FTIR結(jié)合聚類分析法在姜科植物物種分類及鑒別中的應(yīng)用

劉艷,司民真,李家旺,張川云,張德清,李倫,熊洋

(1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院,昆明 650500;2.楚雄師范學(xué)院光譜應(yīng)用技術(shù)研究所,云南省高校分子光譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,楚雄 675000)

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FTIR結(jié)合聚類分析法在姜科植物物種分類及鑒別中的應(yīng)用

劉艷1,2,司民真2*,李家旺2,張川云2,張德清2,李倫2,熊洋2

(1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院,昆明 650500;2.楚雄師范學(xué)院光譜應(yīng)用技術(shù)研究所,云南省高校分子光譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,楚雄 675000)

利用傅里葉變換紅外光譜儀分別檢測(cè)17種姜科植物的的光譜特征,并通過系統(tǒng)聚類和相關(guān)性系數(shù)法來探討各植物間的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示,聚類分析樹系圖和相關(guān)性分析結(jié)果相吻合,當(dāng)花葉山姜和黑果山姜的距離系數(shù)為1(最小),相關(guān)系數(shù)為0.991(最高),親緣關(guān)系最近。該研究得出同亞屬植物間、野草果與山姜屬植物屬近緣種,支持了頂花莪術(shù)、溫郁金在分類系統(tǒng)中的獨(dú)立性,建議劃分為獨(dú)立種。聚類分析中姜科植物種間的聚合較好,物種鑒定正確率達(dá)到100%。因此,FTIR結(jié)合聚類分析法在姜科植物物種分類及鑒別中是一種可行性手段。

傅里葉變換紅外光譜;姜科植物;相關(guān)性; 分類

1 引言

姜科草本植物是我國重要的中藥材之一,它的根莖,味辛、性溫,有抗氧化、開胃健脾、防暑、降溫、提神、殺菌解毒的功效,常用來抑制腫瘤、促進(jìn)食欲、脾胃虛寒、惡心嘔吐、 鼻塞頭痛等。紅豆蔻、云南草蔻、長(zhǎng)柄山姜是山姜屬植物,已被收載于《中華本草》。寬絲豆蔻、荽味砂仁、野草果是豆蔻屬植物；郁金、印尼莪術(shù)、溫郁金、頂花莪術(shù)是姜黃屬植物。其中紅豆蔻、云南草蔻、野草果、郁金、溫郁金等已被收錄于《中國藥典》。在《中國藥典》(2005年版)收錄的中藥材郁金是該屬植物溫郁金等的干燥塊根,近莪術(shù)類藥材的干燥塊根也可作為郁金藥用[1]。其次,姜科植物中的名稱大多是“豆蔻”“砂仁”“郁金”“莪術(shù)”“山姜”等易混學(xué)名,為此,藥學(xué)及分類出現(xiàn)混雜現(xiàn)象,傳統(tǒng)分類學(xué)也難以分清各姜科植物間的親緣關(guān)系。因此,對(duì)姜科植物的物種分類及鑒別是臨床應(yīng)用和鑒別檢驗(yàn)的研究關(guān)鍵。

近年來,用紅外光譜法來探討不同類群間的親緣關(guān)系及物種鑒定已有很多報(bào)道,涉及種類繁多。有被子、蕨類、苔蘚植物等[2],這在植物分類學(xué)中對(duì)培育新品種選取母本植物非常有意義。國內(nèi)許多專家學(xué)者對(duì)姜科植物的識(shí)別、鑒定和分析也做了許多工作。目前,對(duì)姜科植物的研究主要有DNA條形碼鑒定研究[3],根據(jù)來源、功效、成分、性狀來進(jìn)行區(qū)別[4],顯微鑒別[5],薄層色譜鑒別以及多態(tài)性分析技術(shù)(RAPD)[6]等。與這些方法相比,傅里葉變換紅外光譜法改善了其它方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、制樣復(fù)雜、重復(fù)性不好的缺點(diǎn),還具有特征性強(qiáng)、信息量大、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。本文將首次利用傅里葉紅外光譜法結(jié)合聚類分析為姜科植物分類及親緣關(guān)系分析提供一種快捷、準(zhǔn)確的振動(dòng)光譜鑒別方法。紅外光譜分析技術(shù)用于姜科植物的分類、親緣關(guān)系、品種鑒定研究尚未見報(bào)道。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

