大鼠牙髓神經胞體在三叉神經節(jié)內分布特點

肖芳莉，李國超，馬騰飛，黃姍姍，徐文華，王烈成，王元銀

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大鼠牙髓神經胞體在三叉神經節(jié)內分布特點

肖芳莉1，李國超1，馬騰飛1，黃姍姍1，徐文華1，王烈成2，王元銀1

目的 了解正常及三叉神經痛(TN)模型大鼠的牙髓神經胞體在三叉神經節(jié)(TG)內分布情況及其投射關系，為臨床通過TG治療TN提供解剖學依據。方法 本實驗分為模型組和假手術組，在兩組大鼠不同牙髓腔內注入逆行熒光探針，用熒光顯微鏡觀察TG中熒光標記神經元的分布情況。結果 兩組大鼠分別在右下及左上中切牙髓腔內注入綠色熒光探針Fast DiO 72 h后，分別在右側TG后外側區(qū)、左側TG中段區(qū)觀察到數(shù)個、成簇分布帶有綠色熒光標記神經元；將兩組大鼠右下及左上中切牙髓腔內分別注入Fast DiO、Fast DiI兩種熒光探針，72 h后在其同側TG的后外側區(qū)和中間區(qū)分別觀察到成簇分布的帶有綠色和紅色熒光的神經元；兩組大鼠左側上中切牙及下頜第一磨牙髓腔內分別注入熒光探針Fast DiI和Fast DiO，72 h后在同側TG的后外側區(qū)和中段區(qū)分別觀察到成簇分布帶有綠色和紅色熒光的神經元。經統(tǒng)計學比較，兩組之間相應牙髓神經胞體在TG內分布區(qū)域、數(shù)量及熒光強度沒有明顯區(qū)別。結論 三叉神經上、下頜支神經胞體投射于同側TG，并有一定區(qū)域性；TN產生不改變TG內神經元數(shù)量及投射聯(lián)系，其可能與三叉神經功能活動改變有關。

三叉神經節(jié)；三叉神經痛；逆行熒光標記；神經束路追蹤法

三叉神經痛(trigeminal neuralgia,TN)是指三叉神經分布區(qū)域陣發(fā)性劇烈疼痛，其發(fā)病機制及診治國內外學者仍在探索中，是神經系統(tǒng)一大頑疾。對于神經系統(tǒng)疾病，目前普遍采用神經束路追蹤法來研究其內在聯(lián)系及機制。關于三叉神經各分支胞體在三叉神經節(jié)(trigeminal ganglia,TG)內投射，早在1978年，Charles et al[1]對貓采用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)追蹤法，角膜注射于TG內側發(fā)現(xiàn)被標記細胞。1981年，Marfurt[2]也成功用HRP追蹤法發(fā)現(xiàn)貓三叉神經各分支在TG內對應區(qū)域，國內也有學者采用此法對家兔三叉神經進行了逆向追蹤[3]。然而不同動物、相同部位神經元分布可能存在種屬差異。該研究通過神經元逆行熒光標記法對假手術組及模型組大鼠不同牙髓注入熒光探針，隨后分析TG中標記神經元數(shù)量及分布，來了解各分支神經胞體在TG內投射情況，進而探討三叉神經系統(tǒng)信號傳導及相互關系，為臨床治療提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級健康成年雄性 SD大鼠60只，150～250 g(安徽醫(yī)科大學實驗動物中心)，預先毛刷刺激訓練，形成適應性；親脂性染料：Fast DiI(D-3899，激發(fā)波長 568 nm，發(fā)射波長 564 nm)、Fast DiO(D-3898，激發(fā)波長 488 nm，發(fā)射波長 499 nm)，熒光探針(美國Sigma公司)；避光 4 ℃保存，實驗前用生理鹽水配置成濃度為 5 mg/ml。

