小麥脫水素基因 WDHN1-2的克隆及其表達分析

劉 浩，朱維寧，張大鵬，張林生

(1.西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100； 2.西北大學生命科學學院，陜西西安 710069)

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小麥脫水素基因 WDHN1-2的克隆及其表達分析

劉 浩1，朱維寧2，張大鵬1，張林生1

(1.西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100； 2.西北大學生命科學學院，陜西西安 710069)

為進一步明確小麥脫水素基因 WDHN1-2在逆境條件下的功能，以傘穗山羊草 DHN1基因為探針，通過電子克隆及RT-PCR技術獲得 WDHN1-2基因后對其序列特征進行分析，同時利用基因表達綜合數(shù)據(jù)庫及半定量RT-PCR技術對該基因的表達模式進行解析。結果表明， WDHN1-2基因編碼區(qū)(CDS)長為548 bp，編碼的氨基酸具有脫水素保守序列K、Y和S片段，與山羊草脫水素EMT25371親緣關系最近。WDHN1-2蛋白屬于穩(wěn)定且高度親水蛋白，二級結構以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主；該蛋白在亞細胞中定位的可能性：過氧化物酶體>細胞核>線粒體基質，可能行使轉錄調控的功能。表達模式分析發(fā)現(xiàn)， WDHN1-2基因在小麥開花后22 d的胚乳中表達量最高，在ABA、PEG、NaCl及4 ℃低溫脅迫下表達量均先上升后下降。

小麥；電子克??；脫水素；生物信息學分析；半定量RT-PCR

脫水素，即胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白第二家族蛋白，能夠在植物胚胎發(fā)育晚期以及逆境脅迫(如低溫、干旱和高鹽等)下表達，部分脫水素的表達受到脫落酸 (ABA) 的誘導[1]。脫水素一般由85～574個氨基酸殘基組成，其分子量從9.6～200 kDa不等[2-3]。脫水素富含極性氨基酸和親水性氨基酸(甘氨酸和賴氨酸)，缺乏疏水性氨基酸(色氨酸和半胱氨酸)，具有高度親水性和熱穩(wěn)定性，在90 ℃的水浴中仍可保持活性[4-5]。

根據(jù)脫水素中Y、S 和K 保守片段的組成，將其分為5種亞型：YnSKn、Kn、SKn、YnKn和KnS型[6-8]。其中，富含賴氨酸的K 片段是所有脫水素共有的，由15個氨基酸殘基(EKKGIME/DKIKEKLPG)組成，一般有1～11個拷貝，位于蛋白質C端。這些K片段可以形成兩親性的α-螺旋，通過疏水作用與細胞內膜系統(tǒng)或蛋白的變性位點結合，阻止細胞結構的破壞及蛋白質變性[9-11]。多數(shù)脫水素的Y 片段位于其N端，其保守序列為(V/T)D(E/Q)YGNP，通常有1～3個拷貝，該片段與一些植物和細菌的分子伴侶的核酸結合位點具有同源性，但是Y 片段是否與核酸結合還需進一步的實驗驗證[12]。S片段由成串的絲氨酸組成，可被蛋白激酶磷酸化，使脫水素在信號肽的引導下定位在細胞質或細胞核[13-14]。

電子克隆是隨著基因組計劃和EST計劃的實施而發(fā)展起來的，利用生物信息學手段獲得基因部分或全長cDNA序列，并通過PCR技術進行基因的克隆及驗證[15]。它具有投入低、速度快、針對性強、技術要求低等優(yōu)點[16]。因此，電子克隆技術已成為植物基因工程中獲得新基因的重要手段[17]。本研究以傘穗山羊草脫水素 DHN1基因為探針序列，通過電子克隆及RT-PCR技術獲得 WDHN1-2基因后對其序列特征進行分析，同時利用基因表達綜合數(shù)據(jù)庫及半定量RT-PCR技術對該基因的表達模式進行解析，以期為后續(xù) WDHN1-2基因的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

供試材料為普通六倍體小麥品種“中國春”，由西北農林科技大學生命科學學院提供。挑選籽粒飽滿的小麥種子，蒸餾水沖洗3次后用75%的乙醇浸泡3～5 min，然后用去離子水沖洗乙醇，并浸泡24 h。取出種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿上，加入適量水濕潤，于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光暗周期為16 h/8 h，晝夜溫度為25 ℃/18 ℃，相對濕度為80%)。培養(yǎng)7 d后的小麥幼苗分別于4 ℃、20%PEG6000、800 mmol·L-1NaCl及100 μmol·L-1ABA條件下進行脅迫，并收集脅迫處理0、12、24、36、48、60 h后的小麥葉片，液氮速凍后，置于-80 ℃保存。

