高效液相色譜法檢測優(yōu)化訶子沒食子酸萃取工藝

李忠琴,林 茂,賴曉健,李秋云,徐繼松,江興龍

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市漁用藥物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

?

·生物工程·

高效液相色譜法檢測優(yōu)化訶子沒食子酸萃取工藝

李忠琴1,2,3,林 茂1,2,3,賴曉健1,2,3,李秋云2,3,徐繼松1,2,3,江興龍1，2，3*

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市漁用藥物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

為優(yōu)化訶子的鞣質(zhì)類抗菌成分的萃取工藝，建立一種定量檢測訶子萃取液中沒食子酸質(zhì)量濃度的高效液相色譜法，其回歸方程為A=92.48C-28.566，沒食子酸質(zhì)量濃度在4～20 μg.mL-1范圍與峰面積呈良好的線性關(guān)系。所用色譜柱為Hypersil ODS ( 4.0 mm×250 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(0.1%磷酸)=4∶96，檢測波長270 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃。同時(shí)利用該方法作為超聲輔助萃取訶子沒食子酸的評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化獲得最佳萃取工藝條件為溶劑60%乙醇，料液比1∶20，溫度50 ℃，萃取時(shí)間80 min。

高效液相色譜；訶子；沒食子酸；萃取

訶子是使君子科植物訶子(TerminaliachebulaRetz.) 的干燥果實(shí)，主要成分為鞣質(zhì)類、多元酚類、黃酮類、三萜類[1]。訶子屬于鞣質(zhì)類中藥材，其中鞣質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)21%～37%，是主要活性成分，也是沒食子酸的重要來源，具有抗菌、收斂、止血等功用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)定量檢測訶子萃取液中的沒食子酸(Gallic acid，GA)，以優(yōu)化訶子的鞣質(zhì)類抗菌成分的萃取工藝，為開展訶子鞣質(zhì)成分對(duì)致病菌的抑制作用研究和開發(fā)鞣質(zhì)類抗菌劑提供參考。選用超聲波輔助萃取技術(shù)，以高效液相色譜法測定萃取液中沒食子酸質(zhì)量濃度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，考察乙醇質(zhì)量濃度、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)因素對(duì)沒食子酸萃取得率的影響，優(yōu)化訶子鞣質(zhì)類成分最佳萃取工藝參數(shù)，為訶子粗提取物的制備及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀(美國安捷倫，Angilent 1100)；冷凍超微粉碎機(jī)(山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司，SQW-601)；超聲破碎儀(南京先歐儀器制造有限公司，XODL-1000N)；多樣品平行蒸發(fā)儀(瑞士BüCHI)；超純水機(jī)(MILLIPORE公司)。

1.2 試劑

訶子，購于福建銘遠(yuǎn)制藥有限公司，超微冷凍粉碎至100目左右備用；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，HPLC≥98%)；甲醇為色譜純(TEDIA，美國)；磷酸為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用超聲波輔助提取法，以沒食子酸的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)設(shè)計(jì)的L9(34)正交表進(jìn)行優(yōu)選，考察乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)、超聲時(shí)間(D)4個(gè)因素對(duì)訶子中沒食子酸的提取工藝的影響，因素水平見表1。

表1 訶子正交試驗(yàn)因素水平表L9(34)

1.4 供試品的制備

訶子干浸膏的制備：按上述正交表L9(34)做9組試驗(yàn)，每組稱取訶子超微粉10 g，分別加入不同質(zhì)量濃度的乙醇溶劑，浸泡1 h，超聲波輔助提取，過濾藥渣，將藥液置于多樣品平行蒸發(fā)儀中減壓濃縮，得到干浸膏，精確稱重，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取物樣品溶液的制備：分別準(zhǔn)確稱取各正交試驗(yàn)組中所得的干浸膏125 mg，50%甲醇超聲溶解，補(bǔ)足溶劑量，定容至25 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，分別取5 mL濾液于50 mL容量瓶中，稀釋、定容至刻度，得到0.5 mg·mL-1的藥液，作為供試品溶液。

1.5 高效液相色譜法

采用Angilent 1100 高效液相色譜儀測定訶子提取物中的沒食子酸，色譜柱為Hypersil ODS(4.0 mm×250 mm, 5 μm)；經(jīng)過色譜流動(dòng)相條件優(yōu)化，獲得最佳檢測條件，即：流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(0.1%磷酸)=4∶96；檢測波長為270 nm；流速為1.0 (mL·min-1)；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

