海洋石油烴降解菌的馴化、分離與16SrDNA分子鑒定

鄧保樂

【摘 要】本次研究采用的樣品為取自天津海濱潮間帶的沉積物，由于受到嚴(yán)重的石油烴污染，樣品含油量高達(dá)0.2g/g；采用的碳源為柴油，兩個濃度梯度分別為1%、2%。此次試驗通過逐漸馴化培養(yǎng)樣本中石油烴降解菌群的方式，獲取了降解能力更加出色的石油烴降解菌，具體操作中借助選擇培養(yǎng)基平板涂布法實現(xiàn)了馴化菌群的分離純化，并選取了兩株長勢相對較好的降解菌（下文分別以T1、T2指代）開展了16S rDNA測序鑒定，檢驗結(jié)果為T1與深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）的16S rDNA序列的相似性為89%，菌株T2與施氏假單孢桿菌（Pseudomonas stutzeri）的16S rDNA序列的相似性為99%。

【關(guān)鍵詞】 石油烴 降解菌 馴化 分離 鑒定 16S rDNA

1 引言

油田開發(fā)對緩解石油供應(yīng)壓力有著明顯的積極作用，但針對海上油氣田展開的探測與開發(fā)活動，也使得石油污染問題日漸突出。本次研究采用的樣品為取自天津海濱潮間帶的沉積物，由于受到嚴(yán)重的石油烴污染，樣品含油量高達(dá)0.2g/g；采用的碳源為柴油，兩個濃度梯度分別為1%、2%。此次試驗通過逐漸馴化培養(yǎng)樣本中石油烴降解菌群的方式，獲取了降解能力更加出色的石油烴降解菌，具體操作中借助選擇培養(yǎng)基平板涂布法實現(xiàn)了馴化菌群的分離純化，并選取了兩株長勢相對較好的降解菌（下文分別以T1、T2指代）開展了16S rDNA測序鑒定。

2 材料與方法

2.1 供試沉積物樣品

實驗所用樣品取自受到嚴(yán)重石油污染的天津驢駒河附近灘涂地區(qū)，該處污染面積達(dá)到了200m2，總石油烴含量達(dá)0.2g/g，且被污染時間在2年以上，已經(jīng)有翅堿蓬在污染地區(qū)生長[6]。

2.2 藥品及試劑

柴油為市售0#柴油（密度為0.862g/cm3），主要成分是飽和烷烴與芳香烴。試驗中采用的分析純主要有三種：①磷酸氫二鉀。②磷酸二氫鉀。③磷酸氨。采用的化學(xué)純?yōu)榱姿徼F。十二烷基硫酸鈉。各種限制酶、Taq酶、蛋白酶K、PMD18-T載體、X-gal、IPTG、瓊脂糖、鼎國DNA PCR產(chǎn)物快速回收試劑盒，均購自日本TaKaRa公司。

2.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)液Ⅰ：①濃度梯度為1%（V/V）的柴油。②濃度為0.01 g/L的KH2PO4。③濃度為5.0g/L為（NH4）2SO4。④陳海水，pH為自然值；

富集培養(yǎng)液Ⅱ：濃度梯度為2%（V/V）的柴油；其他構(gòu)成與富集培養(yǎng)液Ⅰ相同；

平板篩選培養(yǎng)基：①濃度為2.0g/L的蛋白胨。②濃度為2.0g/L的（NH4）2SO4。③濃度為0.5g/L的酵母膏。④濃度為0.4g/L的K2HPO4·3H2O。⑤濃度為0.6g/L的KH2PO4。⑥1%的柴油。⑦2%的瓊脂。⑧陳海水，pH為自然值。

2.4 石油烴降解菌的馴化與篩選分離

此次操作在無菌環(huán)境下進(jìn)行，流程依次為：①稱取樣品并將其置于富集培養(yǎng)液Ⅰ內(nèi)，二者質(zhì)量分別為10g、200mL。②150rpm， 26℃，搖床恒溫富集培養(yǎng)一周。③將培養(yǎng)液搖勻，并把其中的50%轉(zhuǎn)移到新鮮富集培養(yǎng)液Ⅰ中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。④依照上述方法培養(yǎng)三次，并把其中50%轉(zhuǎn)移到富集培養(yǎng)液Ⅱ中進(jìn)行三次富集培養(yǎng)。

