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    體外高通量評價過敏反應(yīng)模型的建立及其對潛在過敏原異蓮心堿的評價研究

    2016-11-30 01:23:38王莉劉青王石峰俞洋洋孫圣楠蔣俊史新元栗世鈾
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2016年11期
    關(guān)鍵詞:高通量

    王莉 劉青 王石峰 俞洋洋 孫圣楠 蔣俊 史新元 栗世鈾

    摘要:目的 建立體外高通量評價過敏反應(yīng)模型,并對中藥單體化合物進(jìn)行篩選,從而確定其中的潛在過敏原。方法 建立穩(wěn)定表達(dá)MrgX2的高通量藥物篩選細(xì)胞模型。首先將重組質(zhì)粒pmCherry-C1-MrgX2轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293細(xì)胞,通過G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)人MrgX2的細(xì)胞株;再通過MrgX2特異性激動劑C48/80和拮抗劑2-APB檢測細(xì)胞株的功能和穩(wěn)定性,以Z因子確認(rèn)高通量體系的穩(wěn)定性和可靠性。采用上述模型對180個單體化合物進(jìn)行篩選,以EC50、IC50、特異性及毒性確定該激動劑的功能性。結(jié)果 MrgX2細(xì)胞模型對特異性激動劑C48/80和特異性拮抗劑2-APB的EC50和IC50分別為2.7 ?g/mL和46.29 ?mol/L,MrgX2細(xì)胞模型第1代和第20代對激動劑的反應(yīng)基本一致,該模型Z因子為0.78。篩選得到異蓮心堿為陽性激動劑,其功能驗(yàn)證結(jié)果為:EC50為4.5 ?mol/L、IC50為39.47 ?mol/L,只能特異性激動MrgX2受體,且無細(xì)胞毒性。結(jié)論 采用鈣流方法可成功構(gòu)建基于過表達(dá)細(xì)胞系HEK293/MrgX2的體外高通量評價過敏反應(yīng)模型,并且初步確定異蓮心堿為潛在引發(fā)過敏反應(yīng)的過敏原。

    關(guān)鍵詞:MrgX2;過敏反應(yīng)評價方法;高通量;鈣流檢測;異蓮心堿

    DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.013

    中圖分類號:R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1005-5304(2016)11-0051-06

    Abstract: Objective To establish a high-throughput evaluation model for anaphylactic reactions; To screen and identify potential anaphylactogens from TCM monomeric compounds. Methods Cell model of stably expressed MrgX2 was established. Recombinate plasmid pmCherry-C1-MrgX2 was transfected to HEK293 to establish cell line for screening model. MrgX2 agonist and antagonist were used to identify the validation and stability of the cell line. A small library consisting of 180 compounds was profiled by using a cell-based calcium mobilization assay to find novel compounds targeting the MrgX2 receptor. EC50 test, IC50 test, specificity validation and cytotoxicity evaluation were carried out to detect the function of the positive agonist. Results The EC50 of C48/80 to MrgX2 model was 2.7 ?g/mL and the IC50 of 2-APB (evoked by 10 ?g/mL C48/80) was 46.29 ?mol/L. The first generation cell model of MrgX2 was similar to the 20th generation, and the Z factor of MrgX2 cell model was 0.78. In the primary screening for agonist, isoliensinine was identified as a novel agonist targeting receptor MrgX2 with an EC50 of 4.5 ?mol/L and IC50 of 39.47 ?mol/L. Moreover, isoliensinine was validated to activate MrgX2 receptor specifically without cytotoxicity. Conclusion A high-throughput evaluation method for anaphylactic reactions can be established in vitro through calcium mobilization assay. A potential anaphylactogen isoliensinine is identified and validated.

