回收率為65.4%～119.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7.52%.該方法的檢出限為0.000 5～0.22 μg/kg，定量限為0.02～0.74 μg/kg，適用于雞蛋中8種氟喹諾酮類藥物殘留的定性和定量檢測.

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；雞蛋；氟喹諾酮；殘留

沙拉沙星(Sarafloxacin)、二氟沙星(Difloxacin)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、恩諾沙星(Enrofloxacin)和培氟沙星(Pefloxacin)等屬于氟喹諾酮類藥物，抗菌譜廣、抗菌活性強，低毒、組織穿透力強，適用于預(yù)防和治療呼吸、消化、泌尿系統(tǒng)的細(xì)菌感染癥狀，目前已被廣泛應(yīng)用于人類、家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中.此類藥物在體內(nèi)消除緩慢，在家禽和水產(chǎn)飼養(yǎng)過程中該類藥物的不合理使用會導(dǎo)致其殘留在動物源性食品中，從而危害人類的健康.歐盟[1]、聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)[2]和我國[3]對動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留量皆有規(guī)定.歐盟規(guī)定了氟喹諾酮類藥物在雞肉、動物肝臟和腎臟中的最高殘留限量，如：恩諾沙星和環(huán)丙沙星為30 μg/kg，沙拉沙星為10 μg/kg[1].目前，動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留問題已引起廣泛的關(guān)注，開展動物源性食品中此類藥物殘留情況的監(jiān)控，保障食品安全已是當(dāng)務(wù)之急.

動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，國家標(biāo)準(zhǔn)有液相色譜法(HPLC)[4]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[5]；文獻(xiàn)報道也較多，有免疫法[6]、薄層色譜法[7]、高效毛細(xì)管電泳法[8]、高效液相色譜法[9]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10].高效液相色譜法是目前應(yīng)用比較普遍的檢測方法，常結(jié)合紫外檢測器(UV)[11]、二極管陣列檢測器(PDA)[12]和熒光檢測器(FL)[13]使用，但熒光或紫外檢測器的抗干擾能力相對較弱，對樣品前處理和色譜分離條件要求高，分析時間較長，能同時檢測的氟喹諾酮類藥物種類較少，不能進(jìn)行定性檢測，要滿足一些藥物殘留限量的檢測要求，尚需提高靈敏度和可信度.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的抗干擾能力強，可一次性檢測多種氟喹諾酮類藥物，靈敏度高、準(zhǔn)確性好.

動物源性食品中雜質(zhì)較多，樣品前處理是檢測氟喹諾酮類藥物過程中一個重要的步驟，包括提取過程和純化過程.動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測多采用有機溶劑提取法，常用的提取純化方法有固相萃取法[14]、液液萃取法[15]、超臨界流體萃取法[16]等，也有微波輔助提取法[17]、加速溶劑萃取法[18]等較為創(chuàng)新的提取純化方法.如:文獻(xiàn)[19]用1%乙酸乙腈溶液為萃取液，采用微波萃取技術(shù)進(jìn)行樣品的前處理，經(jīng)乙腈飽和的正己烷液-液脫脂純化；文獻(xiàn)[20]采用磷酸鹽水溶液提取，HLB固相萃取柱純化；文獻(xiàn)[21]采用磷酸鹽緩沖溶液和乙腈的混和溶液提取，提取液經(jīng)正己烷液-液分配(LLP)除去脂肪后，用C18固相萃取(SPE)柱純化.這些方法處理可得到良好的純化效果，但操作復(fù)雜、實驗成本高.

本研究采用反相液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，同時檢測雞蛋中8種氟喹諾酮類藥物殘留，無需進(jìn)行固相萃取就可達(dá)到較好的純化效果，與國家標(biāo)準(zhǔn)[4]和文獻(xiàn)[22]報道的樣品前處理方法相比，實驗成本低、操作簡單，方法的檢出限、定量限更低，靈敏度提高，選擇性和重現(xiàn)性好，能滿足動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測分析的要求.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

沙拉沙星、二氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、培氟沙星、達(dá)氟沙星、司帕沙星和氧氟沙星均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司.甲醇、乙腈、正己烷(色譜純，Honeywell公司)；甲酸(色譜純，ROE SCIENTIFIC INC化學(xué)公司)；實驗用水為超純水；鹽酸(優(yōu)級純，浙江中星化工試劑有限公司)；硫酸鈉(純度>99.9%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

Agilent 1290超高效液相色譜儀，6460三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；Milli-Q Advantage A10超純水器(Millipore公司)；WH-861渦流混合器(太倉市科教器材廠)；Allegra 64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機(Beckman公司)；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司).

1.2 儲備液和工作液的配制

1)單標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：稱取8種氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，得到1 000 μg/mL單標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，在-20 ℃儲存?zhèn)溆?