紅外光譜儀為Thermo Scientific NicoletTMiSTM5 spectrometer傅里葉變換紅外光譜儀,掃描范圍4000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,掃描次數(shù)16次。

2.1.1 樣品來源、制備、檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)材料均采自于西雙版納。取同一時(shí)期17種藥材的根來進(jìn)行測(cè)試,具體樣品見表1。樣品清洗后晾干,經(jīng)粉碎后過100目篩,取適量進(jìn)行研磨成粉末,用電子天平稱取1 mg的粉末樣品和100 mg的溴化鉀,按1∶100的比例混合后攪磨均勻,壓片測(cè)紅外光譜。同一種植物測(cè)5個(gè)光譜,前4個(gè)用來計(jì)算平均光譜,后一個(gè)用來作待測(cè)樣品。光譜均扣除溴化鉀背景,光譜數(shù)據(jù)用Omnic8.0軟件進(jìn)行自動(dòng)基線校正、縱坐標(biāo)歸一化、9點(diǎn)平滑、二階導(dǎo)數(shù)處理,應(yīng)用IBM Spass Statistics 20進(jìn)行系統(tǒng)聚類和相關(guān)性分析。

Table.1 Sample table of Zingiberaceae plants

3 結(jié)果與分析

3.1 譜圖解析及聚類、相關(guān)分析的數(shù)據(jù)選擇

圖1是17種姜科植物的平均紅外光譜圖。從圖1中可見,不同種姜科植物的紅外振動(dòng)光譜比較相似。為了便于比較分析,將17種植物的共有譜峰振動(dòng)及歸屬情況歸結(jié)于表2。由圖1、表2結(jié)合參考文獻(xiàn)[7-9]對(duì)譜帶進(jìn)行歸屬分析：在3000～2800 cm-1范圍內(nèi)為亞甲基碳?xì)渖炜s振動(dòng),歸屬為揮發(fā)油類的貢獻(xiàn)。1736 cm-1處的吸收峰可能來自于鞣質(zhì)、黃酮類C=O的伸縮振動(dòng)峰;1635 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)而寬,可能含有N-H的彎曲振動(dòng),歸屬為蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ帶;1516 cm-1附近的峰歸為芳香族化合物的特征峰。1425～1300 cm-1波段的吸收峰來自C-H鍵的振動(dòng)吸收。1300～1200 cm-1范圍的峰歸屬為酚類中C-O和蛋白質(zhì)中的C-N伸縮振動(dòng)峰的疊加區(qū)域。1200～1000 cm-1范圍內(nèi)主要有糖類和皂苷類物質(zhì)的貢獻(xiàn)。900～700 cm-1波段主要包含C-O、C-N、C-C的伸縮(彎曲)振動(dòng)吸收峰。以上分析的結(jié)構(gòu)特征與其他研究者報(bào)道姜的化學(xué)成分主要含有揮發(fā)油、二苯基庚烷、黃酮、鞣質(zhì)、多糖、氨基酸等化合物相吻合[7]。從圖1和表2可得出,17種姜科植物在4000～1000 cm-1的紅外峰共有11個(gè),在峰位相差5cm-1以內(nèi),共有峰為9個(gè),占總峰數(shù)的82%,這表明17種姜科植物所含的化學(xué)成分大體相似。

圖1中,直觀可看到1800～1000 cm-1范圍內(nèi)的峰強(qiáng)和峰形有差異,其中苯環(huán)的骨架振動(dòng)區(qū)域1600～1400 cm-1、糖類的特征區(qū)域1200～1000 cm-1范圍的峰形和峰強(qiáng)有明顯的差異。比如圖1a中,節(jié)鞭山姜、紅豆蔻、寬唇山姜、云南草蔻有糖類特征峰1105、1155、1078 cm-1階梯峰,而其余幾種沒有；圖1b中,呂氏砂仁的糖類特征峰1099 cm-1附近的吸收峰尖銳而單一,寬絲豆蔻、荽味砂仁、溫郁金的糖峰鈍而寬,明顯異于其它藥材的階梯峰,這說明不同種藥材中糖的類型和含量存在很大的不同。根據(jù)1800～1000 cm-1范圍內(nèi)譜峰所包含的信息歸屬和吸光度特點(diǎn),特征性較強(qiáng),信息量較大,因此選用1800～1000 cm-1波段作為姜科植物光譜聚類和相關(guān)分析的數(shù)據(jù)建立模型。

