頭穴透刺對腦梗死大鼠ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β的影響研究

桑鵬　王順　趙佳輝

頭穴透刺對腦梗死大鼠ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β的影響研究

桑鵬王順趙佳輝

目的 觀察頭穴透刺對腦梗死大鼠ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β的影響。方法 線栓法造模；行頭穴透刺，一般針刺，藥物注射治療；2個療程后檢測ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β。結(jié)果 頭穴透刺組明顯提升大鼠PDGFR-β表達和降低ET、IP3、Mg2+的含量，與一般針刺組、藥物治療組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 頭穴透刺通過對ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β調(diào)節(jié)發(fā)揮腦保護作用。

腦梗死；頭穴透刺；ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β

1　研究方法

1.1實驗方法

1.1.1實驗分組 150只大鼠隨機分為頭穴透刺組，一般針刺組，藥物注射組。

1.1.2模型復(fù)制 線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈梗死的模型[1]。

1.1.3模型成功標志 大鼠同一邊的Horner征及大鼠另一邊以前肢為主的偏癱。

1.2模型評估

0分：未能發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)損傷的癥狀；1分：大鼠對側(cè)前爪完全伸直受限；2分：大鼠只能向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：大鼠會向?qū)?cè)傾倒；4分：大鼠意識喪失及無法自主活動。

1.3治療

1.3.1針刺器材 貴州安迪藥械有限公司毫針，直徑0.35 mm，長13 mm。

1.3.2選穴 《實驗針灸學(xué)》動物穴位。

1.3.3治療刺激參數(shù) 使用頻率為50 Hz及波寬度為0.3 ms的連續(xù)波，刺激到大鼠有明顯肌肉收縮為有效刺激度。

1.3.4治療方法 頭穴透刺組選穴：百會透雙側(cè)曲鬢，前神聰透向雙側(cè)懸厘；患側(cè)上肢的曲池、手三里、外關(guān)、合谷及患側(cè)下肢陽陵泉、豐隆、足三里、三陰交。得氣后上述穴位選用G-6805型電針儀給予適當刺激。每日刺激1次，7 d為1個療程，共治療2個療程。一般針刺組選穴：患側(cè)上肢的曲池、手三里、外關(guān)、合谷及患側(cè)下肢陽陵泉、豐隆、足三里、三陰交；得氣后上述穴位選用G-6805型電針儀給予適當刺激。每日刺激1次，7 d為1個療程，共治療2個療程。上述電針儀均為青島鑫升實業(yè)有限公司準字2000第2270088號電針儀。藥物注射組：腦蛋白水解物注射液（曲奧）30 ml（三聯(lián)藥業(yè)有限公司，國藥H20051202），每日注射1次，7 d為1個療程，共治療2個療程。

1.4取材

4%多聚甲醛快速灌注，灌注固定完成迅速斷頭。取出腦干及脊髓，放入已標記好的Eppendorf管內(nèi)，液氮暫保存，-80℃冰箱保存待測。

2　試驗研究

2.1IP3和ET，Mg2+的檢測

第一步取出標好編號的標板，依據(jù)實驗操作要求分別加入100 μl的標準品于空白微孔中；第二步分別取三組治療前、1個療程后、2個療程后實驗大鼠的血清，加入100 μl血清于空白微孔中；標準品孔中和樣品孔中加入50 μl的酶標記溶液，使用攪拌器讓液體混合均勻。標本加滿洗滌應(yīng)用液后20～30 s輕搖標本靜置，間隔20～30 s重復(fù)前操作，如此室溫下往復(fù)操作3 min。所有孔中加入底物A 50 μl和 B 50 μl；每次添加液體后都需要使用輔助器械讓液體混合均勻，然后在37℃水浴鍋中避光反應(yīng)15 min；每個微孔中加入50 μl的終止液，混勻液體；在TECAMGENIOS酶標儀的450 nm處測定OD；根據(jù)制備的標準曲線，計算樣本含量。

2.2PDGFR-β檢測

本實驗使用的染色試劑是辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素?；静襟E：組織進行石蠟切片，將切好并用福爾馬林固定的組織切片在常溫中靜置1 h，進行脫蠟致水化，再用蒸餾水沖洗；3%甲醇-過氧化氫室溫孵育8 min左右，用來減少過氧化物酶的活性，pH酸堿度在7.2左右的PBS緩沖劑清洗6 min；使用微波抗原修復(fù)，鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶復(fù)合物在37℃孵育10 min，PBS 洗4 min；DAB顯色液顯色，用自來水沖洗來終止反應(yīng)；蘇木精再復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組。

