核苷類似物替比夫定對免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用

顧宇峰 黃莉莉 孫偉 宗雪萍 譚曉慧 湯偉

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核苷類似物替比夫定對免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用

顧宇峰 黃莉莉 孫偉 宗雪萍 譚曉慧 湯偉

目的 觀察替比夫定對小鼠細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法 BALB/C小鼠48只，隨機(jī)分為3組：正常對照組、替比夫定組和環(huán)磷酰胺模型組。正常對照組與環(huán)磷酰胺模型組小鼠給予生理鹽水(0.2 mL/只)灌胃，替比夫定組小鼠給予替比夫定(86.5 mg/kg)灌胃，每日1次，共35 d。自第29天起，環(huán)磷酰胺模型組、替比夫定組小鼠給予環(huán)磷酰胺(30 mg/kg)腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥后第2天，處死所有小鼠并取標(biāo)本待檢。小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞以GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL)培養(yǎng)7 d以誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)。DC細(xì)胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達(dá)采用流式細(xì)胞儀檢測。DCs與C57BL/6鼠T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)4 d后，采用MTT比色法檢測淋巴細(xì)胞增殖狀況。小鼠血清中IL-4、IFN-γ濃度采用ELISA檢測。結(jié)果 替比夫定組小鼠DC細(xì)胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達(dá)水平明顯高于環(huán)磷酰胺模型組(PMHC-Ⅱ<0.05，PCD40<0.01)。DCs與脾T淋巴細(xì)胞混合例為1∶10、1∶20，替比夫定組小鼠DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖能力均高于環(huán)磷酰胺模型組(P1∶10<0.01，P1∶20<0.05)。替比夫定組小鼠血清中IFN-γ的濃度高于環(huán)磷酰胺模型組(PIFN-γ<0.05)，但兩組的血清IL-4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PIL-4>0.05)。結(jié)論 替比夫定對細(xì)胞免疫功能具有一定的增強(qiáng)作用。

替比夫定；樹突狀細(xì)胞；IFN-γ；IL-4；慢性乙型肝炎

慢性乙型肝炎治療的最基礎(chǔ)和關(guān)鍵措施是有效地抑制體內(nèi)的HBV復(fù)制乃至清除HBV，其已成為共識。核苷(酸)類似物由于具有抑制病毒復(fù)制速度較快、服用方便、副作用較少及治療費(fèi)用相對較低等優(yōu)點(diǎn)而成為慢性乙型肝炎抗病毒治療的最主要的選擇。但患者長期服用此類藥物后停藥仍常有復(fù)發(fā)，如為HBeAg陽性患者治療后未能實(shí)現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換而停藥則復(fù)發(fā)率更高。替比夫定的一些臨床研究結(jié)果顯示，持續(xù)接受替比夫定治療2年、3年、4年后患者的HBeAg血清轉(zhuǎn)換率分別為32%、46%、53.2%，且經(jīng)該藥治療獲得滿意應(yīng)答的患者停藥60周和204周后的累積復(fù)發(fā)率僅為16.3%和23.3%[1-2]。為探究該藥良好療效的機(jī)制，一些學(xué)者進(jìn)行了基礎(chǔ)和臨床研究。多位學(xué)者觀察到以替比夫定治療的慢性乙型肝炎患者可出現(xiàn)外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例降低、樹突狀細(xì)胞成熟度改善及Th1類細(xì)胞因子水平升高等變化[3-5]；另有學(xué)者報(bào)道，替比夫定可在體外促進(jìn)感染3型鼠肝炎病毒小鼠巨噬細(xì)胞的TNF-α、IL-12 mRNA轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞因子分泌[6]；本研究組曾觀察到替比夫定可提高環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力[7]。為進(jìn)一步驗(yàn)證替比夫定是否具有免疫調(diào)節(jié)作用，本研究采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型，觀察其對小鼠細(xì)胞免疫的影響。

資料和方法

一、材料與儀器

BALB/C小鼠(SPF級) 48只，雌性，體重(20±2) g，4～5周齡；C57BL/6小鼠(SPF級) 8只，雌性，體重(20±2) g，4～5周齡；均由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SC×K(蘇)2008-0010，使用許可證號：SC×K(蘇)2007-0021。 環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號：10051821)。替比夫定：北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)(批號：x0243)。四甲基偶氮唑鹽(MTT)：購自美國Sigma公司。重組鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重組鼠白細(xì)胞介素-4(rmIL-4)：均購自美國PEPROTECH公司。 藻紅蛋白(PE)標(biāo)記抗小鼠MHC-Ⅱ類分子抗體、CD40抗體：美國Biolegend公司。 IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒：上海依科塞生物制品有限公司。ELX800通用酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)、流式細(xì)胞儀(美國BECTON DICKINSON公司)。