Fig.1 FTIR Average spectra of 17 Zingiberaceae

A:A.pumila,B:A.Kwangsiensis,C:A.Formosana,D:A.conchigera,E:A.hainanensis,F:A.galanga,G:A.Petaloideum,H:A.blepharocalyx,K:A.Nigra.a:A.platychilus,b:C.wenyujin,c:A.coriandriodorum,d:lushisharen,e:A.koenigii,f:C.Aromatica,g:C.xanthorrhiza,h:C.yunnanensis.

Table.2 The characteristic peak FTIR data of Zingiberaceae

3.2 聚類分析

聚類分析(cluster analysis)是一類將樣品按相似程度(距離遠(yuǎn)近)劃分類別,使得同一類中的元素之間的相似性比其他類的元素的相似性更強(qiáng)。選用1800～1000 cm-1波段的原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行建模,其分類效果不太理想,種間的聚類效果錯(cuò)誤率很高,這可能是原始數(shù)據(jù)中關(guān)鍵峰重疊或隱藏所致。再次對(duì)此波段的數(shù)據(jù)進(jìn)行二階導(dǎo)處理,二階導(dǎo)能更好的將重疊峰分裂開來,將更大程度地豐富信息量,從而進(jìn)行聚類建模。

Fig.2 Cluster analysis of FTIR fingerprint of 85Zingiberaceaesamples

基于余弦距離,應(yīng)用系統(tǒng)聚類中的組間聯(lián)接法表征17種姜科植物85個(gè)樣品的樹系圖(見圖2)。參照傳統(tǒng)分類,對(duì)樹系圖進(jìn)行分析。當(dāng)圖2中距離為3時(shí),野草果有2個(gè)樣品獨(dú)立成一類,呂氏砂仁有2個(gè)樣品和長(zhǎng)柄山姜聚在一起；當(dāng)距離為5時(shí),每種植物的5個(gè)樣品全聚在一起,聚合度較好,正確率達(dá)100%。

基于此模型,取每種植物的4條光譜進(jìn)行平均光譜處理,并利用平均光譜進(jìn)行二階導(dǎo),用二階導(dǎo)數(shù)來對(duì)17種姜科植物進(jìn)行屬間分類。結(jié)果如圖3所示。

Fig.3 Cluster analysis of FTIR fingerprint of 17Zingiberaceaeplants

當(dāng)距離為5時(shí),17個(gè)樣品分成了7類,黑果山姜、花葉山姜、草豆蔻、紅豆蔻、長(zhǎng)柄山姜、節(jié)鞭山姜、野草果、美山姜、云南草蔻、寬唇山姜聚為一類,頂花莪術(shù)、郁金聚為一類,呂氏砂仁、溫郁金、印尼莪術(shù)、寬絲豆蔻、荽味砂仁各成一類。距離為13時(shí),分成了3類,第一類包括黑果山姜、花葉山姜、草豆蔻、紅豆蔻、長(zhǎng)柄山姜、節(jié)鞭山姜、野草果、美山姜、云南草蔻、寬唇山姜；第二類包括：頂花莪術(shù)、郁金、呂氏砂仁、溫郁金、印尼莪術(shù)；第三類包括：寬絲豆蔻、荽味砂仁。根據(jù)中科院植物研究系統(tǒng)中以形態(tài)特征對(duì)姜科植物的分類來看,黑果山姜、花葉山姜、草豆蔻、紅豆蔻、長(zhǎng)柄山姜、節(jié)鞭山姜、美山姜、云南草蔻、寬唇山姜是山姜屬植物；寬絲豆蔻、荽味砂仁、野草果是豆蔻屬植物；郁金、印尼莪術(shù)、溫郁金、頂花莪術(shù)是姜黃屬植物,呂氏砂仁暫無相關(guān)資料說明,待定。同屬間的物種親緣較近,該實(shí)驗(yàn)結(jié)論支持這種說法,山姜屬、豆蔻屬、姜黃屬在距離13時(shí)完全分開,分成了3類,這與傳統(tǒng)分類相一致,但也存在一定的差異,如豆蔻屬野草果和山姜屬聚在了一起。究其本真,這是從光譜特征的角度對(duì)姜科植物的分類來提供參考。