    Key words: MrgX2; evaluation method for anaphylactic reactions; high throughput; calcium mobilization assay; isoliensinine

    隨著中藥臨床應(yīng)用的日益增長,中藥安全性“事件”時有發(fā)生[1],尤其中藥注射劑的臨床安全性問題倍受關(guān)注[2]。目前過敏反應(yīng)評價方法分為體內(nèi)法和體外法。體內(nèi)法存在主觀性強(qiáng)、周期偏長、不適合大規(guī)模藥物篩選等缺點(diǎn)[3];體外法通常具有假陽性率高、人鼠種群的差異性等缺點(diǎn)[4]。因此,建立一種快速、準(zhǔn)確的過敏反應(yīng)檢測方法勢在必行。研究表明,MrgX2受體在過敏和慢性炎癥中發(fā)揮著重要作用[5]。約翰霍普金斯大學(xué)研究人員確定MrgX2受體將是解決藥物過敏反應(yīng)的極其重要的靶點(diǎn)[6]。本研究建立基于過表達(dá)MrgX2的重組細(xì)胞系鈣流高通量篩選方法,并應(yīng)用所建模型對180個中藥化合物進(jìn)行篩選,以期對潛在致敏物質(zhì)進(jìn)行早期預(yù)測。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 藥物與試劑

    重組質(zhì)粒pmCherry-C1-MrgX2,Genewiz;人胚腎HEK-293細(xì)胞,中國科學(xué)院精準(zhǔn)基因組醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS),Gibco BRL;ATP、G418、C48/80、Probenecid、acid red 1、2-氨基乙氧基聯(lián)苯硼酸鹽(2-APB)及DMEM,Sigma-Aldrich;Matrigel基質(zhì),Becton Dickinson;鈣離子指示劑Fluo-4/AM,Molecular Probes;96孔黑壁透明底板,Costar;180個中藥單體化合物(純度>98%),中國科學(xué)院精準(zhǔn)基因組醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;CellTiter-Glo?發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒,Promega。

    1.2 儀器

    FLEX Station Ⅱ熒光成像分析系統(tǒng),Molecular Devices。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建

    HEK293細(xì)胞于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)至狀態(tài)良好,將構(gòu)建的含有抗性標(biāo)記的MrgX2真核表達(dá)質(zhì)粒pmCherry-C1-MrgX2轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后,將細(xì)胞以1∶30、1∶40和1∶50比例稀釋并傳代至6 cm培養(yǎng)皿,培養(yǎng)約2~3 d,待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后,加入終濃度為800 ?g/mL選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。約2周后,直至未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞全部死亡,進(jìn)行單克隆細(xì)胞系的挑選并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。隨后,通過檢測單克隆細(xì)胞對MrgX2特異性激動劑C48/80的鈣流信號進(jìn)行陽性單克隆的篩選,再轉(zhuǎn)入400 ?g/mL G418培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)行下一步研究。

    2.2 鈣流檢測方法

    HEK293/MrgX2(P6-P8)以36 000/孔密度接種于Matrigel包被的96孔黑壁透明底板,置于37 ℃孵箱中培養(yǎng)過夜。測試前移除培養(yǎng)基,每孔加100 ?L loading buffer(含4 ?mol/L Fluo-4/AM和2.5 mmol/L probenecid的HBSS)。細(xì)胞置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)30 min。通過鈣離子指示劑Fluo-4/AM進(jìn)行鈣流檢測,F(xiàn)LEX Station熒光成像分析系統(tǒng)獲得數(shù)據(jù)(λexcitation=485 nm,λemission=525 nm)。于化合物板中配制5×測試濃度的激動劑,通過機(jī)器加樣,瞬時鈣流信號被FLEX Station熒光成像分析系統(tǒng)捕獲,采集數(shù)據(jù)直至80 s。抑制劑檢測采用二次加樣方式,在進(jìn)行鈣流熒光檢測前10 min中加入拮抗劑(5×待測濃度),避光孵育10 min后開始檢測,激動劑采用機(jī)器加樣,并采集數(shù)據(jù)至80 s。為評價高通量篩選體系的穩(wěn)定性和可靠性,需進(jìn)行Z因子檢測,陽性對照(40 ?g/mL C48/80)與陰性對照(0.25%DMSO)在同一96孔板中進(jìn)行鈣流檢測。在進(jìn)行細(xì)胞系穩(wěn)定性的驗(yàn)證時,每隔5代進(jìn)行激動劑C48/80對HEK293/MrgX2激動作用的劑量依賴曲線,并比較EC50的差異性。在進(jìn)行激動劑的初篩時,與陽性對照C48/80比較,激動效應(yīng)超過50%才被初步認(rèn)定為陽性激動劑。在進(jìn)行陽性激動劑EC50與IC50的檢測時,所有濃度均進(jìn)行復(fù)孔檢測。