1.5.1 線性關(guān)系的考察

精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg于100 mL量瓶中，加入4%甲醇溶解，稀釋至刻度，精密吸取上述溶液10 mL于50 mL的容量瓶中，加入4%甲醇稀釋至刻度，得0.2 mg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密稀釋至質(zhì)量濃度分別為4.0、6.0、8.0、12.0、15.0、18.0、20.0 μg.mL-1，記錄峰面積，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，沒食子酸的質(zhì)量濃度(C)為橫作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取“1.5.1”中沒食子酸對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣7次，測定峰面積值，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取表6中1號(hào)試驗(yàn)組的樣品，按上述方法“1.4”中訶子供試品溶液的制備方法，制備6份供試液，測定峰面積，計(jì)算沒食子酸的質(zhì)量濃度，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取表6中1號(hào)供試品溶液，分別于0、1、3、5、7、10 h進(jìn)樣測定，測定峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5.5 加樣回收試驗(yàn)

取表6中9號(hào)試驗(yàn)組的樣品6份，每份約125 mg，精密稱定，按上述方法“1.4”中訶子供試品的制備方法進(jìn)行制備，每份取4.0 mL，分別加入不同質(zhì)量濃度的1.0 mg·mL-1沒食子酸對(duì)照品溶液，按上述“1.5”色譜條件測定沒食子酸質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率。

1.5.6 樣品測定

精密吸取供試品溶液和沒食子酸對(duì)照品溶液各20 μL，按色譜條件“1.5”進(jìn)行測定，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算樣品中沒食子酸的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸HPLC分析色譜圖

從沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品和訶子提取物樣品的色譜圖(圖1)可見，樣品中沒食子酸能被洗脫，保留時(shí)間為6.6 min左右，且與鄰峰可達(dá)到較好分離，分離度分別為1.62和1.84，保證雜質(zhì)及溶劑對(duì)沒食子酸的測定無干擾。

(a)

(b)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

以沒食子酸進(jìn)樣質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)，回歸方程為A=92.48×C-28.566，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9，表明沒食子酸質(zhì)量濃度在4～20 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度測試

精密度試驗(yàn)的數(shù)據(jù)見表2，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.32%，表明該方法精密度很高。

圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 重復(fù)性測試

重復(fù)性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)見表3，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.42%，表明該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性測試

穩(wěn)定性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)見表4，6次進(jìn)樣沒食子酸峰面積的RSD=1.57%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 加樣回收率測定

加樣回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表5，計(jì)算沒食子酸的平均回收率達(dá)100.12%，RSD為1.86%，表明該方法回收率高，結(jié)果準(zhǔn)確。

表5 沒食子酸回收率測定結(jié)果

2.7 訶子超聲波輔助萃取工藝參數(shù)優(yōu)化

L9(34)正交設(shè)計(jì)組合方式及各試驗(yàn)組的結(jié)果見表6，用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由表6的極差分析可以看出，RA>RD>RB>RC，4個(gè)因素對(duì)訶子中沒食子酸提取率影響的大小順序?yàn)椋篈(乙醇體積分?jǐn)?shù))>D(超聲時(shí)間) >B(料液比) >C(超聲溫度)。其中，A因素中A2>A3>A1；B因素中B3>B2>B1；C因素中C1>C3>C2；D因素中D2>D1>D3。由于C(溫度)因素的均方平均和最小，該因素對(duì)整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果的影響最小，故把此列作為誤差估計(jì)列，進(jìn)行方差分析，以檢驗(yàn)其他因素的顯著性[4]，方差分析結(jié)果見表7。結(jié)果表明，A(乙醇體積分?jǐn)?shù))因素對(duì)指標(biāo)有顯著影響(P<0.05);因此，利用HPLC檢測法，優(yōu)化得到訶子中沒食子酸最佳超聲輔助提取工藝條件為A2B3C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶20，50 ℃提取80 min。

