過度磷酸化tau蛋白抑制海馬DG區(qū)神經元的發(fā)生

王 翔，胡家劭

(江漢大學醫(yī)學院，湖北 武漢 430056)

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過度磷酸化tau蛋白抑制海馬DG區(qū)神經元的發(fā)生

王 翔，胡家劭

(江漢大學醫(yī)學院，湖北 武漢 430056)

目的 老年癡呆(Alzheimer's disease，AD)以tau蛋白過度磷酸化，淀粉樣蛋白聚集為主要病理表現(xiàn)，同時出現(xiàn)神經發(fā)生紊亂。本研究探討過度磷酸化的tau蛋白對神經發(fā)生的影響。方法 通過在大鼠海馬DG區(qū)定位注射岡田酸(OA)誘導過度磷酸化tau蛋白的AD模型，并通過5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)標記，雙皮質素(doublecortin,DCX)免疫組織化學染色，并通過計算切片上的標記細胞個數(shù)來判斷神經元發(fā)生情況。使用水迷宮的方法檢測模型鼠的學習記憶情況。結果 OA模型鼠表現(xiàn)出明顯的學習和短期記憶障礙，PP2A特異性的tau蛋白過度磷酸化位點，包括絲氨酸404和262位點。雖然總的新生神經元沒有明顯差異，但是與對照組相比OA模型鼠中新生的神經元明顯減少，說明過度磷酸化的tau蛋白抑制干細胞轉化為神經元。結論 過度磷酸化的tau蛋白可以抑制新生神經元的發(fā)生，同時也為AD的治療提供了新的方向。

岡田酸；過度磷酸化tau蛋白；神經發(fā)生；分化

老年癡呆(Alzheimer's disease,AD)主要表現(xiàn)為海馬依賴的瞬時記憶以及短時記憶的喪失，同時海馬也是神經纖維纏結與老年斑沉積的主要腦區(qū)之一[1]。因此AD中海馬的病變是導致其臨床表現(xiàn)的主要原因之一。

成年人腦內的神經元干細胞主要分布于海馬齒狀回粒細胞下區(qū)(SubgranularZone,SGZ)。家族性AD轉基因小鼠中早期神經元發(fā)生受損[2]，說明神經元發(fā)生的紊亂是AD早期事件。

近期的研究表明過度磷酸化的tau蛋白可能是導致神經元和突觸丟失的主要原因[3]，但是tau蛋白的過度磷酸化與AD中神經元發(fā)生紊亂的關系還不清楚。

我們使用岡田酸(Okadaic Acid,OA)來模擬過度磷酸化的tau蛋白AD模型[4-5]，觀察tau蛋白過度磷酸化對AD模型鼠海馬齒狀回顆粒細胞下區(qū)的神經元發(fā)生情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 從華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心購買雄性SD大鼠38只，每只體質量(250±20)g，所有動物飼養(yǎng)在寬松的環(huán)境，自由飲水和進食，正常晝夜節(jié)律，并且飼養(yǎng)于室溫(25±2)℃以及合適的濕度。

1.2 模型的建立 通過隨機分組的方式，分為對照組和OA組，每組大鼠19只。對照組使用二甲基亞砜(40nmol/L)，OA組使用(40nmol/L)OA分別在兩組的海馬DG區(qū)定位注射。DG區(qū)定位為前囟后4.0mm，旁開2.0 mm，深3.0 mm。其中每組10只大鼠給藥后3d開始進行水迷宮實驗；6只在給藥后3d開始給予5-溴-2-脫氧尿苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)；3只給藥后3d直接取材做蛋白分析。

1.3 水迷宮訓練方法 訓練前1 h 將實驗動物移入水迷宮室，熟悉環(huán)境。水迷宮為直徑120cm，高60cm的圓形水池。將直徑10cm，高40cm的圓柱形有機玻璃平臺固定放于圓形水池第三象限的中心位，置于水面下1～2cm，水池及平臺用黑膠紙貼成黑色，訓練時倒入墨汁，確保平臺不可見。為減少外界因素的干擾，實驗環(huán)境應盡量保持穩(wěn)定。訓練方法依照文獻[6]，空間學習時間每天固定在14:00～20:00，每次訓練4個象限，連續(xù)5d，第6d檢測。

