MSTN基因在1～6月齡哈薩克羔羊脂肪中相對表達(dá)量的研究

祖玲玲，姚麗丹，依明·蘇萊曼，馬曉燕，決肯·阿尼瓦什

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052）

MSTN基因在1～6月齡哈薩克羔羊脂肪中相對表達(dá)量的研究

祖玲玲，姚麗丹，依明·蘇萊曼，馬曉燕，決肯·阿尼瓦什

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052）

探索MSTN（生長抑制素）基因在脂肪組織中不同生長階段的表達(dá)差異，為哈薩克羔羊的良種選育提供遺傳學(xué)資料。采用熒光定量1～6月齡哈薩克羔羊脂肪組織中MSTN基因的相對表達(dá)量，2-ΔΔCt處理不同月齡相對表達(dá)量數(shù)據(jù)，SPSS 17.0軟件分析表達(dá)量差異。結(jié)果表明：MSTN基因在1～6月齡哈薩克羔羊尾脂中的相對表達(dá)量6月齡最高，1、2、3、4各月齡之間無顯著性差異（P＞0.05），5月齡最低。說明MSTN基因在脂肪中的表達(dá)量在生長發(fā)育的前期差異不顯著（P＞0.05），在5月齡顯著降到最低點(diǎn)，隨后在6月齡達(dá)到最高。

MSTN基因；哈薩克羊羔羊；表達(dá)量

哈薩克羊是新疆古老的優(yōu)良地方肉脂兼用型綿羊品種，長期游牧于天山、阿勒泰山及準(zhǔn)噶爾盆地邊緣，為中國三大粗毛羊品種之一［1］，曾是新疆?dāng)?shù)量最多、分布最廣的綿羊品種［2］。哈薩克羊耐寒、耐粗飼，抗病性強(qiáng)，對自然牧區(qū)生態(tài)條件有較強(qiáng)的適應(yīng)性，現(xiàn)已成為適應(yīng)牧區(qū)放牧的良好肉脂兼用型粗毛羊品種，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。MSTN又稱生長分化因子GDF-8，是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）超家族中的一員，對肌肉的生長起著至關(guān)重要的負(fù)調(diào)控作用，1997年由Mcpherron科研小組首次發(fā)現(xiàn)，由于其對肌肉生長起負(fù)調(diào)控作用被命名為生長抑制素基因。近期研究發(fā)現(xiàn)，MSTN（生長抑制素）基因可加強(qiáng)脂前體細(xì)胞和脂源性干細(xì)胞生成的過程，也可對脂肪前體細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化起抑制作用［3］，MSTN基因分泌過多會導(dǎo)致脂分解加強(qiáng)，缺失會影響脂肪形成［4］。Artaza等對小鼠注射MSTN基因重組和抗MSTN抗體，研究胚胎成纖維細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞系成脂成肌分化的作用，結(jié)果表明，MSTN基因可削弱成纖維細(xì)胞的成纖分化作用，加強(qiáng)成纖維細(xì)胞向脂肪分化的作用［5］。McPherron等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在保持正常的采食量、體溫及略低代謝速率的條件下，MSTN基因缺失的小鼠隨著年齡的增加，脂肪積累量顯著降低。目前雖然對MSTN基因的研究有一定的進(jìn)展，但MSTN基因在脂肪中的表達(dá)水平發(fā)育性變化的相關(guān)文獻(xiàn)甚少。本文以新疆地方良種綿羊品種哈薩克羔羊?yàn)檠芯繉ο螅剿鱉STN基因在其脂肪中的表達(dá)規(guī)律，不僅可為MSTN基因在脂肪中的表達(dá)規(guī)律提供科學(xué)的遺傳學(xué)資料，也可結(jié)合實(shí)際，對哈薩克羊的良種保留與繁育以及肉品質(zhì)的改善提供很好的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 動物

