人源DNA錯(cuò)配修復(fù)基因和微衛(wèi)星不穩(wěn)定與老年結(jié)腸癌的相關(guān)性

郝東明 李 麗 楊景文

(天津市人民醫(yī)院肛腸外科，天津 300121)

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人源DNA錯(cuò)配修復(fù)基因和微衛(wèi)星不穩(wěn)定與老年結(jié)腸癌的相關(guān)性

郝東明 李 麗 楊景文

(天津市人民醫(yī)院肛腸外科，天津 300121)

目的 探討老年結(jié)腸癌患者腫瘤組織的人源DNA錯(cuò)配修復(fù)基因(hMLH)1和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性型情況。方法 通過(guò)甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)老年結(jié)腸癌樣本中基因hMLH1啟動(dòng)子甲基化修飾的異常；研究結(jié)腸癌樣本中微衛(wèi)星標(biāo)志物雜合型丟失頻率；確定結(jié)腸癌患者中的變異與結(jié)腸癌的相關(guān)性。結(jié)果 18.0%的老年結(jié)腸癌樣本中出現(xiàn)hMLH1啟動(dòng)子高甲基化；51.2%出現(xiàn)微衛(wèi)星標(biāo)記D22S280或D22S929的雜合型缺失，25.6%出現(xiàn)D22S280和D22S929的雜合型缺失，并且雜合型缺失與基因hMLH1啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)相互獨(dú)立?；騢MLH1啟動(dòng)子甲基化可作為獨(dú)立的變量預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后。結(jié)論 根據(jù)hMLH1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)對(duì)高甲基化狀態(tài)結(jié)腸癌進(jìn)行分類，基因 hMLH1可作為微衛(wèi)星不穩(wěn)定型老年結(jié)腸癌潛在預(yù)后標(biāo)志物之一。

結(jié)腸癌;微衛(wèi)星不穩(wěn)定;人源DNA錯(cuò)配修復(fù)(hMLH)1;啟動(dòng)子甲基化;甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

結(jié)腸癌發(fā)展的遺傳學(xué)機(jī)制主要包括以下三類：染色體不穩(wěn)定性(CIN)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)及甲基化〔1〕。但是，結(jié)腸癌遺傳變異在臨床表型方面尚不清楚。上述三種機(jī)制都表現(xiàn)為突變的積累，然而每一種機(jī)制都涉及不同的基因，從而表現(xiàn)出不同的臨床病理特征。而且，上述三種結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制可能會(huì)同時(shí)發(fā)生，從而具有不同的預(yù)后〔2〕?；騿?dòng)子區(qū)域的超甲基化可沉默基因表達(dá)，在癌癥的發(fā)生中起到重要作用〔3〕。通過(guò)候選基因甲基化分析，對(duì)腫瘤進(jìn)行分類，分析的效能與所選用的候選基因及候選基因的數(shù)目相關(guān)。在已有的候選基因分析中，都包括人源DNA錯(cuò)配修復(fù)基因(hMLH)1，其在癌癥發(fā)生中主要因被表觀修飾失活〔4〕。hMLH1的編碼蛋白參與DNA復(fù)制復(fù)合體的組成〔4〕。hMLH1啟動(dòng)子甲基化異常是散發(fā)型MSI結(jié)腸癌主要發(fā)病機(jī)制〔4〕。hMLH1啟動(dòng)子甲基化高頻出現(xiàn)于結(jié)腸癌樣本中，與多個(gè)腫瘤分子標(biāo)志物(如hMLH1表達(dá)和MSI及腫瘤臨床病理表型(腫瘤患者的性別、腫瘤部位、腫瘤分期)相關(guān)〔5〕。因此,hMLH1啟動(dòng)子甲基化是散發(fā)型結(jié)腸癌甲基化修飾子表型的主要分子標(biāo)志物。BRAF蛋白在Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路中主要介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)。其中，BRAF(V600E)在結(jié)腸癌中高頻出現(xiàn)10%～20%，現(xiàn)已證明BRAF(V600E)與錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制(MMR)缺陷相關(guān)〔6〕。此外，BRAF基因變異與MSI相關(guān)〔7〕。微衛(wèi)星不穩(wěn)定型腫瘤特有的臨床病理特征表現(xiàn)為近端腫瘤、高齡、黏液樣病理特征，并且侵襲性稍弱〔6〕。本研究對(duì)老年結(jié)腸癌樣本嘗試基因分型，并且結(jié)合臨床預(yù)后的數(shù)據(jù)鑒定與預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我院2010年9月至2014年6月48例結(jié)腸癌樣本及5例正常樣本?；颊呔橥獠⒌玫奖驹簜惱砦瘑T會(huì)的批準(zhǔn)。典型結(jié)腸癌20例，非典型結(jié)腸癌16例和退變型結(jié)腸癌12例。年齡≥60歲，平均(66.04 ±4.57)歲，男女性別比為2.33∶1。其中43例以血液來(lái)源的樣本作為配對(duì)的正常樣本。所有患者無(wú)遺傳病史及其他腫瘤病史。冰凍組織及血液樣本經(jīng)蛋白酶K處理后抽提基因組DNA。