    2.3 化合物準(zhǔn)備

    用DMSO將中藥化合物溶解,并以36 mmol/L濃度保存。初篩前,用DMSO將化合物從36 mmol/L稀釋至4 mmol/L,拮抗劑2-APB也以4 mmol/L濃度進(jìn)行短暫保存。初篩時,將化合物用HBSS稀釋400倍至終濃度10 ?mol/L(DMSO終濃度為0.25%),陽性對照為10 ?g/mL C48/80(HBSS稀釋),陰性對照為0.25%DMSO。在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)進(jìn)行對包括G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)在內(nèi)的藥物靶體所進(jìn)行的篩選中,均從這個天然產(chǎn)物庫中找到了先導(dǎo)化合物,充分證明了其可用性與多樣性[7-8]。

    2.4 特異性及受體選擇性

    為了檢測陽性激動劑能否使HEK293細(xì)胞系產(chǎn)生鈣流信號值,HEK293被一系列不同濃度的陽性化合物刺激,同時,5 ?mol/L ATP和0.25%DMSO分別用作陽性對照和陰性對照,按照鈣流實(shí)驗(yàn)中激動劑的檢測方法進(jìn)行檢測。

    穩(wěn)定表達(dá)TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、T2R以及ETB受體的重組細(xì)胞系由中國科學(xué)院北京基因組研究所提供。這些細(xì)胞系已經(jīng)過已知激動劑和拮抗劑的驗(yàn)證,確保其功能性和檢測體系的可靠性。這些重組細(xì)胞系以36 000/孔密度鋪于matrigel包被的96孔黑色透明板,置于5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)過夜,應(yīng)用鈣流檢測方法來檢測陽性化合物對這些受體的激動作用,陽性化合物終濃度為10 ?mol/L。HEK293細(xì)胞組作為空白對照。

    2.5 毒性檢測

    應(yīng)用熒光素酶耦合檢測方法檢測陽性化合物異蓮心堿的毒性。HEK293/MrgX2以1000/孔密度接種于96孔板,5%CO2、37 ℃孵箱中過夜培養(yǎng)。第2日,每孔移除20 ?L培養(yǎng)基,并加入不同濃度的化合物(濃度梯度與測定EC50時相同),5%CO2、37 ℃孵箱中孵育2 h,CellTiter-Glo試劑孵育10 min,隨后用Envision2100進(jìn)行細(xì)胞活力的檢測。0.25%DMSO作為陰性對照。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    鈣流結(jié)果轉(zhuǎn)化為相對熒光單位(RFU),RFU最大值用于繪制劑量依賴曲線,EC50、IC50、Z因子由GraphPad Prism軟件獲得。所有數(shù)據(jù)均為3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值,不同組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    4 結(jié)果

    4.1 體外高通量評價過敏反應(yīng)模型構(gòu)建

    4.1.1 穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建 將構(gòu)建的帶有紅色熒光標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pmCherry-C1-MrgX2轉(zhuǎn)染HEK-293 細(xì)胞,經(jīng)G418篩選后共獲得46個單細(xì)胞克隆。用10 ?g/mL陽性激動劑進(jìn)行刺激,通過鈣流方法檢測激活鈣流信號強(qiáng)弱挑選MrgX2高表達(dá)克隆,共挑選得到16株陽性單克隆細(xì)胞系。最終挑選信號值最穩(wěn)定、最強(qiáng)的6號單克隆作為高通量篩選的穩(wěn)定細(xì)胞系,命名為HEK293/MrgX2,轉(zhuǎn)入400 ?g/mL G418進(jìn)行后續(xù)研究。