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑（Trizol Reagent）、反轉(zhuǎn)錄試劑（Reverse Transcriptase M-MLV RNase H-、Ribonuclease Inhibitor、10×mmol/L dNTP Mixture、5×RT buffer）、熒光定量試劑（Ribonuclease Inhibitor、SYBR PremixExTaqTM、 ROX）均購自TaKaRa公司，瓊脂糖、氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC（焦磷酸二乙酯）均購自新疆阜瑞科生物科技有限公司。TGL-16高速臺式冷凍低溫離心機(jī)：湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠，普通Biometerya PCR儀：北京艾思普科技有限公司，Gel Doc 2000型凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司，熒光定量Biometerya PCR儀：北京艾思普科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)各基因在GenBank上的mRNA序列（MSTN為NM-001009428.1，β-Actin為 U39357），利用 Primer premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，上海生工生物公司合成后使用滅菌超純水處理，溶解稀釋成10 μmol/L，-20℃保存。各基因的引物序列見表1。

表1 引物序列參數(shù)

1.4 基因組總RNA的提取與cDNA的合成

按照Trizol說明進(jìn)行提取，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測總RNA的完整性，檢測合格的RNA保存于超低溫冰箱中（-80℃）中。反轉(zhuǎn)錄加樣體系（20 μL）：模板RNA 2.5 μg，OligodT（18）primer 1 μL，RNase Free ddH2O補(bǔ)至12 μL；在普通PCR儀上65℃保溫5 min；迅速急冷2 min以上，離心5 s；加5×Reaction Buffer 4 μL，10×dNTP 1 μL，Revert Aid M-MuLV RT（200 U/μL）1 μL，Ribo Lock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL；普通PCR儀上 42℃，60 min，70℃，5 min。

RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，加RNaseFreeddH2O80μL，得到濃度為25 ng/μL的cDNA模板，進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)。

1.5 PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行普通PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系25 μL：PCR×2×Master 12.5 μL，cDNA 2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物0.5 μL（10 μmol/L），RNase-free ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5 min，變性94℃10 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，循環(huán)34個，延伸72℃5 min，永久4℃。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收。

1.6 定量

普通PCR擴(kuò)增檢測引物特異性后，對cDNA進(jìn)行熒光定量。20 μL熒光定量擴(kuò)增（PCR）反應(yīng)體系加樣：2×SYBR Premix EX Taq 10 μL，cDNA 2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物0.5 μL（10 μmol/L），RNasefree ddH2O 7 μL，離心3 s，放入熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增（擴(kuò)增程序：95℃變性30 s，61℃退火30 s，38個循環(huán)，熔解曲線：95～60℃0.5℃/min，降溫：50℃3 min），實(shí)時觀測擴(kuò)增情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件17.0單樣本方差分析相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測

用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總RNA，從圖1中可見較清晰的RNA條帶：28 S、18 S和5.8 S，其中5.8 S帶較淺，說明RNA質(zhì)量好。D260/D280比值在1.8～2.0之間，表明RNA純度較好，可以繼續(xù)后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2 普通PCR擴(kuò)增目的基因

采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測MSTN基因擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，目的基因PCR擴(kuò)增片段為175 bp左右（參照Mark為1 000），由此可見引物可靠，可以做定量分析。

圖1 RNA的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果

圖2 MSTN基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 熒光定量PCR結(jié)果與分析

2.3.1 熒光定量PCR熔解曲線 通過熔解曲線可以看出，使用引物PCR產(chǎn)物均呈單一峰（圖3），可以排除引物二聚體或其他因素的干擾，說明引物有較好的特異性。

2.3.2 MSTN基因在1～6月齡哈薩克羊尾脂中的相對表達(dá)量 從圖4可知，MSTN在6月齡羔羊尾脂中的相對表達(dá)量最高，顯著高于1、3、4、5月齡羔羊（P＜0.05）。而1、2、3、4月齡相對表達(dá)量間無顯著性差異（P＞0.05）。5月齡的相對表達(dá)量最低，且顯著低于2月齡和6月齡的相對表達(dá)量（P＜0.05），但與其他各月齡間差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 MSTN基因的熔解曲線

圖4 MSTN基因在1～6月齡羔羊尾脂中的相對表達(dá)量

3 討論

MSTN由于其對肌肉生長的負(fù)顯著調(diào)控作用，在肌肉組織中的定量研究較多［7-12］，而在脂肪中的研究較少。Hira等［13］利用MSTN處理牛前脂肪細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，MSTN能抑制脂肪細(xì)胞的分化。吐來力江［14］研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中MSTN基因mRNA表達(dá)量隨月齡增加逐漸上升。祖玲玲等［15］研究發(fā)現(xiàn)，MSTN在0～6月齡新疆也勒白羊脂肪中的表達(dá)量隨月齡增長而升高，在5月齡達(dá)到最高，而后降低。而在本研究中，MSTN在1～6月齡哈薩克羔羊尾脂中的表達(dá)量沒有隨月齡增長而有升高趨勢，1、2、3、4月齡之間的相對表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05），在5月齡降到最低，6月齡達(dá)到最高，分析原因可能存在品種差異、試驗(yàn)偶然性等。MSTN基因在不同品種羊脂肪中是否存在一致的表達(dá)規(guī)律，還需加大樣本進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

