不同年齡段H型高血壓合并慢性心力衰竭患者血清H cy合成相關(guān)酶MTHFR、CBS及MTR表達研究

楊紅玲　孫　焱　洪云飛　肖本勝　沈志強.云南省第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，云南昆明　6500；2.昆明醫(yī)科大學藥學院，云南昆明　650504

不同年齡段H型高血壓合并慢性心力衰竭患者血清H cy合成相關(guān)酶MTHFR、CBS及MTR表達研究

楊紅玲1,2孫焱1洪云飛1肖本勝1沈志強2▲
1.云南省第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，云南昆明650011；2.昆明醫(yī)科大學藥學院，云南昆明650504

目的 研究不同年齡段H型高血壓合并慢性心力衰竭患者血液中同型半胱氨酸（Hcy）合成關(guān)鍵酶甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、胱硫醚合成酶（CBS）和蛋氨酸合成酶（MTR）的表達特點。 方法2012年1月～2013年9月云南省第三人民醫(yī)院心內(nèi)科收治H型高血壓合并慢性心衰患者64例，根據(jù)年齡分為三組：＜50歲為B組（7例），50～70歲為C組（44例），＞70歲為D組（13例）；另選取30例體檢健康人為正常對照組（A組）。采用ELISA測定炎性因子、總抗氧化能力（T-AOC）和同型半胱氨酸（Hcy）含量，Western blot及RT-PCR半定量檢測全血中MTHFR、CBS和MTR mRNA及蛋白表達水平。 結(jié)果B組、C組及D組患者的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、丙二醛（MDA）和Hcy明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）；B組、C組以及D組的T-AOC、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）明顯低于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；RT-PCR以及Western blot結(jié)果顯示：B組、C組及D組患者血清中MTHFR、MTR表達明顯低于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；B組與C組的CBS表達相較A組降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），D組CBS表達明顯低于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），D組MTHFR、MTR、CBS表達均明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義 （P<0.05）。結(jié)論H型高血壓合并慢性心衰患者血清中Hcy含量與年齡有關(guān)，這可能是Hcy合成相關(guān)酶MTHFR及MTR表達水平降低造成。

慢性心力衰竭；同型半胱氨酸；亞甲基四氫葉酸還原酶；胱硫醚合成酶；蛋氨酸合成酶

心力衰竭（簡稱“心衰”）臨床中又稱之為心功能不全[1]，主要是指血液靜脈回流時，心臟由于一些已知或未知的原因?qū)е缕涫湛s和/或舒張功能發(fā)生障礙，收縮或舒張功能的障礙可導致其心排血量不足，排血量的不足又會導致身體代謝能量供應不足，最終造成了本病發(fā)生與發(fā)展[2]。H型高血壓合并心衰是指伴有高同型半胱氨酸血癥的原發(fā)性高血壓病患者同時合并慢性心衰的癥狀[3]，近年研究表明，H型高血壓可通過規(guī)范降壓治療及補充葉酸和維生素B12降低高同型半胱氨酸從而改善預后[4]，但是研究[5]也發(fā)現(xiàn)有些患者通過上述治療效果并不理想，本文通過研究不同年齡段H型高血壓合并慢性心衰患者血液中同型半胱氨酸（Hcy）合成關(guān)鍵酶亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、胱硫醚合成酶（CBS）以及蛋氨酸合成酶（MTR）的表達特點，為本病的針對性治療提供一定的參考。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2012年1月～2013年9月云南省第三人民醫(yī)院心內(nèi)科住院并確診H型高血壓合并慢性心衰患者64例，其中男30例，女34例，年齡21～87歲，平均（54±10）歲；64例患者按年齡分為三組：＜50歲為B組（7例），50～70歲為C組（44例），＞70歲為D組（13例）。所有患者心功能按紐約心功能分級均為Ⅱ～Ⅳ級，同時其均伴有高同型半胱氨酸血癥（Hcy≥14μmol/L），有明確高血壓病史 （既往不同時間規(guī)范測血壓超過3次舒張壓≥90 mmHg和/或收縮壓＞140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），且高血壓病史＞5年。另選取30例體檢健康人為正常對照組（A組），其中男16例，女14例，年齡31～84歲，平均（53±11）歲，A組均排除相關(guān)心腦血管疾病，且血清Hcy含量均在正常范圍。