3.3 相關(guān)分析

相關(guān)系數(shù)一般在“0-1”之間,兩樣品間的相關(guān)系數(shù)越大,表明它們的關(guān)系越近[10]。由表可知,每一種姜和其余16種植物分別進(jìn)行相關(guān)性分析,可以得到兩兩的相關(guān)系數(shù),0.980以上的物種間系數(shù)從高到低的排列為：花葉山姜和黑果山姜(0.991)、花葉山姜和草豆蔻(0.988)、黑果山姜和野草果(0.987)、黑果山姜和草豆蔻(0.986)、節(jié)鞭山姜和長(zhǎng)柄山姜(0.985)、長(zhǎng)柄山姜和草豆蔻(0.984)、黑果山姜和紅豆蔻(0.983)、花葉山姜和紅豆蔻(0.981)、美山姜和野草果(0.980)；0.001以下的相關(guān)系數(shù)有：呂氏砂仁和草豆蔻(0.000)、印尼莪術(shù)和長(zhǎng)柄山姜(0.000)、呂氏砂仁和紅豆蔻(0.001)、美山姜和呂氏砂仁(0.001)、美山姜和印尼莪術(shù)(0.001)。相關(guān)系數(shù)表示距離的遠(yuǎn)近,和聚類樹形圖的結(jié)果相一致。

Table.3 The correlation coefficient between the 17 Zingiberaceae plants

3.4 品種鑒定

取出待測(cè)樣品,編號(hào)為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、O、P、Q、L、M、N。將此組數(shù)據(jù)進(jìn)行9.0平滑、自動(dòng)基線校正、二階求導(dǎo),取1800～1000 cm-1范圍內(nèi)的吸光度,放入已建立起來的模型中進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示如圖4。同種物質(zhì)間的距離系數(shù)很小,在距離為1時(shí),A與紅豆蔻聚在一起,可以判定A是黑果山姜；B與頂花莪術(shù)聚在一起,可以判定B是頂花莪術(shù)；依次類推,C是寬絲豆蔻,D是呂氏砂仁,E是荽味砂仁,F是溫郁金,G是野草果,H是郁金,I是云南草蔻,J是印尼莪術(shù),K是長(zhǎng)柄山姜,O是黑果山姜,P是花葉山姜,Q是節(jié)鞭山姜,L是寬唇山姜,M是美山姜,N是草豆蔻。距離系數(shù)越小的親緣關(guān)系越近[10],同種物之間的距離系數(shù)是最小的,因此,可以利用已建立起來的系統(tǒng)聚類模型來對(duì)未知樣品的品種進(jìn)行鑒定。

Fig.4 Clustering result of species identification of 17Zingiberaceaeplants

4 討論

4.1 姜科植物的親緣關(guān)系分析

聚類分析中,樹系圖的距離系數(shù)越小,表示關(guān)系越近；相關(guān)性分析中,相關(guān)系數(shù)越大,表示親緣越近。結(jié)合圖3、表3進(jìn)行討論：