1.4 神經元發(fā)生檢測Brdu標記方法 Brdu注射劑量為100mg/kg，腹腔注射連續(xù)4d，2次/d，間隔8h。Brdu粉末溶于37℃生理鹽水(濃度為10mg/mL)，避光配置，現(xiàn)配現(xiàn)用。雙皮質素(doublecortin,DCX)免疫組化：切片免疫組化常規(guī)處理后，4℃孵育DCX約48h，用超敏即用型羊二抗試劑盒37℃孵育二抗20min，DAB顯色試劑盒顯色約4min，終止顯色。

1.5 材料和抗體 Brdu，1∶200，購自millipore；DCX，1∶200，購自Santa Cruz；tau蛋白262，404位點，1∶1000，購自SAB公司；tau 5，1∶1000，購自millipore。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法 水迷宮數(shù)據(jù)處理：我們使用10只大鼠訓練，前5d找到平臺數(shù)據(jù)的平均潛伏期為5d的學習指標，第6d檢測數(shù)據(jù)為短期記憶指標；tau蛋白磷酸化數(shù)據(jù)分析：使用western blot分析，得到tau蛋白絲氨酸404，絲氨酸262位點，tau5以及DM1A的灰度值，再通過比較兩組的DM1A的灰度值，得到上樣量的相對值；后用404、262，tau5分別除以這個相對值，得到它們的相對值，最后使用相對值比較，得出相對磷酸化程度；新生神經元數(shù)據(jù)處理：我們使用6只大鼠來做Brdu和DCX染色，每只大鼠在給予Brdu后灌流，通過振蕩切片得到腦片，分別用Brdu和DCX進行免疫組織化學染色，統(tǒng)計每一只大鼠的新生細胞和新生神經元數(shù)量，這樣每組得到6個數(shù)據(jù)，最后通過統(tǒng)計軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 本文采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 OA組大鼠表現(xiàn)出學習記憶障礙 我們使用水迷宮檢測OA所造AD模型鼠的學習記憶能力。如圖1所示，從第3d開始，OA組大鼠與正常組相比有明顯的學習記憶障礙。說明OA可以導致海馬依賴的學習記憶障礙。

圖1 OA模型鼠表現(xiàn)出海馬依賴的學習記憶障礙

2.2 海馬區(qū)tau蛋白過度磷酸化 檢測OA模型鼠的海馬tau蛋白磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)PP2A依賴的tau蛋白磷酸化位點有明顯的過度磷酸化，包括262，404。見圖2。

圖2 OA模型鼠表現(xiàn)出明顯的tau蛋白磷酸化

2.3 OA組大鼠DG區(qū)神經元發(fā)生增加 Brdu標記顯示海馬新生細胞在OA組沒有明顯變化。DCX免疫組化發(fā)現(xiàn)：OA模型鼠DCX染色明顯減少，說明在新生的細胞里向神經元方向分化的細胞明顯減少。見圖3(封三)。

3 討 論

AD以細胞內的淀粉樣蛋白沉積和細胞間的神經纖維纏結為主要特征，近期的研究表明雙螺旋細絲(paired helical filament,PHFs)的數(shù)量與癡呆患者的臨床表現(xiàn)直接相關[7]，說明tau的病理變化在臨床上的重要作用。一般認為tau蛋白有6個表型，而這些tau蛋白的異常磷酸化與他的神經毒性密切相關，因此異常磷酸化的tau蛋白在AD患者臨床表現(xiàn)上可能起重要作用。OA的藥理作用是抑制PP2A的活性從而導致tau蛋白的磷酸化，我們使用PP2A的抑制劑OA誘導AD模型，發(fā)現(xiàn)模型鼠海馬區(qū)tau蛋白過度磷酸化，水迷宮表現(xiàn)出短時記憶損害。同時，在模型鼠中，我們發(fā)現(xiàn)海馬齒狀回顆粒區(qū)的新生神經元與對照組相比有明顯的抑制作用，說明tau蛋白過度磷酸化會抑制神經發(fā)生，而這有可能是AD的發(fā)病機制之一。

在家族性AD的轉基因模型鼠中，研究人員發(fā)現(xiàn)其神經發(fā)生受損[8]，而在另外的一項研究中發(fā)現(xiàn)在AD中神經發(fā)生是增加的[9]。因此對于在AD中神經發(fā)生研究還有待進一步深入，在我們的模型中，我們使用OA誘導tau蛋白磷酸化，來觀察海馬DG區(qū)神經發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn)海馬DG區(qū)神經元發(fā)生明顯受到了抑制，特別是tau蛋白可以抑制新生的細胞轉化為神經元。我們的實驗說明在海馬DG區(qū)tau蛋白的異常磷酸化可能改變了神經發(fā)生的方向，而這就為我們的治療提供了方向。