1.2方法

1.2.1試劑盒及儀器血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和內(nèi)皮素-1（ET-1）檢測試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）及白介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒購于上海信裕生物科技有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）試劑盒購于上海圻明生物科技有限公司；全血總RNA提取試劑盒購于上海研卉生物科技公司；兔抗鼠多克隆抗體MTHFR、CBS、MTR購于Abcam公司、ECL發(fā)光試劑盒以及單克隆抗體β-actin購于Santa Cruz公司，二抗購于武漢博士德生物工程公司；總RNA提取試劑盒購自Sun ShineBio公司；引物由生工生物（上海）公司設(shè)計并制造。

1.2.2標本采集患者在采血前禁食高脂飲食24 h及禁大量補水，同時在12 h前禁食?；颊卟裳獣r間均為早晨8∶00～10∶00，于靜脈穿刺抽取5 mL，放入抗凝血血清管內(nèi)密封備用。另抽取3 mL血清立即行低溫離心（4000 r/min），10 min，提取上清液放入-80℃冰箱保存，待后期血液全部收集完后統(tǒng)一檢測。

1.2.3RT-PCR檢測mRNA的表達 取患者全血，用全血總RNA提取試劑盒提取總RNA并定量，之后每組各取2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。（MTHFR引物為：Primer-A：5'-GAGCCAGCGGAA AAGAAGT-3'，PrimerB：5'-GTAGTCTGGTTTAGCCAGTG-3'；產(chǎn)物長度為554。CBS引物設(shè)計為：PrimerA：5'-GCGGTATTCACTGTCGACCTA-3'，PrimerB：5'-GGTGGTA TGGTGTAAGGCTA-3'；產(chǎn)物長度為417；MTR引物設(shè)計為：Primer-A：5'-CCCTGGCGGTGA ATTTGCT-3'，PrimerB：5'-ACTTGACTGCGAGTCCCAAC-3'產(chǎn)物長度為443；βactin引物設(shè)計為：PrimerA：5'GGCCGCGCCCGCAACCA-3'，PrimerB：5'ACGCAGCTCATGTGTAAGTAGGTG G-3'，產(chǎn)物長度為537 bp）。PCR擴增條件為：98℃2 min，98℃10 s、48℃30 s、72℃35 s，循環(huán)次數(shù)33次；最后再延伸5 min。PCR反應產(chǎn)物在含核酸染料的1.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳完成后采集圖像，計算各條帶的熒光強度值，每組實驗重復3次。

1.2.4Wes tern b l ot檢測蛋白表達用超聲細胞破碎儀勻漿，BCA法測定蛋白含量并定量，之后取樣本80μg電泳，電泳結(jié)束后切取目標蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，之后加入5%的脫脂牛奶封閉2 h，倒出牛奶加入一抗，4℃過夜，洗膜后二抗孵育，洗滌后與ECL發(fā)光試劑反應，曝光洗片，掃描圖像后計算各條帶的灰度值，每組實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1血清炎癥因子

B組、C組和D組患者的AngⅡ、ET-1、TNF-α以及IL-1β明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時B組、C組及D組有逐步增加的趨勢。此外，C組TNF-α以及IL-1β含量明顯高于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；D組AngⅡ、ET-1、TNF-α以及IL-1β均明顯高于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2血清氧化和抗氧化能力

B組、C組以及D組的T-AOC、SOD以及GSH明顯低于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B組、C組以及D組的MDA明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1　四組血清炎癥因子比較（）

表1　四組血清炎癥因子比較（）

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；AngⅡ：血管緊張素Ⅱ；ET-1：內(nèi)皮素-1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1β：白介素-1β

組別　例數(shù)　AngⅡ（ng/L）　ET-1（ng/L）TNF-α（ng/L）IL-1β（ng/L）A組B組C組D組30 7 44 13 140±70.3 639±111*679±180*932.0±224.5*#2.31±1.17 10.72±2.46*11.22±4.07*14.44±17.3*#2.23±1.18 4.68±1.07*5.63±2.89*#7.8±4.63*#501±125 702±148*799±148*#923±148*#