二、方法

(一)動(dòng)物分組與處理 48只小鼠隨機(jī)分為正常對照組、環(huán)磷酰胺模型組與替比夫定組，每組16只。正常對照組與環(huán)磷酰胺模型組小鼠給予生理鹽水(0.2 mL/只)灌胃，替比夫定組小鼠給予替比夫定溶液(86.5 mg/kg體重，0.2 mL/只)灌胃，每日1次，共35 d；自第29日起在灌胃后，環(huán)磷酰胺模型組、替比夫定組小鼠給予環(huán)磷酰胺30 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d，以制備小鼠免疫抑制模型[8]。于末次給藥后第2天，對各實(shí)驗(yàn)小鼠以摘眼球法取血，分離血清，-80℃冰箱保存。

(二)小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(DC)的誘導(dǎo)與培養(yǎng) 處死小鼠后取股骨，用RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集沖洗液體，去除紅細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞(2×106個(gè)/mL)，分置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2、100%濕度下培養(yǎng)；24 h后全量換液，每孔加入GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)至第8天，收集懸浮細(xì)胞(即為DCs)。

(三)DC表面分子檢測 收集培養(yǎng)至第8天的DC，PBS洗滌后重懸(5×105/mL)；將DC細(xì)胞懸液加入流式管中，各流式管中分別加入MHC-Ⅱ-PE抗體、CD40-PE抗體，4℃避光孵育30 min；PBS洗滌后重懸；以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測細(xì)胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達(dá)。

(四)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 收集培養(yǎng)至第8天的各組DCs，用PBS洗滌后以完全培養(yǎng)液重懸(5×105個(gè)/mL)。取C57BL/6小鼠，頸椎脫臼處死后取脾，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，加入淋巴細(xì)胞分離液中，離心后吸取單個(gè)核細(xì)胞層，PBS洗滌后以完全培養(yǎng)液重懸(10×106/mL)。實(shí)驗(yàn)于96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，每例設(shè)3個(gè)復(fù)孔：實(shí)驗(yàn)孔加入DCs和脾T淋巴細(xì)胞(DCs/T的比值分別為1∶10、1∶20)，對照孔僅加入脾T淋巴細(xì)胞；37℃、5% CO2、孵育4 d。每孔加入20 μL MTT，再孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜100 μL/孔，10 min后用酶標(biāo)儀以570 nm波長測各孔OD值并計(jì)算各孔的DC刺激指數(shù)(SI)：

SI=實(shí)驗(yàn)孔OD值÷對照孔OD值

(五)小鼠血清中IL-4、IFN-γ濃度的檢測 采用雙抗體夾心ELISA法，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后于10分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀以450 nm波長測各孔OD值。根據(jù)IL-4、IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和相應(yīng)OD值，求出IL-4、IFN-γ濃度回歸方程分別為：y=-52.593x2+519.99x-9.3818(IL-4)；y=30.633x2+406.22x+9.7033(IFN-γ)。將各小鼠血清標(biāo)本的OD值分別代入回歸方程計(jì)算出該標(biāo)本的細(xì)胞因子濃度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、替比夫定對小鼠DC細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響

收集培養(yǎng)第8天的DC，以流式細(xì)胞儀分析。3組小鼠DC細(xì)胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達(dá)水平均有明顯差異(F(MHC-Ⅱ)=13.04，P<0.01；F(CD40)=21.21，P<0.01)：正常對照組DC細(xì)胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達(dá)均高于環(huán)磷酰胺模型組和替比夫定組；替比夫定組小鼠DC細(xì)胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達(dá)均高于環(huán)磷酰胺模型組；詳見表1。 圖1為各組DC細(xì)胞表面分子的流式檢測圖。

二、替比夫定對DC體外刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

3組小鼠DC刺激淋巴細(xì)胞增殖能力(DC刺激指數(shù) SI)有明顯差異(F(1∶10)=52.10，P<0.01；F(1∶20)=27.11，P<0.01)：正常組小鼠DC刺激淋巴細(xì)胞增殖能力高于替比夫定組和環(huán)磷酰胺模型組；替比夫定組小鼠DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖能力高于環(huán)磷酰胺模型組；詳見表2。

三、替比夫定對小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4水平的影響

3組小鼠的血清中IFN-γ和IL-4濃度均有明顯差異(F(IFN-γ)=15.12，P<0.01；F(IL-4)=12.52，P<0.01)：正常對照組小鼠血清中IFN-γ的濃度高于替比夫定組和環(huán)磷酰胺模型組小鼠，替比夫定組小鼠血

圖1 各組DC細(xì)胞表面分子流式檢測結(jié)果圖

組別例數(shù)MHC-ⅡCD40正常對照組868.358±5.73357.388±5.837替比夫定組859.564±5.653a49.470±4.746a環(huán)磷酰胺模型組852.606±7.059bc36.673±8.189bd

注：aP<0.05，bP<0.01，與正常對照組比較；cP<0.05，dP< 0.01，與替比夫定組比較

表2 各組小鼠DC刺激脾淋巴細(xì)胞增殖能力(±s)