(1)以形態(tài)特征分類的《中國植物志》中,長(zhǎng)柄山姜與云南草蔻屬于近緣植物。在本實(shí)驗(yàn)中,距離為3時(shí),長(zhǎng)柄山姜與云南草蔻聚在一起且相關(guān)系數(shù)為0.882。說明長(zhǎng)柄山姜與云南草蔻關(guān)系近,這與納智[11]從揮發(fā)油化學(xué)分類的角度贊同《中國植物志》“長(zhǎng)柄山姜和云南草蔻同屬艷山姜亞屬且親緣較近[12]”的結(jié)論相符。在距離為1時(shí),長(zhǎng)柄山姜與節(jié)鞭山姜、紅豆蔻、草豆蔻、花果山姜、黑果山姜、美山姜聚在一起且相關(guān)系數(shù)為0.985、 0.979、0.984、0.978、0.977、0.965,其中距離為1(最小)時(shí),花葉山姜和黑果山姜的相關(guān)系數(shù)為0.991(最大),關(guān)系最近。相關(guān)系數(shù)在亞屬分類的層次上,山姜亞屬(紅豆蔻、花葉山姜)、艷山姜亞屬(云南草蔻、長(zhǎng)柄山姜、草豆蔻)、黑果山姜亞屬(節(jié)鞭山姜、黑果山姜)的親緣與傳統(tǒng)分類有一致性,因此該實(shí)驗(yàn)提出同亞屬植物大多是近緣植物的觀點(diǎn)。

(2)《中國藥典》(2005年版)中規(guī)定,溫郁金塊根可用作郁金入藥,且有學(xué)者根據(jù)葉背有無毛建議溫郁金繼續(xù)用曾用名郁金[13]。本實(shí)驗(yàn)中,郁金和溫郁金在距離為12時(shí)才聚在一起且相關(guān)系數(shù)為0.607(偏低),說明兩者差異較大,此結(jié)論與劉念等[13]的酶譜研究一樣不贊成溫郁金為郁金的栽培變種[12]。此外,溫郁金與其他藥材樹系圖間的距離較遠(yuǎn),相關(guān)系數(shù)均在0.270以下,其中溫郁金與紅豆蔻的相關(guān)系數(shù)為0.005(較低),與美山姜的相關(guān)系數(shù)為0.01(較低),說明溫郁金和不同種類間的遺傳差異較大,這支持了陳毓亨等將溫郁金劃分為獨(dú)立種[14]的主張。

(3)印尼莪術(shù)與溫郁金、頂花莪術(shù)在遠(yuǎn)距離處聚在一起,且相關(guān)系數(shù)為0.263、0.556。說明印尼莪術(shù)與溫郁金、頂花莪術(shù)的親緣較遠(yuǎn)。童紹全以印尼莪術(shù)部分根莖與塊根顏色為黃紅色或黃色不同于其它姜黃屬莪術(shù)類為由,擬名為姜紅姜黃[15]。該結(jié)論支持了肖小河等[16]數(shù)值分類下該種在姜黃屬系統(tǒng)分類中的獨(dú)立性,與楊元慶等[17]將印尼莪術(shù)歸為一類相一致。結(jié)合童紹全、肖小河和楊元慶等的研究結(jié)果,該實(shí)驗(yàn)支持將印尼莪術(shù)劃分獨(dú)立種。印尼莪術(shù)中姜黃素類和揮發(fā)油的單株產(chǎn)量均較高,具有很好的開發(fā)前景。

(4)寬絲豆蔻與荽味砂仁聚在一起且相關(guān)系數(shù)為0.708,但與同屬野草果在樹系圖上距離很遠(yuǎn),相關(guān)系數(shù)為0.012,這在形態(tài)學(xué)上,以葉兩面無毛,葉柄近圓,葉鞘有縱條紋等特點(diǎn)將寬絲豆蔻、野草果、荽味砂仁歸為一個(gè)屬[12]有差異。同時(shí)寬絲豆蔻有葉不被毛、根莖發(fā)達(dá)等特點(diǎn),生境和形態(tài)都與其它種有一定的差異。表明寬絲豆蔻在種間的遺傳差異較大,并提出寬絲豆蔻與荽味砂仁關(guān)系近,與其它種植物關(guān)系遠(yuǎn)。

(5)呂氏砂仁在樹系圖上距離很遠(yuǎn)時(shí)與溫郁金聚在一起,且與各物種的相關(guān)系數(shù)均很小,在0.020以下,有關(guān)呂氏砂仁的形態(tài)特征、分子生物等方面的研究尚未見報(bào)道,根據(jù)系統(tǒng)聚類和相關(guān)性分析的結(jié)果,該實(shí)驗(yàn)提出呂氏砂仁可作為一個(gè)新種,今后將深入進(jìn)行這方面的研究。