    4.1.2 細(xì)胞系功能性與穩(wěn)定性驗(yàn)證 為了應(yīng)用HEK/MrgX2重組過表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行MrgX2受體激動劑的篩選,首先應(yīng)通過陽性激動劑C48/80以及拮抗劑2-APB進(jìn)行細(xì)胞系功能性和實(shí)用性驗(yàn)證。由圖1A可知,C48/80對細(xì)胞系具有明顯的激動作用且表現(xiàn)出明顯的劑量依賴效應(yīng),EC50為2.7 ?g/mL,2-APB是 MrgX2的抑制劑,可阻斷其通道的功能,抑制鈣離子的通過。由圖1B可知,其對由C48/80引起的鈣流信號具有明顯的抑制作用且IC50為46.29 ?mol/L,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[6,9]。隨后,為檢測重組細(xì)胞系HEK293/MrgX2的穩(wěn)定性,將HEK293/MrgX2細(xì)胞培養(yǎng)至25代以上,并且同時檢測C48/80在P0、P10、P20代HEK293/MrgX2細(xì)胞的激動作用并計(jì)算EC50,由圖1C可知,得到的EC50值無明顯變化。

    4.1.3 鈣流篩選體系穩(wěn)定性驗(yàn)證 采用Z因子評價篩選體系的穩(wěn)定性。通常Z因子值>0.5時,則該體系適用于高通量篩選。40 ?g/mL C48/80和0.25%DMSO作為陽性對照和陰性對照,HEK293/MrgX2細(xì)胞系進(jìn)行48孔刺激和48孔陰性對照,利用Z因子算法,建立的2個篩選系統(tǒng)Z因子值為0.78,結(jié)果見圖2。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)建立的篩選系統(tǒng)可靠、穩(wěn)定。

    4.2 中藥化合物篩選

    應(yīng)用基于過表達(dá)細(xì)胞系HEK293/MrgX2的高通量篩選模型進(jìn)行180個中藥單體化合物(10 μmol/L)激動效果的評價,與陽性對照C48/80比較,當(dāng)化合物激動效應(yīng)>50%時,可初步判定為陽性激動劑。結(jié)果見圖3。異蓮心堿(isoliensinine)被挑選出來進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證研究。

    4.3 陽性化合物驗(yàn)證

    4.3.1 陽性化合物功能性驗(yàn)證 為獲得陽性激動劑劑量反應(yīng),檢測不同濃度異蓮心堿對HEK293/MrgX2的激動效應(yīng)。結(jié)果顯示,其激動效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴趨勢,且EC50為4.5 ?mol/L;2-APB是MrgX2受體的拮抗劑,用系列濃度2-APB拮抗10 ?mol/L異蓮心堿引起鈣流信號,計(jì)算得到IC50為39.47 ?mol/L。結(jié)果見圖4。

    4.3.2 特異性以及受體選擇性驗(yàn)證 假陰性結(jié)果是高通量篩選的主要問題。若一個化合物能同時激動HEK293/MrgX2細(xì)胞系和HEK293母細(xì)胞系,則這個化合物就被看作假陽性激動劑。ATP可激動絕大多數(shù)細(xì)胞系,它通過激動P2Y受體來產(chǎn)生鈣流信號[10]。為了排除假陽性結(jié)果的可能性,用異蓮心堿作用HEK293母細(xì)胞系,以5 ?mol/L ATP和0.25%DMSO被用作陽性對照和陰性對照。結(jié)果顯示,異蓮心堿對HEK293的作用與陰性對照的結(jié)果無顯著差異,表明異蓮心堿激活的是MrgX2受體,排除了其為假陽性的可能性,見圖5。MrgX2是GPCR大家族的一個成員,為了驗(yàn)證異蓮心堿對MrgX2激動效應(yīng)的特異性,檢測了異蓮心堿對TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、Tas2R以及ETB的激動效應(yīng)。結(jié)果顯示,異蓮心堿對這些GPCR受體無激動效應(yīng)。