2)混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：精確移取8種氟喹諾酮類藥物的1 000 μg/mL單標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各10 μL于同一容量瓶中，以甲醇定容至1 mL，得10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備中間液.再取100 μL上述混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備中間液，用甲醇定容至1 mL，得1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，在-20 ℃儲存?zhèn)溆?

3)混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液：精確移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，用初始流動相定容，逐級稀釋成50，20，10，5和2 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，于4 ℃儲存?zhèn)溆?

1.3 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g雞蛋試樣(已勻質(zhì))于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入100 μL磷酸和10 mL乙腈，渦流混合60 s，超聲提取10 min，以9 600 r/min離心10 min(-15 ℃)，收集上清液于圓底燒瓶中；用10 mL乙腈重復(fù)提取一次；合并上清液，在45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，剩余液體以氮氣緩緩吹干，以1.0 mL初始流動相溶解殘渣，用8 mL正己烷脫脂，重復(fù)3次，棄去正己烷層，下層清液以14 000 r/min離心5 min，上清液供高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定.

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：Eclipse plus C18柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)；柱溫：30 ℃；樣品室溫度：室溫；柱流速：0.30 mL/min；進(jìn)樣體積:10 μL；流動相A為0.2%甲酸水溶液，流動相B為乙腈/甲醇混合溶劑(V乙腈/V甲醇=50/50)；梯度洗脫程序：0～1.0 min，5%流動相B；1.0～3.0 min，5%～20%流動相B；3.0～8.0 min，20%～40%流動相B；8.0～9.5 min，40%～98%流動相B；9.5～10.5 min，98%流動相B；10.5～11.5 min，98%～5%流動相B；11.5～14.5 min，5%流動相B.

質(zhì)譜離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.50 kV；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：11 L/min；霧化氣壓力：3.1×105Pa；鞘氣溫度：380 ℃;鞘氣流量：12 L/min;電子倍增器電壓：200 V.其他參數(shù)見表1.圖1為8種氟喹諾酮類藥物的二級質(zhì)譜圖.

表1 8種氟喹諾酮類藥物的質(zhì)譜條件及相關(guān)參數(shù)

注：*代表定量離子.

運行開始時，色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液中，質(zhì)譜從4.0 min開始采集數(shù)據(jù)至12.5 min結(jié)束，六通切換閥又將色譜柱流出液切換至廢液中.

圖1 8種氟喹諾酮類藥物的二級質(zhì)譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的優(yōu)化

2.1.1 提取條件優(yōu)化

氟喹諾酮類藥物殘留的提取液一般為有機溶劑，常見的提取溶劑有酸化乙腈(V(鹽酸)∶V(水)∶V(乙腈)=1∶1∶250)[23]、磷酸-乙腈[24]、1%乙酸-乙腈[25].本實驗比較了用酸化乙腈、磷酸-乙腈和1%乙酸-乙腈3種溶劑進(jìn)行提取時的回收率，結(jié)果如圖2所示，以磷酸-乙腈的提取效率最高，酸化乙腈次之，1%乙酸-乙腈稍差.

圖2 提取液對8種氟喹諾酮類藥物回收率的影響

圖3 無水硫酸鈉對8種氟喹諾酮類藥物回收率的影響

本實驗也比較了樣品提取時加無水硫酸鈉與不加無水硫酸鈉的提取效果，結(jié)果如圖3所示，加入無水硫酸鈉后環(huán)丙沙星、恩諾沙星、培氟沙星、達(dá)氟沙星和氧氟沙星的回收率降低，沙拉沙星和二氟沙星的回收率有所提高，對司帕沙星的回收率幾乎不影響.考慮方法的簡便性，本文選擇不加無水硫酸鈉的提取方法，即單獨用磷酸-乙腈為提取液.

2.1.2 純化條件優(yōu)化

雞蛋中油脂含量較高，如果處理不干凈，會影響方法的準(zhǔn)確度和結(jié)果的穩(wěn)定性.乙腈提取液中含有許多共萃取物，以脂肪為主，采用高速冷凍離心輔以正己烷脫脂的除脂法，可以有效地去除樣品中的脂肪類干擾物.在低溫狀態(tài)下，脂肪粒以固體狀態(tài)從溶液中析出，未分離的油脂則被正己烷除去，以達(dá)到純化分離的目的.本實驗比較了常溫離心(15 ℃)和冷凍離心(-15 ℃)對8種氟喹諾酮類藥物回收率的影響，結(jié)果如圖4所示，高速冷凍離心能提高環(huán)丙沙星、恩諾沙星、培氟沙星、達(dá)氟沙星和氧氟沙星的回收率，但對沙拉沙星、二氟沙星和司帕沙星的回收率影響不大.因此，本文選擇高速冷凍離心輔以正己烷脫脂的除脂法.