1.2 實驗方法

1.2.1 TN模型制備 通過眶下神經慢性縮窄環(huán)方法制備動物模型40只，造模2周后行TN誘發(fā)實驗，采用Vos et al[4]動物行為學反應積分系統(tǒng)評價，篩選20只。

1.2.2 假手術組動物制備 手術方法與模型組相同，暴露眶下神經，但對其不予結扎，再分層縫合，準備20只。

1.2.3 熒光探針注射 模型組與假手術期大鼠均分4組，分別采取4種部位注射。第一組熒光探針(Fast DiO)注射于右側下中切牙；第二組熒光探針(Fast DiO)注射于左側上中切牙；第三組熒光探針雙標記右側下中切牙(Fast DiO)及左側上中切牙(Fast DiI)；第四組熒光探針雙標記左側上中切牙(Fast DiI)及左側下頜第一磨牙(Fast DiO)；均在麻醉狀態(tài)下采用微量注射器于髓腔內緩慢注入熒光探針2 μl。

1.2.4 TG標本制備 大鼠熒光探針注入標記72 h，心臟灌注處死、固定，斷頭，取TG，4%多聚甲醛固定至少2 h。

1.2.5 熒光檢測 取TG包埋固定，置于載玻片上，熒光顯微鏡觀察并拍照，分析并記錄熒光分布、數(shù)量及強度。

1.3 統(tǒng)計學處理 Leica圖像處理軟件對熒光強度行半定量測量分析，取平均值；采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間取單因素方差分析，后行t檢驗。

2 結果

2.1 模型組鑒定 40只行眶下神經慢性縮窄環(huán)手術大鼠中，32只造模成功，成功率達80%，隨機篩選20只。

2.2 假手術組熒光標記神經元在TG內分布

2.2.1 右側下中切牙牙髓熒光標記神經元在TG內分布 熒光探針Fast DiO 標記72 h后，于其右側TG局部區(qū)域檢測到綠色標記神經元(圖1A)，經明視野(可見光)鑒定，該神經元位于TG后外側區(qū)域(圖1B)，成簇聚集，數(shù)量約3～5個。左側TG未檢測到標記神經元(圖1C)。

圖1 右側下中切牙牙髓熒光標記神經元TG內分布

A：右側TG后外側區(qū)域見標記神經元(綠色)；B：TG后外側區(qū)域可見光檢測；C：左側TG后外側區(qū)域熒光檢測

2.2.2 左側上中切牙牙髓熒光標記神經元在TG內分布 熒光探針Fast DiO 標記72 h后，于其左側TG檢測到綠色標記神經元(圖2A)，經明視野鑒定位于TG中段區(qū)域(圖2B)，成簇局限分布。右側TG未檢測到標記神經元(圖2C)。

2.2.3 右側下中切牙及左側上中切牙牙髓熒光標記神經元在TG內分布 分別對右下及左上中切牙髓腔內分別注入Fast DiO(綠色)、Fast DiI(紅色)兩種熒光探針，標記72 h，于右側TG后外側區(qū)域檢測到綠色熒光標記神經元(圖3A)，于左側TG中段區(qū)檢測到紅色熒光標記神經元(圖3C)，均呈局限性分布，其它區(qū)域無。

2.2.4 左側上中切牙和左側下第一磨牙牙髓熒光標記神經元在TG內分布 左側上中切牙及下頜第一磨牙髓腔內分別注入熒光探針Fast DiI(紅色)和Fast DiO(綠色)，72 h后于左側TG后外側區(qū)域檢測到綠色標記神經元(圖4A)，左側TG中段區(qū)域檢測紅色標記神經元(圖4C)，均呈局限性分布，其它區(qū)域無。

圖2 左側上中切牙牙髓熒光標記神經元TG分布

A：左側TG中段區(qū)域標記神經元(綠色)；B：TG中段區(qū)域可見光檢測；C：右側TG中段區(qū)域熒光檢測

圖3 右側下中切牙及左側上中切牙雙標記牙髓神經元TG分布

A：右側TG后外側區(qū)熒光標記神經元(綠色)；B：右側TG后外側可見光檢測；C：左側TG中段區(qū)熒光標記神經元(紅色)；D：左側TG中段可見光檢測

2.3 模型組牙髓熒光標記神經元在TG內分布 與假手術組對比，模型組標記神經元在TG投射區(qū)域基本相似，所觀察到標記神經元數(shù)量差別不大，組間熒光強度經統(tǒng)計學分析差異也無統(tǒng)計學意義，見表1。

