HPLC法同步測(cè)定蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素及腺苷的含量

李　兵，張文成，王冰嵩，金禮強(qiáng)

（合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥230009）

·分析測(cè)試·

HPLC法同步測(cè)定蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素及腺苷的含量

李兵，張文成，王冰嵩，金禮強(qiáng)

（合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥230009）

目的:采用HPLC法同步測(cè)定蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素及腺苷的含量。方法：采用SGE protecol C18（5μm，250mm×4.6mm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水（5∶95，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20μL。結(jié)果：蟲(chóng)草素和腺苷分別在16.875～540μg/mL、19.375～620μg/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.9998、0.9996。該方法重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性及回收率均符合要求。結(jié)論：本法用于同步測(cè)定蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素及腺苷的含量，具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和高效等特點(diǎn)。

蛹蟲(chóng)草；蟲(chóng)草素；腺苷；同步檢測(cè)

蛹蟲(chóng)草[Cordyceps militaris]，又稱(chēng)北蟲(chóng)草、北冬蟲(chóng)夏草，與冬蟲(chóng)夏草同屬異種，為麥角菌目麥角菌科蟲(chóng)草屬真菌[1]，最初記載于《新華本草綱要》：蛹草“性平，味甘”，具“補(bǔ)精髓，益肺腎，止血化痰”之功效。中醫(yī)藥認(rèn)為，蟲(chóng)草既能補(bǔ)肺陰虧，又能補(bǔ)腎陽(yáng)虧，是目前唯一一種能同時(shí)平衡和調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥材。蟲(chóng)草素和腺苷是蛹蟲(chóng)草中的兩種重要活性成分。蟲(chóng)草素具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、補(bǔ)腎、促進(jìn)心腦血管循環(huán)等藥理作用[2-3]；腺苷具有鎮(zhèn)靜、催眠、抑制癲癇、抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[4-5]。

近年來(lái)，隨著技術(shù)的發(fā)展以及市場(chǎng)需求的迅速增長(zhǎng)，蛹蟲(chóng)草的加工利用已逐步向深層次發(fā)展。由于蟲(chóng)草素及腺苷重要的生物活性，蛹蟲(chóng)草已成為醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)。因此，對(duì)蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素和腺苷的同步檢測(cè)及定量分析具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同步測(cè)定蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素及腺苷的含量，為蛹蟲(chóng)草的真?zhèn)舞b定、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等提供一定的技術(shù)支撐。

1　儀器和試劑

高效液相色譜儀（安捷倫，型號(hào)1260，美國(guó)）；超聲波清洗器（型號(hào)SC2201）；中藥粉碎機(jī)（型號(hào)FW177）。蟲(chóng)草素對(duì)照品、腺苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；蛹蟲(chóng)草（安徽時(shí)代陽(yáng)光藥業(yè)）；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水（屈臣氏超純水）。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

（1）對(duì)照品溶液。分別精密稱(chēng)取蟲(chóng)草素5.4mg，腺苷6.2mg，用90%的甲醇溶劑定容于10mL容量瓶中，分別配制成濃度為540μg/mL、620μg/mL的對(duì)照品溶液。

（2）樣品溶液。將蛹蟲(chóng)草放入真空干燥箱中，60℃下干燥24h后，用中藥粉碎機(jī)將蛹蟲(chóng)草粉碎，隨后過(guò)60目篩，制得粉末樣品。精密稱(chēng)取蛹蟲(chóng)草粉末2.0g，置于100mL錐形瓶中，按料液比1∶25添加水，調(diào)節(jié)pH為7.0，中性蛋白酶添加量為1.0%，于50℃條件下提取150min。放冷后過(guò)濾，定容至50mL容量瓶。過(guò)0.45μm濾膜，備用。

（3）線性關(guān)系考查。分別精密吸取對(duì)照品5mL，依次制備系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣量為20μL。設(shè)定的色譜條件：采用SGE protecol C18（5μm，250mm×4.6mm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水（5∶95，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，流速1.0mL/min。按以上條件進(jìn)行測(cè)定，記錄主峰面積，以濃度（μg/mL，C）為橫坐標(biāo)，以峰面積值（A）為縱坐標(biāo)，得線性方程，見(jiàn)表1和表2。