MSTN基因在哈薩克羔羊脂肪中的表達(dá)水平在生長發(fā)育的前期差異不顯著（P＞0.05），在5月齡時顯著降到最低，6月齡達(dá)到最高。

［1］ 趙有璋.羊生產(chǎn)學(xué)［M］.2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：70-140.

［2］ 新疆維吾爾自治區(qū)地方志編纂委員會.新疆通志·畜牧志［M］.烏魯木齊：新疆人民出版社，1996.

［3］ Rebbapragada A，Benchabane H，Warna J L，et al.Myostatin signals through a transforming growth factor beta-like signaling pathy to blockadipogenesis［J］.Molecular and Cellular Biology，2003，23（20）：7230-7242.

［4］ Kim H S，Liang L，Dean R G，et al.Inhibition of preadipocyte differentiation by myostatin treatment in 3T3-L1 cultures［J］.Biochem BiophysResCommun，2001，281（4）：902-906.

［5］ Artaza J N，Bhasin S，Magee TR，et，al.Myostatin inhibits myogenesis and promotes adipogenesis in C3H10T（1/2）mesenchymal multipotent cells［J］.Endocrinology，2005，146（8）：3547-3557.

［6］ McPherron A C，Lawler A M，Lee S J.Regulation at skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member［J］.Nature，1997，387（6628）：83-90.

［7］ 管淞，周漢林，王東勁，等.海南黑山羊MSTN基因的表達(dá)差異與發(fā)育性變化研究［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，34（11）：15-19.

［8］ 梁婧嫻，陳志成.藏系綿羊MSTN基因在不同年齡不同組織的表達(dá)定量研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（17）：10454-10457.

［9］ 潘英樹，張永宏，郭麗君，等.朗德鵝肌生成抑制素基因組織分布研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（5）：45-46.

［10］白素英，劉梯，蔣國紅，等.抑肌素基因mRNA在豬肌肉組織表達(dá)差異的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（3）：350-352.

［11］胡蘭，王娜，胡銳，等.大骨雞MSTN基因的表達(dá)檢測［J］.中國家禽學(xué)報(bào)，2003（1）：46-48.

［12］杜富寬，聶志娟，徐鋼春，等.刀鱭MSTN基因的克隆及其組織表達(dá)［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2014，21（4）：0575-0585.

［13］Hirai S，MatsumotoH，HinoN，et al.Myostatin inhibits differentiation ofbovine preadipocyte［J］.Domest AnimEndoerinol，2007，32：l-14.

［14］吐來力江.MSTN/Smad信號通路與阿勒泰羊肌肉生長發(fā)育、產(chǎn)肉性能關(guān)聯(lián)性的研究［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［15］祖玲玲，吐來力江·哈姆太，決肯·阿尼瓦什，等.新疆也木勒白羊MSTN基因不同生長時期表達(dá)量的定量研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（12）：98-101.

Expression of MSTN Gene in Fat Tissues of Kazak Lambs during 1-6 Months

Zu Lingling，YaoLidan，Jueken·Aniwashi，et al
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

To inverstigate the expression of MSTN gene in fat tissue of Kazak lambs during the age of 1-6 months，the fat tissues in the buttocks were sampled and analyzed by using quantitavive PCR.The results showed that the relative expression level of MSTN gene was the highest at the age of6 month，the lowest at the age of5 month and nosignificant differences amongthe ages of 1，2，3，4 month（P＞0.05）.

MSTN gene；Kazak lamb；expression

S826.2

A

2095-3887（2016）02-0007-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.02.002

2015-12-18

國家自然科學(xué)基金（31260530）

祖玲玲（1988-），女，碩士研究生。

決肯·阿尼瓦什（1962-），男，教授，博士。研究方向：動物遺傳育種與繁殖。