表2　四組氧化和抗氧化能力比較（）

表2　四組氧化和抗氧化能力比較（）

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；F-AOC：總抗氧化能力；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH：谷胱甘肽

組別　例數(shù)　T-AOC（U/mL）MDA（nmol/mL）SOD（U/mL）GSH（U/L）A組B組C組D組30 7 44 13 17.44±9.72 15.84±8.61*14.26±7.1*#7.56±3.20*#4.21±0.57 6.77±1.26*7.22±1.62*#9.33±2.24*#336±87 260±74*240±66*225±59*#128±14 110±16*105±15*#95±21*#

2.3血清中總Hcy

B組Hcy水平為（16.58±4.36）μmol/L、C組為（17.23± 7.14）μmol/L、D組為（19.26±9.24）μmol/L，均明顯高于A組（13.28±3.66）μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。B、C以及D組有逐步增加的趨勢，且D組明顯高于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4M THFR、CBS、M TR的mRNA表達

RT-PCR結(jié)果顯示：與A組比較，B組、C組、D組的MTHFR、MTR mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；但B組和C組CBS表達與A組比較，無統(tǒng)計學意義（P>0.05），D組與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；D組MTHFR、CBS、MTR表達明顯高于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1、表3。

圖1　四組中MTHFR、CBS和MTR的mRNA表達

表3　四組中MTHFR、CBS和MTR的m RNA相對表達量（）

表3　四組中MTHFR、CBS和MTR的m RNA相對表達量（）

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；MTHFR：亞甲基四氫葉酸還原酶；CBS：胱硫醚合成酶；MTR：蛋氨酸合成酶

組別　例數(shù)　MTHFR　CBS　MTR A組B組C組D組30 7 44 13 1.67±0.05 1.39±0.09*1.18±0.12*0.85±0.10*#1.01±0.07 0.76±0.13*0.73±0.15*0.68±0.09*#1.62±0.07 1.21±0.12*1.18±0.14*1.02±0.09*#

2.5MTHFR、CBS、MTR的蛋白表達

Western blot結(jié)果顯示：與A組比較，B組、C組以及D組的MTHFR以及MTR mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；但B組和C組的CBS表達與A組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），D組與A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；D組MTHFR、CBS、MTR表達明顯高于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2、表4。

圖2　四組中MTHFR、CBS和MTR蛋白的表達

表4　四組中MTHFR、CBS和MTR的蛋白相對表達量（）

表4　四組中MTHFR、CBS和MTR的蛋白相對表達量（）

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；MTHFR：亞甲基四氫葉酸還原酶；CBS：胱硫醚合成酶；MTR：蛋氨酸合成酶

組別　例數(shù)　MTHFR　CBS　MTR A組B組C組D組30 7 44 13 1.64±0.06 1.34±0.11*1.22±0.12*0.89±0,12*#1.47±0.07 1.44±0.12 1.43±0.09 1.01±0.08*#1.63±0.07 1.30±0.12*1.18±0.08*0.72±0.08*#

3　討論

當前H型高血壓合并慢性心衰發(fā)病率逐年升高，有調(diào)查發(fā)現(xiàn)全球心衰患者高達2250萬例，且以每年200萬例的速度遞增[6]。我國屬于慢性心衰的高發(fā)區(qū)，患者高達1300萬例，心力衰竭患者2年死亡率高達37%，6年死亡率達到82%，死亡率高于許多惡性腫瘤[7]。此病在成年人群中的發(fā)病率為1.3%～5.6%，并隨著年齡的增高而上升，在65歲以上人群中，發(fā)病率為7.4%，80歲以上發(fā)病率則高達10%[8]。數(shù)據(jù)表明，心衰已經(jīng)成為威脅我國人民健康的一大疾病，因此如何阻止或延緩心衰的發(fā)生，降低本病的死亡率仍是困擾醫(yī)學界的一大難題[9]。

