療癬卡西甫散提取物對腫瘤壞死因子—α誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響

彭曉明 高莉 霍仕霞 趙茉 閆明

摘要：目的 觀察療癬卡西甫散提取物（LE）對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞增殖及白細(xì)胞介素-8（IL-8）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法 將培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞分為正常組、TNF-α組和LE低、中、高劑量組。除正常組外，其余各組細(xì)胞均給予40 ng/mL TNF-α誘導(dǎo)，各給藥組再分別給予8、40、200 μg/mL LE作用48 h。MTT法檢測HaCaT細(xì)胞增殖；ELISA檢測HaCaT細(xì)胞IL-8和ICAM-1含量；PI和Hoechst33342熒光染色觀察HaCaT細(xì)胞凋亡；半定量RT-PCR檢測HaCaT細(xì)胞IL-8和ICAM-1的mRNA表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，TNF-α組HaCaT細(xì)胞吸光度、IL-8和ICAM-1含量及其mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與TNF-α組比較，LE各劑量組HaCaT細(xì)胞吸光度、IL-8和ICAM-1含量及其mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 LE通過促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡及抑制HaCaT細(xì)胞IL-8和ICAM-1基因表達(dá)，從而維持皮損處HaCaT細(xì)胞的正常水平。

關(guān)鍵詞：療癬卡西甫散提取物；腫瘤壞死因子-α；HaCaT；細(xì)胞增殖；白細(xì)胞介素-8；細(xì)胞間黏附分子-1

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.016

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0067-04

Abstract： Objective To investigate the effects of extracts of Liaoxuan Kaxifu Powders （LE） on proliferation and transcription of IL-8 and ICAM-1 in HaCaT induced by TNF-α； To discuss its mechanism of action. Methods Cultured HaCaT was assigned into normal group， TNF-α group and low-， medium- and high-dose of LE group. Every group was induced by 40 ng/mL TNF-α except for normal group， and then LE groups were treated by different concentrations （8， 40， 200 μg/mL） of LE for 48 h. The proliferation of HaCaT was evaluated by MTT and the apoptosis was detected by inverted fluorescence microscope. Levels of IL-8 and ICAM-1 in HaCaT were assessed by ELISA， and their mRNA expressions was detected by semi-quantitative RT-PCR. Results Compared with normal group， the absorbency of HaCaT and the contents and mRNA expressions of IL-8 and ICAM-1 increased in TNF-α group （P<0.05， P<0.01）； compared with TNF-α group， LE of all dose groups could significantly inhibit the absorbency， decrease the contents and mRNA expressions of IL-8 and ICAM-1 （P<0.05， P<0.01）. Conclusion LE is able to inhibit the proliferation of HaCaT induced by TNF-α， and the mechanism is probably related to promoting apoptosis and down-regulating the gene expressions of IL-8 and ICAM-1， and then maintaining the normal level of HaCaT.

Key words： extracts of Liaoxuan Kaxifu Powders； TNF-α； HaCaT； proliferation； IL-8； ICAM-1

銀屑病是一種免疫系統(tǒng)參與的慢性、炎癥性、復(fù)發(fā)性皮膚病。療癬卡西甫散是維吾爾醫(yī)治療銀屑病的常用復(fù)方，由歐菝葜、菝葜、黃連和芝麻（白）組成，具有燥濕、止癢、清除堿性異常黏液質(zhì)的作用[1]。臨床應(yīng)用及動物實驗表明，療癬卡西甫散對角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，但其作用機(jī)制尚不清楚[2-3]。本實驗觀察療癬卡西甫散提取物（LE）對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞增殖及白細(xì)胞介素-8（IL-8）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 藥物及制備

LE，本實驗室自制，歐菝葜、菝葜、黃連和芝麻藥材購自新疆本草堂中藥飲片有限公司，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所斯拉甫·艾白主任藥師鑒定為正品。將藥材粗粉按處方比例與芝麻混合，加入10倍量80%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h，提取液過濾濃縮后，冷凍干燥至浸膏。然后稱取0.1 g LE，加500 μL DMSO超聲溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2 細(xì)胞株