1.2 DNA重亞硫酸鹽修飾 DNA中未甲基化的胞嘧啶經(jīng)修飾變?yōu)槟蜞奏?，隨后用甲基化及非甲基化特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增。5 μg DNA按照CpG基因組DNA修飾試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行修飾，并溶于25 ml溶解緩沖液。

1.3 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè) 用于鑒定hMLH1非甲基化的引物為5 -TTT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3 (正向)和5 -ACC ACC TCA TCA TAA CTA CCC ACA-3(反向)；鑒定hMLH1甲基化的引物為5 -ACG TAG ACG TTT TAT TAG GGT CGC-3(正向) 和5 -CCT CAT CGT AAC TAC CCG CG-3(反向)。PCR反應(yīng)體系：50 ng重亞硫酸修飾的DNA,0.3 mmol/L引物，0.2 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2,1×PCR 緩沖液和0.4 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。反應(yīng)條件:95℃ 10 min，(94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 50 s,循環(huán)34次),72℃ 10 min。5 μl樣品用于電泳檢測(cè)。所有PCR反應(yīng)以CpGenome通用DNA為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)陰性對(duì)照。

1.4 微衛(wèi)星分析 所選用的微衛(wèi)星標(biāo)志為BAT25,BAT26,D2S123,D5s346,D17S250,humAR,CTT16,D19S210和DHFRP2。MSI根據(jù)重復(fù)的核苷酸數(shù)目進(jìn)行分類。目前，單核苷酸重復(fù)標(biāo)志BAT25,BAT26分別位于基因MSH2的第5個(gè)內(nèi)含子和癌基因c-Kit的第16個(gè)內(nèi)含子；二核苷酸重復(fù)標(biāo)志物D2S123(chr2:51288467-51288646),D5S346(chr5:112213624-112213748),D17S250(17:37152092-37152243)是結(jié)腸癌MSI分析中最常用到的微衛(wèi)星標(biāo)志。這5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)志即為Bethesda標(biāo)志，已得到眾多研究的驗(yàn)證。除此之外，為了增加微衛(wèi)星檢測(cè)的靈敏性，還引入幾個(gè)最近鑒定出的微衛(wèi)星標(biāo)志物humAR、CTT16(chr11:40651848-40652024)、D19S210(chr19:57019539-57019883) 和DHFRP2。除了微衛(wèi)星標(biāo)記，使用兩個(gè)多態(tài)性標(biāo)記(D22S280和D22S929)進(jìn)行雜合型丟失分析。引物5'端經(jīng)過(guò)HEX和FAM熒光標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系(20 μl基因組DNA 50 ng):0.3 mmol/L引物，0.2 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2,1×PCR 緩沖液Ⅱ和0.4 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)，PCR反應(yīng)條件:95℃ 10 min(94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 50 s,循環(huán)34次),72℃ 10 min。

MSI的存在與否按照已有的定義進(jìn)行鑒定，LOH則通過(guò)半定量分析等位基因不穩(wěn)定性QLOH =(t1/t2)/(n1/n2)、t1、t2、n1、n2分別是腫瘤樣本和正常樣本的兩個(gè)等位基因的峰值。當(dāng)QLOH遠(yuǎn)大于1時(shí)表示雜合型獲得；QLOH為0和1分別表示雜合型完全丟失及雜合型保留；QLOH<0.4表示檢測(cè)到雜合型丟失。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 甲基化分析 正常樣本未發(fā)生甲基化，但是18%的腫瘤樣本表現(xiàn)出hMLH1啟動(dòng)子高甲基化。其中hMLH1啟動(dòng)子高甲基化在典型結(jié)腸癌、非典型結(jié)腸癌及退行性結(jié)腸癌中發(fā)生的比例分別為5.0%(1/20),12.5%(2/16)，50.0%(6/12)。hMLH1啟動(dòng)子高甲基化與結(jié)腸癌的分型具有顯著相關(guān)性(P=0.014)，見圖1，表1。

表1 樣本甲基化特異性PCR(MSP)和微衛(wèi)星分析的結(jié)果

續(xù)表1 樣本甲基化特異性PCR(MSP)和微衛(wèi)星分析的結(jié)果

M：甲基化；-：未甲基化；L:雜合型丟失；R：雜合型保持；NI：沒(méi)有信息；ND：未分析

PCR條帶的出現(xiàn)與否即代表這個(gè)樣本中是否存在相應(yīng)的等位基因；U:未甲基化修飾；M:甲基化修飾圖1 結(jié)腸癌患者h(yuǎn)MLH1甲基化特異性PCR結(jié)果