注：aP<0.05，bP<0.01，與正常對照組比較；cP<0.05，dP<0.01，與替比夫定組比較

表3 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-4濃度(pg/mL，±s)

注：aP<0.05，bP<0.01，與正常對照組比較；cP<0.05，與替比夫定組比較

清中IFN-γ的濃度高于環(huán)磷酰胺模型組；與正常對照組比較，替比夫定組和環(huán)磷酰胺模型組小鼠血清中IL-4的濃度均較低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但這兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；詳見表3。

討 論

CHB的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但一致認(rèn)為與病毒因素及宿主免疫功能密切相關(guān)。機(jī)體的免疫系統(tǒng)中參與清除HBV的機(jī)制包括細(xì)胞免疫和體液免疫，其中細(xì)胞免疫正常與否決定HBV感染機(jī)體后轉(zhuǎn)歸的最重要因素。大量研究資料發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者存在免疫功能缺陷，不能有效清除體內(nèi)HBV而導(dǎo)致病毒持續(xù)感染[10]。

抗原提呈細(xì)胞(APC)具有捕捉處理抗原、并將抗原提呈給淋巴細(xì)胞，使后者活化、增殖并發(fā)揮免疫應(yīng)答效應(yīng)的重要功能。體內(nèi)的DC按其發(fā)育分化程度可分為成熟DC和未成熟DC，二者的生物學(xué)特征有明顯差異。成熟DC高表達(dá)MHC-Ⅱ類分子和CD40、CD80等，體外激發(fā)MLR能力和抗原提呈能力強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常人比較，CHB患者外周血DC細(xì)胞表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ類分子等的表達(dá)不足，刺激T細(xì)胞增殖、自體CTL細(xì)胞毒作用的能力均明顯降低，可能是CHB患者抗HBV特異性應(yīng)答不足的重要原因之一[11]。本項(xiàng)研究中，觀察到替比夫定治療組小鼠DC細(xì)胞的MHC-Ⅱ和CD40等表面分子表達(dá)水平和刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力均明顯高于環(huán)磷酰胺模型組，提示該藥不僅能夠促進(jìn)DC細(xì)胞的發(fā)育和分化，提高體內(nèi)成熟DC水平，而且能夠改善DC細(xì)胞刺激T細(xì)胞活化增殖的功能。

CD4+Th細(xì)胞是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的一類重要調(diào)節(jié)性細(xì)胞, CD4+T 細(xì)胞分為Thl 和Th2 兩個(gè)亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞毒性T 細(xì)胞(CTL) 介導(dǎo)的細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞的主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，通過這些細(xì)胞因子下調(diào)Th1細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。目前認(rèn)為宿主免疫調(diào)控紊亂尤其是Th1/Th2反應(yīng)失衡可能是導(dǎo)致HBV持續(xù)感染和慢性乙型肝炎的重要原因之一。曾氏等[12]研究發(fā)現(xiàn)：急性乙型肝炎患者相比，慢性乙型肝炎患者血清中的IL-2和IFN-γ水平明顯降低而IL-4水平明顯升高。 本實(shí)驗(yàn)中觀察到，替比夫定組小鼠血清的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的含量明顯高于環(huán)磷酰胺模型組，而Th2型細(xì)胞因子IL-4的血清水平在兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果與王煜、朱斌等[3-4]的臨床觀察結(jié)果相似，提示替比夫定主要提高Th1細(xì)胞的免疫反應(yīng)能力。

近年來發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞不僅具有重要的抗病毒和抗腫瘤作用，還能夠通過抗原呈遞、分泌細(xì)胞因子及細(xì)胞直接接觸等方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[13]。有研究者觀察到，慢性HBV感染者外周血中NK細(xì)胞數(shù)較正常人明顯減少，患者血清中HBV DNA水平與NK細(xì)胞水平成負(fù)相關(guān)，提示NK細(xì)胞的減少可能與HBV感染的慢性化有關(guān)[14]。在本課題組關(guān)于替比夫定免疫調(diào)節(jié)作用的前期實(shí)驗(yàn)研究中，觀察到替比夫定治療的小鼠的NK細(xì)胞殺傷活性明顯高于環(huán)磷酰胺模型組[7]，與吳氏[14]的臨床研究結(jié)果相似，提示替比夫定對NK細(xì)胞的活性有一定的增強(qiáng)作用。

綜上所述，替比夫定能夠有效改善環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能，表明該藥對機(jī)體的細(xì)胞免疫功能具有一定的增強(qiáng)作用。此可能是接受替比夫定治療慢性乙型肝炎患者發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)換率較高以及獲得滿意療效后停藥后復(fù)發(fā)率較低的重要原因。

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(本文編輯：易玲)

江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(11KJB10008)

226001 江蘇 南通大學(xué)附屬醫(yī)院感染性疾病科(顧宇峰，黃莉莉，宗雪萍，譚曉慧，湯偉)；南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物系(孫偉)

湯偉，Email：tdfy16302@163.com

2016-05-11)