3　統(tǒng)計學(xué)方法

離子含量的數(shù)據(jù)資料采用SPSS 13.0軟件進行處理；實驗中的數(shù)據(jù)均用（均數(shù)±標準差）（±s）表示；計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，q檢驗用于組間、組內(nèi)分析的處理。

4　結(jié)果

頭穴透刺組、一般針刺組及藥物注射組ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β治療前后對比見表1～4。

表1　血清Mg2+含量在三組治療前后的比較[（±s），mmol/L]

表1　血清Mg2+含量在三組治療前后的比較[（±s），mmol/L]

注：頭穴透刺組Mg2+含量治療前后分析△P＜0.01。一般針刺組與藥物注射組治療前后分析▲P＜0.05。治療2個療程后頭穴透刺組與一般針刺組與藥物注射治療組對比P＜0.01

組別 　治療前 　1個療程后 　2個療程后頭穴透刺組 　1 . 3 3 ± 0 . 1 6△　1 . 0 9 ± 0 . 2 7 　0 . 7 4 ± 0 . 1 1△一般針刺組 　1 . 3 4 ± 0 . 1 8▲　1 . 2 6 ± 0 . 2 3 　1 . 1 4 ± 0 . 2 4▲藥物注射組 　1 . 3 2 ± 0 . 2 1▲　1 . 2 7 ± 0 . 2 2 　1 . 1 9 ± 0 . 1 4▲

表2　血清IP3含量在三組治療前后的比較[（±s），mmol/L]

表2　血清IP3含量在三組治療前后的比較[（±s），mmol/L]

注：頭穴透刺組IP3（mmol/L）含量治療前后分析△P＜0.01。一般針刺組與藥物注射組治療前后分析▲P＜0.05。治療2個療程后頭穴透刺組與一般針刺組與藥物注射治療組對比P＜0.01

組別 　治療前 　1個療程后 　2個療程后頭穴透刺組 　6 . 3 3 ± 0 . 1 6△　4 . 0 9 ± 0 . 2 7 　3 . 8 8 ± 0 . 2 6 9△一般針刺組 　6 . 3 4 ± 0 . 1 8▲　5 . 2 6 ± 0 . 2 3 　4 . 3 8 ± 0 . 2 4 1▲藥物注射組 　6 . 3 2 ± 0 . 2 1▲　5 . 2 7 ± 0 . 2 2 　4 . 5 9 ± 0 . 2 7 1▲

表3　血漿ET含量治療前后的比較[（±s），ng/L]

表3　血漿ET含量治療前后的比較[（±s），ng/L]

注：頭穴透刺組ET（ng/L）含量治療前后分析△P＜0.01。一般針刺組與藥物注射組治療前后分析▲P＜0.05。治療2個療程后頭穴透刺組與一般針刺組與藥物注射治療組對比P＜0.01

組別 　治療前 　1個療程后 　2個療程后頭穴透刺組 　8 1 . 4 3 ± 1 5 . 6 7△　6 4 . 7 3 ± 1 1 . 4 7 　5 8 . 8 5 ± 4 . 8 3△一般針刺組 　8 2 . 8 5 ± 1 7 . 2 1▲　7 2 . 6 5 ± 2 . 9 3 　7 0 . 7 4 ± 3 . 3 1▲藥物注射組 　8 1 . 4 1 ± 1 9 . 4 3▲　7 6 . 8 6 ± 1 7 . 2 4 　7 4 . 8 3 ± 5 . 6 1▲

表4　PDGFR-β陽性細胞計數(shù)比較（400倍鏡下計數(shù)）

5　討論

PDGFR引起血管收縮，誘導(dǎo)受損上皮細胞與內(nèi)皮細胞分裂增殖，促進血管的形成再生[2]。試驗14 d后，腦梗死大鼠神經(jīng)元的PDGFR-β特異性免疫染色顯著增強，可見到特異免疫著色，陽性細胞數(shù)也增加，特異性神經(jīng)元和反應(yīng)性膠質(zhì)細胞密集分布[3]。

腦梗死大鼠ET含量明顯增高，主要是ET在腦梗死急性期，因應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)皮細胞受損、缺氧等因素生成與釋放增加，促進缺血性腦水腫的發(fā)生和發(fā)展[4]。ET濃度與神經(jīng)功能缺損程度評分呈正相關(guān)[5]。