表6 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及含量測定結(jié)果

表7 數(shù)據(jù)方差分析

注：*表示與其他因素差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

訶子富含鞣質(zhì)，沒食子酸是鞣質(zhì)所含的主要活性成分，與訶子的抗菌、抗氧化等生物活性密切相關(guān)；因此從訶子中萃取活性物質(zhì)，需要選擇對(duì)鞣質(zhì)類成分破壞少，提取率高的方法。而其中評(píng)價(jià)指標(biāo)的測定方法準(zhǔn)確與否是影響試驗(yàn)結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。高效液相色譜具有高效的分離能力，可從中藥多種復(fù)雜成分中分離目的物質(zhì)，干擾成分少，測定準(zhǔn)確[5]；所以，本試驗(yàn)采用HPLC測定不同超聲輔助萃取條件下訶子沒食子酸的質(zhì)量濃度，評(píng)價(jià)不同萃取條件下訶子提取物中鞣質(zhì)的提取量，以選擇最佳工藝條件。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)訶子提取物中鞣質(zhì)成分進(jìn)行定量分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，得到?jīng)]食子酸的回歸方程為A=92.48×C-28.566，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9，質(zhì)量濃度在420 μg.mL-1范圍與峰面積呈良好的線性關(guān)系，雜質(zhì)對(duì)沒食子酸質(zhì)量濃度測定無干擾；精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及穩(wěn)定性試驗(yàn)所得RSD均小于2%；加樣回收率試驗(yàn)所得平均加樣回收率為100.12%，RSD=1.86%。由此表明：該方法準(zhǔn)確、可靠，儀器精密度好；樣品在該色譜條件下穩(wěn)定性好，可作為訶子萃取物中鞣質(zhì)成分的定量分析及評(píng)價(jià)優(yōu)化萃取工藝條件的有效方法。

[1]劉芳, 秦紅飛, 劉松青. 訶子化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中國藥房,2012, 23(7): 670.

[2]丁岡, 劉延澤, 韓全斌. 訶子屬植物化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，1996, 11(6): 255．

[3]李忠琴, 李秋云, 江興龍, 等. 高速逆流色譜法分離制備中藥訶子中的沒食子酸[J]. 色譜, 2014, 32(12): 1404.

[4]張春華. 數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法[M]. 濟(jì)南: 山東大學(xué)出版社, 1992: 161.

[5]路寧維. 液相色譜新方法測定四種中藥及其制劑中主要活性成分的研究[D]. 蘭州: 蘭州大學(xué), 2014.

(編校：葉超)

Assay of Gallic Acid from Terminalia chebula Retz and Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction with High Performance Liquid Chromatography

LI Zhongqin1,2,3, LIN Mao1,2,3, LAI Xiaojian1,2,3, LI Qiuyun2,3, XU Jisong1,2,3,JIANG Xinglong1,2,3*

(1.Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021 China；2.EngineeringResearchCentreoftheModernIndustryTechnologyforMinistryofEducation,Xiamen361021China；3.EngineeringTechnologyResearchCentreofFisheryMedicineforXiamen,Xiamen361021China)

The process conditions of extracting gallic acid fromTerminaliachebulaRetz. was optimized with ultrasonic-assisted extraction. High performance liquid chromatography(HPLC)was applied to assay gallic acid extracted fromTerminaliachebulaRetz. At the same time this method was applied as indexes to evaluate the yields of extracting gallic acid fromTerminaliachebulaRetz. The orthogonal experiment was applied to optimize the conditions of ultrasonic-assisted extraction for extracting gallic acid fromTerminaliachebulaRetz. The conditions which were ethanol concentration, solid-liquid ratio, ultrasonic time and ultrasonic temperature, were investigated on the process of extracting gallic acid. The regression linear equation is A=92.48×C-28.566, which has good linear relationship with the peak area among 4 (μg.mL-1) to 20 (μg.mL-1). The assaying condition is that column is Hypersil ODS ( 4.0 mm×250 mm, 5μm), mobile phase is 4% methanol to 96% water with 0.1% phosphoric acid (V∶V), and detection wavelength is 270 nm, and flow rate 1.0 (mL·min-1), column temperature 25 ℃. The optimized conditions of ultrasonic-assisted extraction, solvent are 60% ethanol (V∶V), ratio of material to liquid 1∶20, temperature of solvent 50℃, extraction duration 80 min. The experiment results show that this quantitative detection method is accurate, reliable and precise for assaying gallic acid with HPLC, and the application to evaluating the best conditions of extracting gallic acid fromTerminaliachebulais successful. The process of ultrasonic-assisted extraction is stable and feasible, and the extraction rate of gallic acid is high fromTerminaliachebula.

High performance liquid chromatography (HPLC);TerminaliachebulaRetz.; Gallic acid (GA); Ultrasonic-assisted Extraction

2016-01-24

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203085)；海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(14PYY050SF03)；國家海洋局海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(xiàng)(2012FJ03)；福建省教育廳項(xiàng)目(JA15260)；廈門市重點(diǎn)項(xiàng)目(3502Z20110014)；鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心開放基金(RE201606，RE201607)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510390053)。

李忠琴(1976—),女,副教授,博士,主要研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)與藥物化學(xué)。

*通信作者：江興龍(1968—)，男，教授，博士，主要研究方向?yàn)樗蛏鷳B(tài)學(xué)。E-mail: xinglongjiang@jmu.edu.cn.

R284

A

1673-159X(2016)05-0034-5

10.3969/j.issn.1673-159X.2016.05.007