1.2 小麥葉片總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

采用Invitrogen公司RNA提取試劑盒提取小麥葉片總RNA，并以此為模版，使用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒，去除基因組DNA，合成單鏈cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小麥基因組DNA的提取

采用Tiangen公司植物基因組DNA提取試劑盒提取小麥基因組DNA。

1.4 小麥脫水素 WDHN1-2基因的克隆

以傘穗山羊草 (Aegilopsumbellulata) 脫水素 DHN1基因 (GenBank: AM180925) 為探針，在小麥EST數(shù)據(jù)庫中Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下載相似度較高的EST序列，采用 DNAMAN進行序列拼接。通過NCBI提供的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線軟件，對電子克隆得到的基因序列進行開放式閱讀框分析，初步確定所拼接序列為小麥 DHN1基因。利用小麥基因組數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Inde) 對接接序列進行Blast分析，并通過Fgenesh軟件 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) 進行基因預測，確?；蛐蛄械臏蚀_性。

利用Primer 5.0對電子克隆獲得的序列進行特異引物設計(上游引物5′-AGTAAGAGGCA AAGATGGAGTT-3′；下游引物5′-AAGCAGC CAGCCGAAGC-3′)，再分別以小麥基因組 DNA和 cDNA 第一條鏈為模版進行PCR擴增。PCR產物回收純化并連接到 pMD18-T載體，陽性克隆送上海生工生物公司進行測序。最后，將測序得到的cDNA序列與電子克隆得到的ORF序列比對，根據(jù)序列相擬度確定擴增序列是否為小麥 DHN1基因序列。

1.5 生物信息學分析

利用ExPASy服務器(http://www.expasy.org/resource)中的ProtParam和ProtScale軟件預測蛋白的理化性質；通過DNAMAN V7和MEGA 5.0軟件進行氨基酸的多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建；利用Psort在線軟件(http://psort.hgc.jp/form.html)對WDHN1-2蛋白進行亞細胞定位預測；通過Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)同源建模軟件預測蛋白質的二級和三級結構；通過ProtFun軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)分析WDHN1-2蛋白的功能；通過PLEXdb基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(http://www.plexdb.org/index.php) Blast搜索 WDHN1-2基因所對應的探針，獲得探針的表達量信息，并通過芯片數(shù)據(jù)在線分析軟件鑒定小麥 WDHN1-2基因在發(fā)育過程中于不同器官中的表達模式。

1.6 WDHN1-2基因的半定量RT-PCR分析

以不同脅迫處理的小麥葉片cDNA為模板，以小麥18s rRNA基因作為內參(上游引物： 5′-CAGCACCGCCAGTGAATAG-3′；下游引物：5′-TGTAGGTGGCAAAGGTCTC-3′)，通過TaKaRa公司的rTaq聚合酶進行PCR擴增，對 WDHN1-2基因進行半定量RT-PCR分析。 WDHN1-2半定量 RT-PCR引物與基因擴增引物一致。

2 結果與分析

2.1 小麥 WDHN1-2基因的克隆結果

通過傘穗山羊草脫水素 DHN1基因在NCBI中Blast得到20條相似度較高的小麥EST序列，利用DNAMAN軟件將這些序列拼接，得到長為1 151 bp的conting。ORF Finder預測可知，該Conting存在長為459 bp的ORF序列，初步明確該基因序列為小麥 DHN1基因。在小麥基因組數(shù)據(jù)庫中對可能的新基因進行Blsat分析，并通過Fgenesh軟件進行基因預測，獲得準確的基因序列。再以小麥cDNA第一條鏈和基因組DNA為模板進行PCR擴增，分別得到1條約500 bp和 550 bp的條帶(圖1)，測序結果表明， WDHN1-2基因的cDNA 全長465 bp，DNA全長548 bp。將測序得到的cDNA序列與電子克隆得到的ORF序列進行比對，發(fā)現(xiàn)序列相似度為100%，說明擴增得到的序列為小麥 DHN1基因序列，故命名為 WDHN1-2基因。 WDHN1-2基因編碼區(qū)序列(CDS)總長548 bp，含2個外顯子(1～189 bp,273～548 bp)和1個內含子(190～272 bp)，編碼154個氨基酸殘基(圖2)。