IP3是細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要途徑和第二信使，三磷酸肌醇是IP3與Ca2+信號傳遞的重要組成部分。因為IP3水溶性，可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的內(nèi)質(zhì)膜或液泡膜結(jié)合，從而打開Ca2+通道閥門，引起鈣離子的釋放[6]。IP3從質(zhì)膜運動到胞質(zhì)溶膠的過程使鈣濃度升高；增強細胞膜的活性、降低環(huán)磷酸腺苷[7]。

腦梗死模型的大鼠的治療前后Mg2+與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。急性腦梗死發(fā)生后，電解質(zhì)紊亂，Ca2+流向細胞內(nèi)，Mg2+的利用率增加，大量流向細胞外；治療2個療程后血清Mg2+慢慢恢復(fù)正常水平，Mg2+可以防止過多的鈣離子進入細胞內(nèi)，改變血流量、減少GREB蛋白質(zhì)，預(yù)防血小板的聚集，保護損傷的腦神經(jīng)[8]。

[1]Tamam B，Tasdemir N，Tamam Y. The prevalence of dementia three months after stroke and its risk factors[J]. Turk Psikiyatri Derg，2008，19（1）：46-56．

[2]Serrano S，Domingo J，Rodriguez-Garcia E，et al. Frequency of cognitive impairment without dementia in patients with stroke: a two-year follow-up study[J]. Stroke，2007，38（1）：105-110．

[3]楊續(xù)艷，王銳，郭淑穎，等. 電項針療法對大鼠腦缺血再灌注模型腦組織EPO表達的影響[J]. 針灸臨床雜志，2009，25（5）：24-26．

[4]沈君，王和德，尹格平，等. 急性腦梗死患者CD62P與紅細胞內(nèi)外鈣離子濃度變化的研究[J]. 河南實用神經(jīng)疾病雜志，2001，4（2）：4-5.

[5]孫怡，楊任民. 實用中西結(jié)合神經(jīng)病學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：152-155.

[6]朱肖菊，王曉杰. 電項針療法對腦缺血再灌注大鼠 ICAM-1及ICAM-1mRNA表達的影響[J]. 針灸臨床雜志，2011，27（7）：60-62．

[7]霍金，韓數(shù). 電項針干預(yù)對老年性癡呆大鼠5-HT及CHATm-RNA的影響[J]. 針灸臨床雜志，2012，28（4）：68-70．

[8]劉嬌，馮曉東. 電針百會、神庭穴配合康復(fù)訓(xùn)練治療腦卒中后認知障礙臨床研究[J]. 中醫(yī)學(xué)報，2013，28（4）：608-610．

Effects of Scalp Acupuncture on ET, IP3, Mg2+, PDGFR-β in Rats With Cerebral Infarction

SANG Peng WANG Shun ZHAO Jiahui Department of Acupuncture and Moxibustion, Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine, Harbin Heilongjiang 150001, China

Objective To observe the effect of scalp acupuncture on ET, IP3, Mg2+and PDGFR-β in rats with cerebral infarction. Methods Suture model, head points acupuncture, acupuncture treatment, drug injection, detection of ET, IP3, Mg2+, PDGFR-β, after 2 courses of treatment. Results the expression of PDGFR-β, ET, IP3and Mg2+were significantly improved in the scalp acupuncture group, and the difference was statistically significant in the acupuncture group and the medicine group (P＜0.01). Conclusion Through the scalp penetration acupuncture through the ET, IP3, Mg2+, PDGFR-β play a protective role in the brain.

Cerebral infarction, Head hole through thorn, ET, IP3, Mg2+, PDGFR-β

R245

A

1674-9308（2016）30-0184-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.30.121

黑龍江中醫(yī)藥中青年科技攻關(guān)項目（ZQG009）

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院針灸科，黑龍江 哈爾濱 150001

頭穴透刺治療腦梗死臨床療效肯定，以往研究多局限于病例觀察，缺乏嚴格隨機對照分組及大樣本規(guī)范性的觀察研究，從而影響神經(jīng)傳導(dǎo)相關(guān)的生化實驗室檢測指標，及動物實驗匱乏，無法運用科學(xué)思維論證頭穴透刺療法對腦梗死的治療作用機理。

該實驗補充了與神經(jīng)傳導(dǎo)相關(guān)的生化離子實驗室研究；彌補了動物實驗論證等方面的不足；為頭穴透刺治療腦病提供了新的思路。