三氯化鋁比色法測定毛酸漿果中總黃酮的研究

李世燕，閆公昕，牛廣財，魏文毅，王鶴霖

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶163319）

三氯化鋁比色法測定毛酸漿果中總黃酮的研究

李世燕，閆公昕，牛廣財，魏文毅，王鶴霖

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶163319）

采用三氯化鋁比色法對毛酸漿果中總黃酮的含量進行測定，建立一種測定毛酸漿果中總黃酮含量的方法。結(jié)果表明，以蘆丁為標準品，通過全波段掃描確定標準品的最大吸收波長為370 nm。標準曲線的回歸方程為y=15.814x+0.001 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，在0～0.02 mg·mL-1范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系。此測定方法的平均加標回收率為101.12%，穩(wěn)定性、精密度以及回收率的相對標準偏差（RSD）分別為1.12%、1.32%、1.78%，方法檢出限為0.4 mg·L-1。該方法可以用于毛酸漿果中總黃酮含量的測定。

三氯化鋁比色法；毛酸漿；總黃酮

毛酸漿（Physalis pubescens L.）是茄科酸漿屬一年生草本植物，別名黃菇娘、洋菇娘。其大多數(shù)分布在美洲熱帶及溫帶地區(qū)，少數(shù)分布在歐亞大陸及東南亞［1］。毛酸漿成熟后可以直接食用，果實皮薄汁多，果味清甜，營養(yǎng)豐富，除含有生物堿類、甾體類、脂類、黃酮類、有機酸類等［2］，還含多種維生素、微量元素和人體需要的氨基酸［3-4］。毛酸漿具有解除疲勞、消除肌肉疼痛、降低血壓、預(yù)防動脈硬化和心血管疾病的發(fā)生和保護皮膚等作用［5］。因此，毛酸漿屬于純天然、高營養(yǎng)的綠色食品，被作為一種很有開發(fā)價值的資源備受食品研究人員的關(guān)注［6］。

黃酮類化合物具有多種生理活性，如抗氧化作用、抗微生物、螯合金屬離子、保護DNA、抑制腫瘤等作用［7］。因此，食物類黃酮物質(zhì)的生物學作用及其機制的研究已成為當今營養(yǎng)與食品科學研究領(lǐng)域內(nèi)熱點之一［8］。目前，比色法測定總黃酮的方法以其操作簡單、結(jié)果準確可靠等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中的質(zhì)量控制，并已被我國藥典收錄［9］。但是，不同植物黃酮類組成不同，其適宜的測定方法也有所區(qū)別。目前還未見有關(guān)毛酸漿果中總黃酮含量測定方法的研究，所以，建立一種具有指導意義的毛酸漿中總黃酮測定方法是必要的，采用三氯化鋁比色法對毛酸漿果中總黃酮的含量進行測定，以期建立了一種測定毛酸漿果中總黃酮含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標準品，sigma公司出品；毛酸漿，購于黑龍江省大慶市農(nóng)貿(mào)市場；三氯化鋁，分析純，天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；醋酸鈉，分析純，天津市永大化學試劑有限公司；冰醋酸，分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司；亞硝酸鈉，分析純，天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；九水合硝酸鋁，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，天津市大茂化學試劑廠；甲醇，分析純，天津市大茂化學試劑廠；實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1100型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器；Exploter分析天平，奧豪斯儀器上海有限公司制造；Seven-Multi型pH綜合測試儀，梅特勒-托利多（上海）制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蘆丁標準品溶液的制備

精確稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標準品10 mg置于100 mL的容量瓶中，加適量甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度線，充分搖勻，配成0.1 mg·mL-1的蘆丁標準溶液，備用。

1.3.2 樣品處理

取100.00 g毛酸漿果破碎榨汁，將破碎后的毛酸漿原漿離心（4 000 r·min-1，15 min），得到澄清的毛酸漿果汁樣品，備用。

1.3.3 最大吸收波長的選擇

準確量取蘆丁對照品標準溶液和毛酸漿果樣品溶液各1 mL置于25 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液4 mL，混勻，然后加入pH=5.5的HAc-NaAc緩沖液5 mL，用水定容至刻度線，混勻，放置20 min［10］顯色，同時制備空白液。在紫外分光光度計上300～500 nm進行全波長掃描，確定反應(yīng)體系的最大吸收波長。