    4.3.3 細(xì)胞毒性的驗(yàn)證 為了確定異蓮心堿對HEK293/MrgX2細(xì)胞系是否具有毒性,應(yīng)用酶聯(lián)熒光方法進(jìn)行毒性檢測。不同濃度異蓮心堿作用下細(xì)胞活力與陰性對照組0.25%DMSO比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖6。因此異蓮心堿對HEK293/MrgX2細(xì)胞系的細(xì)胞活力沒有影響,即異蓮心堿無細(xì)胞毒性。

    5 討論

    中藥的過敏反應(yīng)已成為制約中藥發(fā)展和應(yīng)用的重要因素,因此進(jìn)行中藥的質(zhì)量控制顯得尤為重要。目前,中藥質(zhì)量控制中缺乏較為靈敏簡便以及高通量評價過敏反應(yīng)的方法[11]。MrgX2是引發(fā)過敏反應(yīng)重要的潛在靶點(diǎn),在預(yù)測過敏原起到重要作用。因而,在中藥過敏性評價、過敏原篩查中可起到關(guān)鍵作用。

    高通量藥物篩選是發(fā)現(xiàn)特異性配體的一種高效率的手段,保證篩選體系的穩(wěn)定性和可靠性是其關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。由于MrgX2受體可與Gq蛋白耦聯(lián),引起細(xì)胞內(nèi)鈣流的變化,本研究建立了一種基于細(xì)胞內(nèi)鈣流測定的方法來建立篩選模型。基于細(xì)胞的方法可以展現(xiàn)豐富的待測化合物的功能性信息,因此在新藥篩選過程中被廣泛的應(yīng)用。基于flexstation Ⅱ的鈣流篩選方法可以實(shí)現(xiàn)自動加樣以及高通量,大大地提高了新藥發(fā)現(xiàn)的效率[12-13]。研究結(jié)果表明,該方法快速、靈敏、穩(wěn)定性高,適合于高通量篩選。特異性與穩(wěn)定性是高通量篩選模型的基本要求,特異性是陽性化合物對受體的特異性結(jié)合與反應(yīng),而穩(wěn)定性是細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)受體。本研究通過檢測模型對其特異性激動劑C48/80濃度依賴反應(yīng)來確定模型的特異性,繼而通過檢測細(xì)胞在20代之后對配體濃度依賴的反應(yīng)來確定其穩(wěn)定性。Z因子是評價一個篩選方法質(zhì)量的可靠參數(shù),通常來說,Z因子值>0.5時即可判定這個方法體系具有足夠的穩(wěn)定性來進(jìn)行高通量篩選[14]。本實(shí)驗(yàn)Z因子值為0.78,說明此篩選體系具備較高的篩選質(zhì)量。假陽性是高通量篩選的主要問題,為了解決這一問題,采用不含MrgX2受體的HEK293細(xì)胞進(jìn)行陽性化合物異蓮心堿的驗(yàn)證,并采用其余6個GPCR(TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、Tas2R和ETB)對異蓮心堿進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明異蓮心堿是MrgX2的特異性激動劑。

    異蓮心堿是從睡蓮科蓮屬植物蓮成熟種子的綠色幼葉及胚根中分離的一種雙芐基異喳琳生物堿單體[15]。研究表明,異蓮心堿具有改善心血管功能、降壓、抗心律失常、抗心肌缺血、改善急性肺損傷和肺纖維化、抗血小板聚集和抗凝血、抗氧化、清除自由基等功效[16-17]。但是,尚未見到有關(guān)異蓮心堿在免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,異蓮心堿可能會在機(jī)體內(nèi)引發(fā)過敏反應(yīng),為異蓮心堿的安全應(yīng)用提供新的依據(jù)。

    綜上所述,本研究建立了一種體外高通量評價過敏反應(yīng)的方法,并且篩選得到異蓮心堿為潛在的能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過敏反應(yīng)的過敏原。此外,從分子靶點(diǎn)的層面解釋了異蓮心堿對免疫系統(tǒng)的影響。

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