2.2 WDHN1-2蛋白的生物信息學分析

2.2.1 WDHN1-2蛋白的理化性質

WDHN1-2蛋白分子式為C649H1033N213O220S7，分子量為15 564.00 kDa，理論等電點( pI )為9.52。脂肪族氨基酸指數(shù)為31.17，不穩(wěn)定系數(shù)為25.34，為穩(wěn)定蛋白。親水性氨基酸(甘氨酸和賴氨酸)含量較高，缺乏疏水性氨基酸(色氨酸和半胱氨酸)，總平均親水性值 (GRAVY) 為-1.026，為高度親水性蛋白(圖3、圖4)。

2.2.2 WDHN1-2蛋白的系統(tǒng)進化分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫對WDHN1-2蛋白的氨基酸序列進行BlastP分析，并通過DNAMAN軟件對其進行多重序列比對，結果表明，WDHN1與EMT25371 (山羊草，Aegilopstauschii)、CAJ56059 (圓錐小麥，Triticumturgidum)、AAF01697 (大麥，Hordeumvulgare)、ABO14410 (大麥，Hordeumvulgare)、EMS59889 (烏拉爾圖小麥，Triticumurartu)、CAJ56055 (傘穗山羊草，Aegilopsumbellulata)和EMS58299 (烏拉爾圖小麥，Triticumurartu) 的相似性分別為98.70%、96.64%、95.21%、94.52%、91.89%和96.00%，主要存在4個保守區(qū)域，即1個Y片段、1個S片段和2個K片段(圖2、圖5)。根據(jù)序列比對結果，利用MEGA 5.0對親緣遠近不同的脫水素序列進行系統(tǒng)進化分析(圖6)，結果表明，小麥WDHN1蛋白與山羊草EMT25371脫水素的親緣關系最近。

M: DL2000 marker; 1: cDNA; 2: DNA

2.2.3 WDHN1-2蛋白的二級及三級結構

WDHN1-2蛋白由3種二級結構組成，其中α-螺旋、β-折疊及無規(guī)則卷曲分別占18%、3%和82%，即α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要的二級結構，且α-螺旋的位置主要位于蛋白的K片段保守區(qū)域(圖7)，這與三級結構預測結果(WDHN1-2蛋白含有2 個以K片段為核心的α-螺旋，其余序列為無規(guī)則卷曲)(圖8)相吻合。

圖2 WDHN1-2基因核酸序列及所編碼蛋白的氨基酸序列分析

圖3 WDHN1-2蛋白的氨基酸組成及含量分析

圖4 WDHN1-2蛋白的氨基酸序列親/疏水性預測

2.2.4 WDHN1-2蛋白的亞細胞定位及功能分析

蛋白在特定亞細胞位置才能行使其相應的功能，因此蛋白功能與其亞細胞定位緊密相關，蛋白的亞細胞定位也從一定程度反映了蛋白的功能。通過Psort軟件對WDHN1-2進行預測，結果表明，該蛋白亞細胞定位的可能性：過氧化物酶體(0.635)> 細胞核(0.300)> 線粒體基質(0.100)。通過ProtFun軟件對WDHN1-2的功能進行預測，結果(表1)表明，WDHN1-2蛋白主要參與轉錄調控、生長因子和信號轉導等功能，推測WDHN1-2蛋白可能為轉錄因子。

2.2.5 不同器官中 WDHN1-2基因的表達情況

通過PLEXdb基因表達綜合數(shù)據(jù)庫Blast搜索 WDHN1-2 基因所對應的探針TaAffx.46097.1.S1_at，并在基因芯片數(shù)據(jù)庫 (GEO accession:GSE12508)[19]中獲得探針的表達量。結果(圖9)表明， WDHN1-2 基因分別在小麥種子萌發(fā)期的根、幼苗期的葉、開花之前的雌蕊、開花后22 d的胚芽等器官中表達量均較高，其中，開花后22 d的胚芽中基因表達量最高。

2.3 逆境脅迫下葉片中 WDHN1-2基因的半定量RT-PCR分析結果

采用半定量RT-PCR對 WDHN1-2基因在非生物脅迫下于小麥葉片中的表達模式進行分析，結果(圖10)表明，在 ABA、PEG、NaCl及4 ℃脅迫下 WDHN1-2基因表達量均先上升后下降。ABA、PEG和NaCl脅迫下，其表達量在24 h達到最高；低溫脅迫下，12 h表達量達到最高。

圖5 WDHN1-2蛋白與其他植物脫水素氨基酸序列的多重序列比對結果

圖6 WDHN1-2蛋白與其他植物脫水素蛋白的系統(tǒng)進化分析

波浪線：α-螺旋；箭頭：β-折疊；問號：無規(guī)則卷曲。

Wavy line: Alpha helix; Arrow: Beta strand; Interrogation mark: Random coil.