圖4 常溫離心與冷凍離心對8種氟喹諾酮類藥物回收率的影響

2.1.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)的消除

樣品經(jīng)磷酸-乙腈提取，然后冷凍離心輔以正己烷脫脂，得到良好的純化，但仍無法完全消除基質(zhì)效應(yīng).本實驗采用提取后添加[26]的方法評價基質(zhì)效應(yīng)，比較了低濃度(5 μg/kg)和高濃度(20 μg/kg)下的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2.所測定的8種氟喹諾酮類藥物均存在不同程度的基質(zhì)增強效應(yīng)，可能是樣品、樣品提取方法或純化方法不同引起的.本文采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以消除基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響.

表2 8種氟喹諾酮類藥物的基質(zhì)效應(yīng)

2.2 方法學(xué)論證

2.2.1 校正曲線和線性范圍

稱取1.00 g陰性雞蛋樣品，按上述方法處理樣品，得到空白基質(zhì)液，分別加入8種氟喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成2,5,10,20和50 μg/kg的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液.以所得8種氟喹諾酮類藥物的離子峰面積平均值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.表3為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù).由表3可見，8種氟喹諾酮類藥物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2～50 μg/kg時線性良好，線性相關(guān)系數(shù)R均大于0.995 6.

2.2.2 檢出限和定量限

樣品的檢出限(LOD)是以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低點(2 μg/kg)，取信噪比S/N=3和樣品處理過程的稀釋倍數(shù)計算得出；樣品的定量限(LOQ)是以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低點(2 μg/kg)，取信噪比S/N=10和樣品處理過程的稀釋倍數(shù)計算得出.如表3所示，8種氟喹諾酮類藥物的方法檢出限為0.000 5～0.22 μg/kg，定量限為0.02～0.74 μg/kg，達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)[4]和歐盟的要求，適用于大批量樣品的快速篩選和定量測定.

2.2.3 準(zhǔn)確度和精密度

取1.00 g陰性雞蛋樣品，進(jìn)行5,10和20 μg/kg 3個水平的回收率實驗.按照本文建立的方法處理樣品，測定結(jié)果見表3.8種氟喹諾酮類藥物的平均回收率為65.4%～119.6%.以所測各組分的峰面積計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，sr)，衡量方法的精密度，8種氟喹諾酮類藥物的RSD為0.33%～7.52%.因此，本方法的準(zhǔn)確度和精密度均較高.

表3 8種氟喹諾酮類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率和精密度(n=6)

2.2.4 實樣測定

對市場上采集的10份雞蛋樣品進(jìn)行了測定，其中：2份樣品檢出氧氟沙星，含量分別為0.54和3.10 μg/kg；1份樣品檢出環(huán)丙沙星，含量為0.29 μg/kg.

3 結(jié) 論

本文建立了一種用LC-MS/MS快速測定雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的方法，能滿足雞蛋中8種氟喹諾酮類藥物的檢測要求.本方法不使用SPE小柱，并采用基質(zhì)加標(biāo)曲線消除基質(zhì)效應(yīng)，操作簡單，經(jīng)濟(jì)，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，靈敏度高.

[1]European Parliament and Council.Commission Regulation (EC) 508/1999 of 4 March 1999,a amending Annex I of Council Regulation (EEC) No 2377/90 of 26 June 1990 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin food[J].Official Journal of the European Communities，1999，60(2)：16-17.

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

An improved method for determination of eight fluoroquinolones antibiotics in eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry

YANG Zhaolin1，HUANG Fangqu2，HONG Huachang1，ZHOU Hongyan2

(1.CollegeofGeographyandEnvironmentalSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China; 2.JinhuaMunicipalCenterforDiseaseControl&Prevention,Jinhua321002，China)

A method was established for the determination of eight fluoroquinolones antibiotics in egg sample by liquid chromatography tandem mass spectrometry.The sample was extracted with phosphoric acid and acetonitrile.After separated with high speed frozen centrifugation and concentrated with a rotary evaporator,the residue was dissolved with the mobile phase and then defatted withn-hexane.It was then analyzed with LC-MS.The linear ranges were from 2 to 50 μg/kg with the correlation coefficients above 0.995 6 μg/kg for all the 8 fluoroquinolones.The average recoveries of 8 fluoroquinolones were 65.4%～119.6% at three spiked level:5,10,20 μg/kg with the RSD lower than 7.52%.The limit of detection was of 0.000 5 μg/kg to 0.22 μg/kg.The limit of quantification was of 0.02 μg/kg to 0.74 μg/kg.The method could be applied to accurate qualitative and quantitative detection of the eight fluoroquinolones in the eggs.

liquid chromatography tandem mass spectrometry; egg; fluoroquinolone; residues

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.01.010

??2015-04-08；

2015-10-22

國家自然科學(xué)基金資助項目(KYZKY11132)；金華市科技局項目(2014-3-030)

楊朝琳(1991-)，女，山東青島人，碩士研究生.研究方向：地理環(huán)境與污染控制.通信作者：洪華嫦.E-mail:huachang2002@163.com

O657.7+2

A

1001-5051(2016)01-053-07