1.3.4 顯色條件的影響

（1）AlCl3加入量的影響。精密量取5份1 mL的毛酸漿樣品溶液于25 mL容量瓶中，分別加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液2，4，6，8，10 mL，然后加入pH=5.4的HAc-NaAc緩沖液5 mL，用水定容至刻度線，混勻，放置20 min。以AlCl3溶液加入量為橫坐標，吸光度值A(chǔ)為縱坐標繪圖，研究AlCl3溶液加入量對顯色反應(yīng)的影響。

（2）pH值的影響。精密量取5份1 mL的毛酸漿樣品溶液于25 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液4 mL，然后分別加入pH值分別為4.8，5.0，5.2，5.4，5.6的NaAc-HAc緩沖液5 mL，顯色20 min。以pH值為橫坐標，吸光度值A(chǔ)為縱坐標繪圖，研究pH值對顯色反應(yīng)的影響。

（3）顯色時間的影響。精密量取5份1 mL的毛酸漿樣品溶液于25 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液4 mL，然后加入pH=5.4的NaAc-HAc緩沖液5 mL，分別顯色5，10，15，20，25 min。以顯色時間為橫坐標，吸光度值A(chǔ)為縱坐標繪圖，研究顯色時間對顯色反應(yīng)的影響。

1.3.5 標準曲線的繪制及其回歸方程的建立

精密移取蘆丁標準液0，1，2，3，4，5 mL分別置于25 mL容量瓶，按1.3.4項最優(yōu)方法顯色，以不加蘆丁標準液的溶液為空白參比。用紫外-可見分光光度計在370 nm處測定吸光度值，每個濃度平行測定3次，取平均值。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗

準確吸取1 mL毛酸漿果汁樣品溶液置于25 mL容量瓶中，按1.3.4項下方法顯色，按0，10，20，30，40，50，60 min時間間隔放置后分別在370 nm下測其吸光度值，同時計算RSD值，考察該方法的穩(wěn)定性。

1.3.7 精密度試驗

準確吸取5份1 mL的毛酸漿果汁樣品溶液置于25 mL的容量瓶中，按1.3.4項下方法顯色紅后分別在370 nm下測其吸光度值，同時計算RSD值。

1.3.8 加樣回收率試驗

準確吸取6份1 mL的毛酸漿果汁樣品溶液置于25 mL容量瓶中，每2份1組，共3組，分別加入蘆丁對照品標準溶液1，2，3 mL，按照1.3.4項下方法顯色后分別在370 nm下測其吸光度，同時計算回收率。

1.3.9 檢出限試驗

準確吸取12份試劑空白溶液置于25 mL的容量瓶中，分別在370 nm下測其吸光度值，計算LOD值，考察三氯化鋁比色法測定毛酸漿樣品溶液中總黃酮的方法檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

由圖1可知，蘆丁對照品標準溶液和毛酸漿果樣品溶液顯色后均在波長370 nm處有最大吸收峰值，故選擇370 nm作為檢測波長。

圖1 蘆丁標準品溶液（b）和毛酸漿果樣品溶液（a）的紫外可見光譜圖Fig.1Scanning spectra of standard rutin solution（b）and Physalis Pubescens L.fruit（a）

2.2 顯色條件的影響結(jié)果分析

2.2.1 AlCl3加入量的影響

由圖2可以看出，0.1 mol·L-1的AlCl3溶液加入量在4 mL時，吸光度值最大，說明在370 nm測定波長條件下，AlCl3溶液加入量為4 mL時，AlCl3與毛酸漿樣品溶液中的總黃酮完全絡(luò)合且吸光度穩(wěn)定。隨著加入量的增大，吸光度減小，說明顯色不穩(wěn)定。因此認為0.1 mol·L-1的AlCl3溶液加入量為4 mL時最佳。

圖2 AlCl3溶液加入量對顯色反應(yīng)的影響Fig.2The effect of AlCl3adding amount on color reaction

2.2.2 pH值的影響

由圖3可以看出，隨著NaAc-HAc緩沖液pH值的提高，吸光度值逐漸增大，在pH=5.4時吸光度值最大，說明在該pH值下該體系反應(yīng)完全且生成的絡(luò)合物穩(wěn)定。繼續(xù)增大pH值，吸光度值減小，因為酸性較強時會破壞AlCl3與總黃酮反應(yīng)生成的絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)［11］。因此選擇pH值為5.4的NaAc-HAc緩沖溶液作為顯色條件之一。