圖7 WDHN1-2蛋白的二級結構預測

Fig.7 Predicted secondary structure of WDHN1-2 protein

圖8 WDHN1-2蛋白的三級結構預測

表1 WDHN1-2蛋白的主要功能預測

圖9 基因芯片分析不同器官中 WDHN1-2基因表達模式

3 討 論

電子克隆是依托于生物信息學克隆基因的一種技術，隨著基因組計劃和 EST 計劃的實施而逐漸興起，它具有投入低、速度快、針對性強和技術要求低等優(yōu)點[17]。但由于某些基因剪切方式的多樣性及生物大分子結構和功能的復雜性，分析軟件的預測結果通常存在較大偏差，因此通過電子克隆獲得的實驗結果只能作為參考，必須進行試驗驗證。

圖10 不同非生物脅迫下 WDHN1-2基因的表達模式

WDHN1-2蛋白分子量為15.56 kDa，其氨基酸序列中親水性氨基酸(甘氨酸和賴氨酸)含量最高，缺乏疏水性氨基酸(色氨酸和半胱氨酸)，總平均親水性值 (GRAVY) 為-1.026，表明WDHN1-2蛋白為高度親水蛋白。序列比對及系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，WDHN1-2蛋白具有和脫水素家族一致的高度保守區(qū)域 (K、Y 和S 片段)，其中K片段保守域還可以形成兩親性的α-螺旋，并且與山羊草 EMT25371脫水素的親緣關系最近，由此推斷WDHN1-2蛋白與山羊草EMT25371脫水素具有相似的生物功能。以上特征均表明 WDHN1-2屬于YSK2型脫水素。

脫水素能夠在植物胚胎發(fā)育晚期以及逆境脅迫(如低溫、干旱和高鹽等)下大量表達。 WDHN1-2基因在ABA、PEG、NaCl及4 ℃表達量均上升。通過功能預測推斷，WDHN1-2蛋白可能行使轉錄調控的功能，調控下游信號轉導以及逆境響應基因的表達，從而提高植物逆境脅迫下的耐受性[20]；同時，亞細胞定位預測結果表明， WDHN1-2基因存在于細胞核的可能性較大，為此推論提供了間接的證據(jù)。部分YSK2型脫水素已被證明定位在細胞核，行使轉錄調控的功能，如RAB 15等[21]，但是具體的調控機制仍然不清楚。

基因表達綜合數(shù)據(jù)庫是目前最大的且完全開放的高通量分子豐度數(shù)據(jù)庫，主要存儲基因表達數(shù)據(jù)[22-23]。通過該數(shù)據(jù)庫Blast搜索 WDHN1-2基因發(fā)育過程中的表達模式，發(fā)現(xiàn) WDHN1-2基因在小麥開花后22 d的胚芽中表達量最高，這與脫水素胚胎發(fā)育晚期大量表達一致。

本研究對小麥脫水素基因 WDHN1-2的克隆及生物功能的挖掘，為進一步提高小麥逆境耐受性及分子育種提供了新的線索和基礎。

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Cloning and Expression Analysis of Dehydrin Gene WDHN1-2 in Wheat

LIU Hao1,ZHU Weining2,ZHANG Dapeng1,ZHANG Linsheng1

(1.College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2.College of Life Science,Northwest University,Xi’an,Shaanxi 710069,China)

To investigate the function of WDHN1-2 gene in wheat, WDHN1-2 was cloned from wheat in silico and analyzed by bioinformatics using DHN1 gene ofAegilopsumbellulataas the probe. The CDS of WDHN1-2 gene was 548 bp,and the transcript levels of WDHN1-2 reached the highest level at 22 DAP in embryo. Semi-quantitative RT-PCR analysis indicated that transcript accumulation was first increased and then decreased under low temperature,sodium chloride (NaCl),abscisic acid (ABA) and polyethylene glycol (PEG) treatments.WDHN1-2 protein belonged to hydrophilic protein,which had typical features of DHNs that contains one Y segment,one S segment and two K segments. The secondary structure of this protein was mainly composed of alpha helix and random coil. This protein was likely to be located in the peroxisome,nucleus,and mitochondrial matrix,may play a function of transcriptional regulation.

TriticumaestivumL.;Insilicocloning; Dehydrin; Bioinformatics analysis; Semi-quantitative RT-PCR

時間：2016-10-08

2016-04-09

2016-05-21

旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室資助課題(CSBA2015007)；高等學校博士學科點專項科研基金項目(20120204110033)

E-mail：504885033@qq.com

張林生(E-mail:linszhang@nwsuaf.edu.cn)

S512.1；S332.2

A

1009-1041(2016)10-1291-08

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161008.0932.006.html