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT，中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM（高糖）培養(yǎng)基，GIBCO公司；胎牛血清，Hyclone公司；TNF-α、MTT、氨芐青霉素鈉和硫酸鏈霉素，Sigma公司；Hoechst33342/PI Kit，上海美季生物技術(shù)有限公司；人IL-8、ICAM-1 ELISA kit，R&D;公司；TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、DNA Marker、PCR Master Mix、Taq酶，北京天根生物科技有限公司；TRIpure LS Reagent總RNA抽提試劑，北京百泰克生物科技有限公司。超凈工作臺（蘇凈，SW-CJ-1F），倒置熒光顯微鏡（上海光學(xué)六廠，37XAY），CO2培養(yǎng)箱（SANYO，MCO-18AIC），酶標(biāo)儀（ThermoFisher，Multiskan Go 1510），PCR儀（PE，GeneAmp PCR system 9700）。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組、給藥及細(xì)胞增殖檢測

將HaCaT細(xì)胞以5×105個/mL接種于含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、鏈霉素的DMEM（高糖）培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞融合約80%時，0.25%胰酶消化，DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至5×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h后吸棄培養(yǎng)基。將HaCaT細(xì)胞分為正常組、TNF-α組和LE低、中、高劑量組（以DMEM培養(yǎng)基稀釋）。除正常組外，其余各組均給予40 ng/mL TNF-α誘導(dǎo)，同時LE各劑量組分別加入8、40、200 μg/mL LE。將HaCaT細(xì)胞置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱48 h后，加入5 mg/L MTT 20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO 200 μL，充分震蕩溶解后，于酶標(biāo)儀波長490 nm處測定光密度（OD）值。

2.2 ELISA檢測白細(xì)胞介素-8、細(xì)胞間黏附分子-1含量

細(xì)胞給藥處理后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于測定IL-8和ICAM-1。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品并設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔15個，空白孔3個?？瞻卓缀蜏y定孔分別加入40 μL樣品稀釋液，然后吸取測定樣品10 μL加入待測孔，37 ℃溫育30 min，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。然后每孔加50 μL酶標(biāo)試劑（空白孔除外）。37 ℃溫育30 min、洗滌液洗滌5次，拍干。每孔加50 μL顯色劑A和50 μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL后，于酶標(biāo)儀450 nm處測定OD值。之后以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算線性回歸方程，并由線性回歸方程得出測定樣品IL-8和ICAM-1含量。

2.3 倒置熒光顯微鏡觀察HaCaT細(xì)胞凋亡

以DMEM（高糖）培養(yǎng)基調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞濃度至5×105個/mL，鋪至25 cm3培養(yǎng)瓶培養(yǎng)48 h，分組及給藥同“2.1”項。然后以0.25%胰酶消化，收集各組細(xì)胞1×106個以上。室溫1000×g離心10 min，PBS洗滌3次，收集細(xì)胞，并重懸于200 μL PBS中，加入PI和Hoechst33342各20 μL（終濃度分別為50、10 mg/L），于37 ℃孵育10 min。然后1000×g離心10 min，棄上清，加入80 μL PBS，吹打混勻，滴片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上報道基因序列，利用Premier5.0軟件設(shè)計內(nèi)參基因GAPDH及目的基因IL-8和ICAM-1的引物。GAPDH（458 bp）：上游5'-GACCAC AGTCCATGCCATCAC-3'，下游5'-TGAGGTCCACC ACCCTGTTGC-3'；IL-8（292 bp）：上游5'-ATGCCA CTGAAACTGCTTCAAGC-3'，下游5'-GTTCGGATA TTCTCTTGGCC-3'；ICAM-1（185 bp）：上游5'-GAG GGGTCTCAGCAGACTCTT-3'，下游5'-TGCACGTC CCTGGTGATACT-3'。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2.5 半定量RT-PCR檢測白細(xì)胞介素-8、細(xì)胞間黏附分子-1的基因表達(dá)

細(xì)胞分組及給藥同“2.1”項，根據(jù)TRIpure LS Reagent總RNA抽提試劑說明書，提取給藥后HaCaT細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，并將各組RNA濃度調(diào)節(jié)一致。按TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，54 ℃、45 s，72 ℃、45 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min，然后冷卻至4 ℃。吸取10 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。紫外透射儀下觀察結(jié)果并拍照，通過Tannon凝膠成像系統(tǒng)測定條帶光密度值，計算每個樣本IL-8、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平，均以ICAM-1和GAPDH的OD值比值表示。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 療癬卡西甫散提取物對HaCaT細(xì)胞增殖水平及白細(xì)胞介素-8和細(xì)胞間黏附分子-1含量的影響

與正常組比較，TNF-α組HaCaT細(xì)胞OD值及IL-8、ICAM-1含量明顯增加（P<0.01）；與TNF-α組比較，LE各劑量組HaCaT細(xì)胞吸光度及IL-8、ICAM-1含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 療癬卡西甫散提取物對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