馴化培養(yǎng)后的培養(yǎng)液采用平板涂布分離法，在平板篩選培養(yǎng)基上對降解菌群進(jìn)行分離純化。分離出的單菌株用斜面培養(yǎng)基，4℃冰箱保存。

3 結(jié)果與討論

3.1 高效石油烴降解菌的馴化與篩選分離

供試沉積物樣品經(jīng)過6次、2個柴油梯度的富集培養(yǎng)后，經(jīng)平板分離，僅得到4株菌落形態(tài)各異的細(xì)菌，其中以兩種分別為乳白色和淡黃色的菌落為主。伴隨每次富集培養(yǎng)，都進(jìn)行了平板分離，每次分離后得到的菌株數(shù)量隨富集次數(shù)而遞減，特別是富集培養(yǎng)液中柴油濃度增加至2%后，篩選到的菌株數(shù)量劇減。另外，隨著富集次數(shù)增加，菌群的石油烴降解能力逐漸增加，其中對柴油組成中主要的14種烷烴的降解效率增加顯著，馴化后期能夠在3天內(nèi)將14種主要烷烴全部降解，而對芳烴組分的降解效果提高不明顯，基本在30%多。馴化培養(yǎng)過程中，每次平板分離到的菌落種類數(shù)、對柴油組分中14種主要烷烴以及芳香烴的降解率見表1。

a表示馴化培養(yǎng)液中柴油濃度為1%；b表示馴化培養(yǎng)液中柴油濃度為2%。

3.2 16S rDNA序列測定

菌株T1和T2在ZoBell 2216E液體培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)后，提取細(xì)菌的總DNA。借助細(xì)菌16S rRNA通用引物對提取的兩株菌株進(jìn)行總DNA提取物PCR擴(kuò)增，即可獲取一約1500堿基對長的片段。根據(jù)PCR結(jié)果可知，擴(kuò)增具有較高的特異性，用來克隆16S rDNA是可行的。16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，通過末端補(bǔ)平磷酸化、連接PMD18-T載體，可轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中，借助藍(lán)白斑篩選可獲得重組質(zhì)粒，通過對其進(jìn)行雙切酶驗證、PCR驗證、KpnⅠ單酶切驗證，即可明確插入片段是否正確。

將所測得序列輸入NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫，用BLAST程序進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T1與深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）的16S rRNA基因序列的相似性為89%；T2與假單孢菌屬（Pseudomonas sp.）很自然地組成一群，尤其與施氏假單孢桿菌（Pseudomonas stutzeri）的16S rRNA基因序列的相似性最大（99%），可以確定T2為假單孢菌屬施氏假單孢桿菌種。

當(dāng)前針對深紅紅螺菌展開的各項報道，往往關(guān)注的是其產(chǎn)氫、固氮作用，而關(guān)于其解烴作用的討論尚不多見，所以還無法肯定T1即為深紅紅螺菌。T2同樣能夠存活于海洋中，對高鹽度環(huán)境表現(xiàn)出了良好的適應(yīng)性，且其在2216E培養(yǎng)基平板上與施氏甲單孢桿菌有著相同的菌落形態(tài)，再加上其單細(xì)胞呈現(xiàn)桿狀、與施氏假單孢桿菌具有相似度99%的16S rRNA序列，可以初步斷定該菌為假單孢菌屬施氏假單孢桿菌種。

4 結(jié)語

（1）利用不同柴油濃度剃度對污染沉積物中的土著降解菌進(jìn)行連續(xù)馴化培養(yǎng)，能夠很好地馴化并篩選土著菌群，可以有目標(biāo)的分選出降解能力強(qiáng)，且能夠用常規(guī)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法培養(yǎng)的降解菌株，以用于石油污染生物修復(fù)；

（2）利用16S rDNA序列比對方法，快速地對分選到地降解菌株進(jìn)行了初步鑒定分類。