Hcy相關(guān)酶主要表達于肝臟，可出現(xiàn)于全血，其轉(zhuǎn)化的分子機制有兩條路徑，路徑一為在MTHFR的催化下，四氫葉酸可發(fā)生甲基化進而生成N5-甲基四氫葉酸，N5-甲基四氫葉酸可在MTR的催化下作為供體給Hcy提供甲基，最終促進Hcy合成蛋氨酸；第二條途徑為Hcy在CBS的催化下，與血清中游離的絲氨酸縮合生成胱硫醚，胱硫醚再進一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，最終經(jīng)尿排出體外[9-12]。近年來Hcy與心衰的關(guān)系受到了越來越多學者的關(guān)注，有研究顯示Hcy的高水平表達可導致的血管內(nèi)皮的損傷，從而造成炎癥因子AngⅡ、ET-1、TNF-α以及IL-1β等的過量釋放，進而造成機體氧化和抗氧化能力的失衡[13-14]。

本次研究結(jié)果顯示：H型高血壓合并慢性心衰患者其血清中Hcy均處于高表達狀態(tài)，同時不同年齡段比較，B組、C組和D組AngⅡ、ET-1、TNF-α以及IL-1β 4種炎性因子明顯高于A組（P<0.05）；B組、C組以及D組氧化和抗氧化能力明顯低于A組（P<0.05），B組、C組和D組MDA明顯高于A組（P<0.05），提示：H型高血壓合并慢性心衰患者其體內(nèi)的炎性反應及氧化能力隨著年齡的增加而增加。另外C組以及D組患者血清中MTHFR、CBS以及MTR mRNA及蛋白表達明顯低于A組（P<0.05），CBS表達B組與C組相較于A組有一定的降低，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），D組則明顯低于A組（P<0.05），提示：隨著年齡的增加，H型高血壓合并慢性心衰患者MTHFR、CBS以及MTR均發(fā)生了一定的異常，但MTHFR以及MTRB異常程度要大，CBS異常主要發(fā)生于70歲以上老年人。

綜上所述，H型高血壓合并慢性心衰患者血清中Hcy含量隨著患者年齡增大而升高，臨床中輔助治療通過補充葉酸和維生素B12[15-16]可有效改善Hcy合成相關(guān)酶MTHFR以及MTR表達水平，進而降低葉酸水平，但70歲以上老年人CBS表達較低不易通過補充葉酸和維生素B12改善，今后應引起醫(yī)師的注意。

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Expression studies of Hcy synthetic MTHFR,CBS and M TR enzymes in serum of different ages H-type hypertension patients w ith chronic heart failure

YANG Hongling1,2SUN Yan1HONG Yunfei1XIAO Bensheng1SHEN Zhiqiang2▲
1.Department of Cardiology,the Third People's Hospital of Yunnan Province,Kunming650011,China;2.College of Pharmacy,Kunming Medical University,Yunnan Province,Kunming650504,China

Objective To study the expression of serum Hcy synthesis key enzyme MTHFR,CBS and MTR in H-type hypertension patients with chronic heart failure.Methods From January 2012 to September 2013,in the Third People's Hospital of Yunnan Province,64 H-type hypertension patients with chronic heart failure were selected,According to the patient's ages,they were divided into three groups,<50 years were as group B(7 cases),50-70 years were as group C(44 cases),>70 years were as group D(13 cases)over,30 healthy people in physical examination were selected as group A.The expression of inflammatory cytokines,total antioxidant capacity were detected by Elisa,mRNA and protein of MTHFR,CBS and MTR were detected by Western blot and RT-PCR.Results The levels of AngⅡ,ET-1, TNF-α,IL-1β,MDA and Hcy in group B,group C and group D were significantly higher than those in group A,the differences were statistically significant(P<0.05);The levels of T-AOC,SOD,GSH in B group,group C and D groups were significantly lower than those in group A,the differences were statistically significant(P<0.05);MTHFR and MTR mRNA and protein expression in group B,group C and group D were significantly lower than those in group A, the differences were statistically significant(P<0.05),CBS expression in group D was significantly lower than that in group A,the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion The level of serum Hcy in H-type hypertension in patients with chronic heart failure is relevant with age,which maybe due to Hcy synthesis enzymes MTHFR and MTR lower expression caused.

Chronic heart failure;Hcy;MTHFR;CBS;MTR

R541.6

A

1673-7210（2016）04（b）-0060-04

國家自然科學基金資助項目（81160401）；云南省科技計劃項目（2011FB152）。

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（2016-01-15本文編輯：蘇暢）