正常組和TNF-α組HaCaT細(xì)胞形態(tài)規(guī)整、細(xì)胞核較大，大多被Hoechst33342染成藍(lán)色，且2組壞死細(xì)胞（紅色）數(shù)目差異不明顯。但經(jīng)不同濃度LE作用48 h后，視野中正?；蛟缙诘蛲黾?xì)胞（藍(lán)色）逐漸減少，而被PI紅染的壞死細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。且LE濃度在8～200 μg/mL范圍內(nèi)，其對HaCaT細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)度呈現(xiàn)一定濃度依賴性。結(jié)果見圖1。

4.3 療癬卡西甫散提取物對HaCaT細(xì)胞白細(xì)胞介素-8和細(xì)胞間黏附分子-1基因表達(dá)的影響

與正常組比較，TNF-α組HaCaT細(xì)胞IL-8和ICAM-1 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與TNF-α組比較，LE各劑量組HaCaT細(xì)胞IL-8和ICAM-1 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01），并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。結(jié)果見表2、圖2、圖3。

5 討論

銀屑病的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。維吾爾醫(yī)理論認(rèn)為，該病多見于異常黏液質(zhì)體液人群，人體在咸味異常黏液質(zhì)的影響下，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)異常物質(zhì)增多，并通過血液影響到皮膚組織。然后反復(fù)刺激皮膚、破壞皮膚正常的物質(zhì)代謝，影響皮膚的影響力、攝住力、生長力等，從而導(dǎo)致銀屑病。銀屑病患者皮損病理特征表現(xiàn)為HaCaT過度增殖及分化異?！，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，TNF-α是銀屑病斑塊形成和HaCaT細(xì)胞增殖過程中的首要細(xì)胞因子[4]。本實驗通過40 ng/mL TNF-α誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞，成功模擬獲得銀屑病皮損細(xì)胞異常增殖癥狀。8、40、200 μg/mL LE干預(yù)后，可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖，促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡，且其細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用呈現(xiàn)濃度依賴性。

炎癥前細(xì)胞因子如IL-6和IL-8在銀屑病皮損中過度表達(dá)，可導(dǎo)致銀屑病的病理改變[5-6]。ICAM-1作為一種重要的炎癥因子，不僅可促進(jìn)細(xì)胞間的黏附，還在誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的聚集、活化損傷反應(yīng)中起著重要的作用。在體實驗發(fā)現(xiàn)，抗ICAM-1單克隆抗體能明顯抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而減輕炎癥反應(yīng)[7]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，HaCaT細(xì)胞IL-8和ICAM-1含量及mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，而經(jīng)8～200 μg/mL LE作用48 h后，其可顯著降低HaCaT細(xì)胞IL-8和ICAM-1的生成及mRNA表達(dá)。

綜上所述，LE對TNF-α誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖具有抑制作用，其作用機(jī)制可能與LE促進(jìn)HaCaT凋亡及抑制HaCaT細(xì)胞IL-8和ICAM-1基因表達(dá)水平，進(jìn)而維持皮損處HaCaT細(xì)胞的正常水平相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部“藥品標(biāo)準(zhǔn)”—維吾爾藥分冊（第1版）[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：139.

[2] 張迪，宋洋，蘭嵐，等.療癬卡西甫丸加百癬夏塔熱片治療老年人尋常型銀屑病的臨床觀察[J].中國老年學(xué)雜志，2013，33（16）：4074-4075.

[3] 彭曉明，霍仕霞，吳培培，等.療癬卡西甫散的藥效學(xué)研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（11）：64-66.

[4] 林景榮，劉曉明.銀屑病發(fā)病中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和凋亡與端粒酶的表達(dá)[J].中國醫(yī)師進(jìn)修雜志，2006，29（3）：69-70.

[5] OCKENFELS H M， WAGNER S N， KEIM-MAAS C， et al. Lithium and psoriasis：cytokine modulation of cultured lymphocytes and psoriatic keratinocytes by lithium[J]. Arch Dermatol Res，1996， 22（8）：173-178.

[6] ASADULLAH K， DOCKE W D， VOLK H D， et al. The pathophysiological role of cytokines in psoriasis[J]. Drugs Today（Barc），1999，5（8）：913-924.

[7] CLARK W M， MADDEN K P， ROTHLEIN R， et al. Reduction of central nervous system ischemic injury by monoclonal antibody to inter cellular adhesion molecule[J]. J Neurosurg，1991，75（4）：623- 627.