圖4 左側上中切牙和左側下頜第一磨牙牙髓熒光標記神經元TG分布

A：左側TG后外側區(qū)熒光標記神經元(綠色)；B：左側TG后外區(qū)可見光檢測；C：左側TG中段區(qū)熒光標記神經元(紅色)；D：左側TG中段區(qū)可見光檢測

表1 假手術組與模型組TG 4組熒光標記神經元平均熒光強度統(tǒng)計(n=5)

3 討論

TN疼痛劇烈，嚴重影響到患者生活，對于其病因有多種觀點，其中以中樞神經病變學說和周圍神經病變學說被大家廣泛接受。早期Duhner et al[5]認為TN系中樞異常導致，如脊束核癲癇樣放電。然而，TN發(fā)作范圍常為單側甚至局限于某一支，以及很多患者病情與腦干內病變并無相關性，這些現(xiàn)象無法用中樞病變學說解釋。周圍神經病變學說則認為TN由三叉神經根受壓迫致神經脫髓鞘病變導致，目前廣大學者也認同這一點，臨床結果也證實80%～90%TN系血管壓迫導致，血管減壓術的成功也證實這一點[6]。但臨床病例也存在很多用神經壓迫學說無法解釋的。故而有研究者開始將研究方向轉向病毒感染方面[7]，也有研究者認為一些神經介質、神經肽類物質參與TN發(fā)作[8-9]。

正因TN病因不明，以及三叉神經系統(tǒng)及其病理生理機制復雜，所以治療存在很多缺陷。其中針對TG水平的療法，如射頻溫控熱凝術、放療等，治療有效率達82.8%～96.3%，但是均會帶來過度感覺喪失[10]，因此本文采用神經元逆行熒光標記法來研究TG內神經元分布與分支(牙髓)對應關系，以及隨TN病變發(fā)生是否存在改變，來為臨床治療提供更詳細依據。

逆行熒光素標記法是指將熒光物質注入神經元末稍區(qū)域，熒光素被末稍神經攝取，后經軸漿運輸至胞體內。此法是一種追蹤神經系統(tǒng)聯(lián)系的方法，敏感度高、簡便，即可作雙標記又可做三標記，是目前研究神經側支投射、神經核團定位聯(lián)系及神經元化學通路的理想工具之一。在神經束路追蹤法研究中，以HRP法應用最為廣泛，其能較靈敏、準確地反映出追蹤細胞的定位。Charles et al[1]于1978年開始用HRP追蹤法對TG投射定位進行研究。隨后國內外學者開始采用此法來了解三叉神經各分支在TG內投射，發(fā)現(xiàn)存在一定規(guī)律，其上、下頜支分布區(qū)與本實驗結果類似[2,11-12]。國內學者柴盈 等[12]甚至采用HRP結合3D重建技術更直觀地再現(xiàn)了下頜神經在TG后外側的分布。然而HRP顯色方法復雜，又參與細胞代謝不能長期存留，并易擴散到鄰近組織造成神經元誤染。與之相比，熒光探針法不需染色，同時因熒光多樣性，可對神經各分支行多重標記。譚波濤 等[13]發(fā)現(xiàn)Fast DiI可針對一些內源性神經細胞胞質進行標記。

本研究選擇的熒光探針是Fast DiO、Fast DiI，均是親脂性羰花青細胞膜熒光探針，能對細胞膜染色，著色穩(wěn)定性高。注射后72 h取材，既保證染料能達TG區(qū)神經元，又保證探針不因代謝而使強度降低影響觀察。本實驗做熒光強度測量和分析時，因影響熒光強度因素很多，為形成一定標準，本實驗采取目標區(qū)域內平均熒光強度值與背景熒光值之差，做為目標區(qū)域內相對熒光強度值。