雖然現(xiàn)在對于AD患者中海馬神經元發(fā)生的情況還沒有結論，但是使用治療AD的藥物后發(fā)現(xiàn)，可以促進AD模型鼠的神經發(fā)生[10]，說明我們的藥物有可能是通過影響了神經發(fā)生從而促進AD的治療。同時也有研究表明，使用成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)發(fā)現(xiàn)，劑量依賴性的增加tau的水平，減少微管相關蛋白2，增加海馬DG區(qū)神經發(fā)生，說明FGF-2可以通過影響神經元的發(fā)生以及誘導神經元的樹突向軸突轉化[11]。這表明通過藥物干擾海馬DG區(qū)的神經發(fā)生而改善AD癥狀正在成為可能。

[1]GRUNDKE-IQBAL I,IQBAL K,TUNG Y C,et al.Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau(tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1986，83(13):4913

[2]HAUGHEY N J,NATH A,CHAN S L,et al.Disruption of neurogenesis by amyloid beta-peptide,and perturbed neural progenitor cell homeostasis,in models of Alzheimer's disease[J].J Neurochem,2002,83(6):1509

[3]HOOVER B R,REED M N,SU J,et al.Tau mislocalization to dendritic spines mediates synaptic dysfunction independently of neurodegeneration[J].NEURON,2010,68(6):1067

[4]WANG J,TUNG Y C,WANG Y,et al.Hyperphosphorylation and accumulation of neurofilament proteins in Alzheimer disease brain and in okadaic acid-treated SY5Y cells[J].FEBS Lett,2001,507(1):81

[5]ARENDT T,HOLZER M,BRUCKNER M K,et al.The use of okadaic acid in vivo and the induction of molecular changes typical for Alzheimer's disease[J].Neuroscience,1998,85(4):1337

[6]張玉霖,歐陽昌漢,吳基良，等.羅格列酮對散發(fā)性老年癡呆模型大鼠認知功能的影響[J].咸寧學院學報(醫(yī)學版),2008,22(2):96

[7]KIMURA T,YAMASHITA S,FUKUDA T,et al.Hyperphosphorylated tau in parahippocampal cortex impairs place learning in aged mice expressing wild-type human tau[J].EMBO J,2007,26(24):5143

[8]DEMARS M,HU Y S,GADADHAR A,et al.Impaired neurogenesis is an early event in the etiology of familial Alzheimer's disease in transgenic mice[J].J Neurosci res,2010,88(10):2103

[9]JIN K,PEEL A L,MAO X O,et al.Increased hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(1):343

[10]JIN K,XIE L,MAO X O,et al.Alzheimer's disease drugs promote neurogenesis[J].Brain Res,2006,1085(1):183

[11]TATEBAYASHI Y,LEE M H,LI L,et al.The dentate gyrus neurogenesis:a therapeutic target for Alzheimer's disease[J].Acta Neuropathol,2003,105(3):225

Hyperphosphorylation Tau Inhibits Neurogenesis in the DG Region of Hippocampus

WANG Xiang,HU Jia-shao

(MedicalSchoolofJiangHanUniversity，WuhanHubei430056，China)

Objective Alzheimer's disease (AD) is characterized by hyperphosphorylation tau,amyloid aggregation.In AD the neurogenesisalso is disordered.We would explore the role of hyperphosphorylation tau in neurogenesis.Methods Okadaic acid (OA) to make hyperphosphorylation tauas AD model.By injecting the OA into the dentate gyrus (DG) of hippocampus and staining by 5-bromo-2-deoxyuridine (Brdu) and Doublecortin(DCX) we want to explore the state of neurogenesis bythestatistics of labeledneurons.We also use the water maze to test the ability of rats' learning and memory.Results We found there were an obvious learning and short-memory damage and a PP2A specific tau hyperphosphorylation at the site of serine 404 and 262.In the region of DG no different was found in the new born cell，but a huge decrease in the new neuron in AD model rats,which demonstrated hyperphosphorylation tau could inhibit the stem cell to differentiate to neurons.Conclusion Our research proved the hyperphosphorylation tau could inhibit neurogenesis and also provided new direction for therapy.

Okadaic Acid;Hyperphosphorylation Tau;Neurogenesis;Differentiate

R749.16

A

2095-4646(2016)05-0378-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.05.0378

2016-03-16)