2.2精密度實(shí)驗(yàn)

以蟲(chóng)草素及腺苷為研究對(duì)象，精密吸取2.1（2）項(xiàng)下的同一樣品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，得蟲(chóng)草素及腺苷各次的含量，其RSD分別為1.87%、1.13%。

2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以蟲(chóng)草素及腺苷為研究對(duì)象，精密吸取2.1（2）項(xiàng)下的同一樣品溶液20μL，按設(shè)定的色譜條件分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8和10h進(jìn)行進(jìn)樣分析，分別測(cè)得每個(gè)時(shí)間蟲(chóng)草素及腺苷峰的面積，其RSD分別為1.85%、1.48%。

2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

以蟲(chóng)草素及腺苷為研究對(duì)象，分別精確稱(chēng)取蛹蟲(chóng)草粉末2.0g5份，按2.1（2）項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法平行制備供試樣液5份，按設(shè)定的色譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣量為20μL，分別測(cè)定各樣液中蟲(chóng)草素及腺苷的含量，其RSD值分別為1.52%、1.92%。

表1　蟲(chóng)草素和腺苷的濃度及對(duì)應(yīng)的峰面積

表2　蟲(chóng)草素和腺苷的線性方程（n=6）

2.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱(chēng)取已知含量的樣品5份，分別加入蟲(chóng)草素及腺苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，按2.1（2）項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法制備樣品溶液，測(cè)定并計(jì)算蟲(chóng)草素及腺苷的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　蟲(chóng)草素及腺苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)

3　結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用HPLC法同步檢測(cè)蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素和腺苷的含量，其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率均良好。實(shí)驗(yàn)采用SGE protecol C18（5μm，250mm× 4.6mm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水（5∶95，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，流速為1.0mL/min，可以達(dá)到對(duì)蟲(chóng)草素和腺苷很好的分離效果。該方法不僅可以縮短檢測(cè)時(shí)間，而且具有簡(jiǎn)便、高效和準(zhǔn)確的特點(diǎn)。該方法的建立可為蛹蟲(chóng)草的真?zhèn)舞b定、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等提供一定的技術(shù)支撐。

[1]邵力平.真菌分類(lèi)學(xué)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1984：109.

[2]劉桂君，周思靜，楊素玲，等.蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2013，34（21）：417-422.

[3]楊杰，陳順志.蟲(chóng)草素研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志，2008，29（6）：57-60.

[4]張緒璋.北冬蟲(chóng)夏草的人工培植及其營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].中國(guó)實(shí)用菌，2002，22（2）：19-21.

[5]袁永生，張莉，許效楓，等.反相高效液相法測(cè)定蟲(chóng)草菌粉中核苷類(lèi)成分的含量[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)雜志，2002，37（10）：58-60.

Synchronous Determination of Cordycepin and Adenosine in Cordyceps Militaris by HPLC

LI Bing，ZHANG Wen-cheng，WANG Bing-song，JIN Li-qiang
（EngineeringResearch Center ofBio-process fromMinistryofEducation，Hefei UniversityofTechnology，Hefei 230009，China）

Objective：this study has been to establish a method for synchronous determination of cordycepin and adenosine in cordyceps militaris.Method:SGE protecol C18（5μm，250mm×4.6mm）chromatographic column was used，with mixtures of acetonitrile and water as mobile phase（5∶95，V/V），the wavelength was 260mn，the flowrate was 1.0mL/min，the injection volume was 20μL.Results：the linear range of cordycepin and adenosine is 16.875～540μg/mL，19.375～620μg/mL，respectively.The correlation coefficient r is 0.9998，0.9996 respectively.Repeatability，precision，stability and recovery are favorable.Conclusion：the established method is a simple，accurate and efficient for synchronous determination cordycepin and adenosine in cordyceps militaris.

cordyceps militaris；cordycepin；adenosine；synchronization

10.3969/j.issn.1008-553X.2016.04.039

O657.7+2

A

1008-553X（2016）04-0105-03

2016-02-29

李兵（1990-），男，在讀研究生，研究方向：天然活性成分，15856921835，15856921835@163.com。