本實驗中用Fast DiO、Fast DiI分別對右側下中切牙、左側上中切牙髓腔行注射。結果在對應同側TG后外側、中段區(qū)觀察到熒光標記。考慮為右下、左上中切牙髓腔分別注入熒光素 Fast DiO、Fast DiI，經軸漿逆行運輸?shù)酵瑐萒G后外側、中間區(qū)。由此推測，三叉神經上、下頜支神經元分別投射于同側TG后外側、中間區(qū)。因此三叉神經各分支神經元在TG中投射有特定區(qū)域，為TN治療(如TG射頻溫控熱凝術位點和范圍)提供一定參考。本研究結果與相關研究[2,14]結果基本相符，與三叉神經各分支受特定神經元支配預測大致符合。相關研究者在貓、兔等動物研究中提出神經節(jié)神經元分布說法，本研究于大鼠實驗中進一步證實。但是對于TN病因研究仍是下一步研究方向。

通過神經元逆行熒光標記法，發(fā)現(xiàn)三叉神經上、下頜支神經元投射于同側TG特定區(qū)域，且TN產生后并不影響TG內神經元數(shù)量及投射關系，其產生可能與三叉神經元功能活動改變有關，如異常興奮。這些TN治療提供重要指導意義。接下來可通過研究TN病理生理機制，進一步探索病因及更佳治療方法。

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Xiao Fangli, Li Guochao, Ma Tengfei, et al

The neuronal soma trait of trigeminal nerve branch projecting to dental pulp in rat trigeminal ganglia

(College of Stomatology,Anhui Medical University, The Affiliated Stomatological Hospital ofAnhuiMedicalUniversity,KeyLabofOralDiseasesResearchofAnhuiProvince，Hefei230032)

Objective To observe the position relationship of neuronal somas in trigeminal ganglia(TG), which projects from different dental pulps in the normal and trigeminal neuralgia(TN) model rats, and provides anatomical theoretical guidance for the clinical treatment of TN. Methods Those experiments were divided into model group and control group. The retrograde fluorescent probes were injected into the different dental pulp cavities of rats in the two groups, and fluorescent microscope was used to observe distribution of fluorescence labeled neurons in TG. Results Green fluorescent probes Fast DiO were injected into right lower and left upper central incisor of rats in the two groups respectively, a few fluorescence labeled neuronal somas after 72 h could be detected in the posterolateral and the middle area of the ipsilateral TG, which distributed in clusters. Two different fluorescent probes Fast DiO and Fast DiI were injected respectively into right lower and left upper central incisor of rats in the two groups, green fluorescence labeled neuronal somas and red fluorescence labeled neuronal somas in cluster could be detected after 72 h in the posterolateral and the middle area of the ipsilateral TG of the two groups correspondingly. Fast DiI and Fast DiO were injected respectively into left upper central incisor and first molar in lower mandibular of rats in the two groups at the same time, green fluorescence labeled neuronal somas and red fluorescence labeled neuronal somas in cluster could be detected after 72 h in the middle area and the postermiddle area of left TG correspondingly. There was no statistically significant difference of labeled neuronal somas distribution, quantity and fluorescence intensity in TG between the two groups. Conclusion The neuronal somas of trigeminal nerve branches regional distributions on the ipsilateral side TG. The TN does not affect the number of neurons in TG and the projection. It may be associated with the change of trigeminal nerve function.

trigeminal ganglia; trigeminal neuralgia; retrograde fluorescent tags; nerve bundle road tracking method

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.030.html

國家自然科學基金(編號：81271162)；安徽省自然科學基金(編號:11040606M204)；安徽省高等學校省級優(yōu)秀青年人才基金(編號：2012SQRL070)

1安徽醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，安徽醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究中心實驗室,合肥230032

2安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室，合肥 230032

肖芳莉，女，碩士研究生；

王元銀，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail:wyy1970548@sohu.com

R 745.11

A

1000-1492(2016)01-0064-05

2015-10-20接收