圖3 pH值對顯色反應(yīng)的影響Fig.3 The effect of pH on color reaction

2.2.3 顯色時間的影響

由圖4可知，隨著顯色時間的延長，吸光度值逐漸增加，20 min后隨著顯色時間的延長，吸光度值不再變化，說明20 min時顯色完全且在370 nm波長測定條件下顯色比較穩(wěn)定。因此三氯化鋁比色法測定毛酸漿樣品溶液總黃酮含量時，顯色20 min即可。

圖4 顯色時間對顯色反應(yīng)的影響Fig.4The effect of reaction time on color reaction

2.3 蘆丁標準曲線與線性回歸方程

根據(jù)蘆丁在氯化鋁顯色體系中濃度與吸光度值關(guān)系圖可知，蘆丁標準溶液在0.00～0.02 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度值間有良好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)的線性回歸方程為y=15.814x+0.001 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

穩(wěn)定性考察結(jié)果見表1。由表1可知，毛酸漿果樣品溶液在60 min內(nèi)的RSD值為1.12%，表明該方法下的毛酸漿果樣品溶液在60 min內(nèi)顯色較穩(wěn)定。因此，樣品混合均勻后，為了使顯色穩(wěn)定，放置時間不能超過60 min。

表1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 1The results of stability test

2.5 精密度試驗結(jié)果

精密度考察結(jié)果見表2。由表2可知，毛酸漿果樣品溶液吸光度值的RSD=1.32%。說明該方法測定毛酸漿總黃酮含量的精密度結(jié)果在誤差范圍內(nèi)，測定的數(shù)據(jù)準確可信，精密度良好。

表2 精密度試驗結(jié)果Table 2The results of precision test

2.6 加標回收率試驗

加樣回收率試驗結(jié)果見表3。結(jié)果表明，6次測定的平均加樣回收率為101.12%，RSD=1.78%。說明該測定方法得到的回收率良好。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果Table 3The results of recovery test

2.7 檢出限試驗

檢出限試驗結(jié)果見表4。由表4可知，三氯化鋁比色法測定毛酸漿果中總黃酮含量的方法檢出限為0.4 mg·L-1。說明該方法測定毛酸漿果中總黃酮含量的靈敏度較高。

表4 檢出限試驗結(jié)果Table 4The results of detection limit test

3 結(jié)論

三氯化鋁比色法測定毛酸漿果中總黃酮時，樣品的最大吸收波長為370 nm。標準曲線的回歸方程為y=15.814 x+0.001 2，R2=0.999 2，穩(wěn)定性、精密度、回收率的RSD分別為1.12%、1.32%、1.78%，方法的檢出限為0.4 mg·L-1，該測定方法簡便、快捷、操作簡單，可以用于毛酸漿果中總黃酮含量的測定。該方法測得的總黃酮含量為0.442 mg·g-1。

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Determination of Total Flavonoids in Physalis Pubescens L.by Aluminium Trichloride Colorimetric method

Li Shiyan，Yan Gongxin，Niu Guangcai，Wei Wenyi，Wang Helin
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

To establish a method for the determination of total flavonoids in Physalis Pubescens L.，aluminium trichloride Colorimetric method was applied.The experimental results showed that the maximum absorption wave 370 nm was observed with the reference material of rutin.The correlation equation was y=15.814x+0.001 2，the correlation coefficient was 0.999 2，it showed a very good linear relationship within the range of 0.00 mg·mL-1to 0.02 mg·mL-1.The stability，precision and average recovery rate of this method was 1.12%，1.32%and 1.78%by RSD，respectively，and the average recovery rate was 101.12%and the detection limit was 0.4 mg·L-1.This method could be used to determine the total flavonoids in physalis pubescens L..

aluminium trichloride colorimetric method；physalis pubescens L.；total flavonoids

O657.32

A

1002-2090（2016）04-0045-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.011

2015-05-10

黑龍江八一農(nóng)墾大學研究生創(chuàng)新科研項目（YJSCX2015-Y49）。

李世燕（1989-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院2014級碩士研究生。

牛廣財，男，教授，E-mail:gcniu@126.com。