(6)在距離13時(shí),山姜屬、豆蔻屬、姜黃屬被分成了3類,與傳統(tǒng)分類相比,豆蔻屬野草果和山姜屬聚在了一起,屬間分類正確率達(dá)到94.1%。距離為1時(shí),野草果與山姜屬植物聚在了一起,相關(guān)系數(shù)均在0.970以上,說明野草果與山姜屬植物關(guān)系較近。

根據(jù)以上的討論,建議對(duì)呂氏砂仁、寬絲豆蔻與野草果作進(jìn)一步研究,如分子生物學(xué)、數(shù)值分類和形態(tài)顯微方面等的深入,再次確定它們的分類情況及地位。期望有多領(lǐng)域的方法和FTIR的深入研究,使得姜科植物的分類系統(tǒng)得到進(jìn)一步的完善。

4.2 聚類模型在物種鑒定中的應(yīng)用

系統(tǒng)聚類模型體現(xiàn)了“物以類聚”的思想,對(duì)于同種樣品間的測(cè)定,5份樣品聚合都較好。作親緣分析,親緣近的物種間距離系數(shù)小,同一種物種間距離系數(shù)小至為零,因此用傅里葉紅外光譜數(shù)據(jù)建立起的模型來檢測(cè)未知樣品,其正確率達(dá)到了100%,其結(jié)果可靠、穩(wěn)定。

5 結(jié)論

利用FTIR結(jié)合聚類分析法對(duì)17種姜科植物進(jìn)行物種分類與鑒定,其種間的聚類正確率達(dá)100%,屬間的分類與傳統(tǒng)分類有一定的差異,該結(jié)果表明：(1)同亞屬植物間、野草果與山姜屬植物屬近緣種；(2)溫郁金和印尼莪術(shù)各成一類,劃分獨(dú)立種。用FTIR的標(biāo)準(zhǔn)聚類模型來對(duì)未知樣品進(jìn)行檢測(cè),其正確率達(dá)100%。該方法獲得的信息量大、速度快、準(zhǔn)確率高,說明FTIR結(jié)合聚類分析法可以作為姜科植物物種分類及鑒別的可行性手段。

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Application of FTIR Combined with Cluster Analysis in Classification and Identification of Plant Species in the Zingiberaceae Plants

LIU Yan1,SI Ming-zhen2*,LI Jia-wang2,ZHANG Chuan-yun2,ZHANG De-qing2,LI Lun2,XIONG Yang2

(1.SchoolofPhysicsandElectronicInformation,YunnanNormalUniversity,Kunming650500,Yunnan,China;2.YunnanKeyLaboratoryofuniversitiesforMolecularSpectrum,Instituteofspectralappliedtechnology,ChuxiongNormalUniversity,Chuxiong675000,China)

FTIR spectra from 11 kinds ofZingiberaceaeby Fourier transform infrared spectroscopy method combined with the system clustering and correlation coefficient method were used to explore the relationship among the plants.The results show that the cluster analysis is consistent with the results of the correlation analysis,When the distance coefficients ofA.kwangsiensis&LSSR was 1 (minimum),the correlation coefficient was 0.950 (highest),phylogenetic relationships recently; 25 (maximum distance coefficientA.blepharocalyxandC.wenyujin),correlation coefficient of 0.005 (minimum),phylogenetic relationships farthest.The study draws thatA.kwangsiensisand LSSR,C.xanthorrhizaandA.petaloideumare closely related to species,and supported the independence ofC.wenyujinandC.yunnanensisin the classification system,the proposal is divided into separate species.The clustering analysis of the plant species is better,and the correct rate of species identification was 100%.FTIR-cluster analysis can be used as a possible means for the classification and identification ofZingiberaceae.

Fourier transform infrared spectroscopy;Zingiberaceae; correlation coefficient; classification

2015-07-29; 修改稿日期:2016-11-20

國家自然科學(xué)基金(13064001,10864001)

劉艷(1990-),女,傈僳族,碩士,主要從事生物光譜學(xué)方面研究.E-mail:340596704@qq.com

司民真,E-mail:siminzhen@hotmail.com

1004-5929(2016)03-0252-07

O657.37

A

10.13883/j.issn1004-5929.201603010