2.2 微衛(wèi)星分析 對(duì)43對(duì)結(jié)腸癌樣本(具有配對(duì)的血液來(lái)源的正常樣本)，包括典型結(jié)腸癌15例、非典型結(jié)腸癌14例和退行性結(jié)腸癌12例進(jìn)行微衛(wèi)星分析。選用結(jié)腸癌樣本中已知的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)樣本M28在D17S250,CTT16和DHFRP2出現(xiàn)了MSI，但是樣本M28并未發(fā)生基因hMLH1啟動(dòng)子甲基化；樣本M31在D19s210出現(xiàn)MSI,并且發(fā)生了基因hMLH1啟動(dòng)子的甲基化，見圖2，表1。部分樣本的MSI獨(dú)立于hMLH1啟動(dòng)子的甲基化，可能由于腫瘤患者群體的異質(zhì)性。腫瘤的發(fā)生是多步驟多因素的，因此，這部分樣本可能存在其他hMLH1功能丟失的機(jī)制，如基因突變、基因拷貝數(shù)改變等。數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)基因hMLH1 在腫瘤中有超過(guò)20%的功能丟失性突變。同義突變并不影響hMLH1編碼產(chǎn)物只占其突變總數(shù)的(13.04%)，其他的突變類型包括無(wú)義突變11.07%、錯(cuò)義突變57.31%、移碼插入突變3.17%、非移碼插入突變1.97%、移碼缺失突變9.89%及其他突變3.56%；其中移碼突變和無(wú)義突變極可能導(dǎo)致基因功能丟失，超過(guò)突變總數(shù)20%。

箭頭所示為甲基化等位基因圖2 2例結(jié)腸癌樣本在4個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)MSI

2.3 雜合型丟失分析 腫瘤的發(fā)生中涉及癌基因突變通常會(huì)出現(xiàn)二次打擊事件。其中雜合型丟失即為其中一種。上述43對(duì)結(jié)腸癌樣本中進(jìn)行D22S280和D22S929的雜合型丟失分析，結(jié)果顯示D22S280和D22S929至少有一個(gè)可以有效顯示雜合型狀態(tài)。同時(shí)，51.2%(22/43)的樣本至少出現(xiàn)一個(gè)標(biāo)記(D22S280或 D22S929)雜合型丟失，25.6%(11/43)的樣本出現(xiàn)標(biāo)記D22S929和D22S280雜合型丟失。其中典型性結(jié)腸癌、非典型性結(jié)腸癌及退行性結(jié)腸癌出現(xiàn)雜合型丟失的比例分別為40.0%，50.0%，64.3%。樣本M28在D22S280表現(xiàn)出雜合型丟失。雜合型丟失與染色體22q及結(jié)腸癌的分類沒(méi)有顯著相關(guān)性，并且雜合型丟失與基因hMLH1甲基化無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見圖3，表1。結(jié)腸癌患者中微衛(wèi)星標(biāo)志物D22S280和D22S929雜合型丟失事件是獨(dú)立于基因hMLH1甲基化。

雜合型丟失箭頭所示圖3 染色體22q兩個(gè)標(biāo)記的雜合型丟失

3 討 論

MSI最先在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)，在其他腫瘤中也有報(bào)道〔8〕。除此之外，染色體不穩(wěn)定性及基因啟動(dòng)子甲基化異常也能導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生〔9〕。癌癥基因組研究計(jì)劃通過(guò)分析MSI及hMLH1啟動(dòng)子高甲基化結(jié)腸癌所累及的基因，發(fā)現(xiàn)高頻突變腫瘤與MSI-H的腫瘤表型很相似，具有CIN的結(jié)腸癌與甲基化表型結(jié)腸癌表型也有部分相似，其中MMR變異主要在MSI腫瘤中發(fā)揮作用。hMLH1啟動(dòng)子高甲基化則表現(xiàn)為基因表達(dá)水平的降低，從而導(dǎo)致功能的缺失〔1〕。數(shù)據(jù)顯示在所有結(jié)腸癌樣本中，基因hMLH1發(fā)生改變的頻率為25%〔3〕，而在MSI亞群中，基因hMLH1發(fā)生改變的頻率上升為33%〔10〕。因此，基因hMLH1甲基化水平的改變可能早于MSI事件的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)有些樣本出現(xiàn)MSI表型可能是伴隨著基因hMLH1啟動(dòng)子的超甲基化。然而，部分樣本的MSI表型獨(dú)立于基因hMLH1啟動(dòng)子甲基化水平的異常；這可能是由于患者之間的異質(zhì)性，或是存在其他可能影響到DNA復(fù)制修復(fù)基因的功能丟失?；騢MLH1還與近端定位、低分化及基因BRAF的突變存在相關(guān)性，并且基因hMLH1的變異在年長(zhǎng)患者中較高頻出現(xiàn)，臨床病理特征與高甲基化腫瘤臨床病理特征表現(xiàn)出來(lái)的特征一致〔11〕，在含基因hMLH1變異的腫瘤也表現(xiàn)出高甲基化腫瘤的特征。因此，基因hMLH1可以作為區(qū)分高甲基化腫瘤的一個(gè)新的特征。在遠(yuǎn)端腫瘤中，基因hMLH1的變異與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)〔12〕。另外，結(jié)腸癌甲基化方式的不同對(duì)預(yù)后的影響也不同〔13〕。已有研究表明，通過(guò)甲基化狀態(tài)進(jìn)行預(yù)后預(yù)測(cè)的效果隨著選用甲基化標(biāo)記的數(shù)目增加而增加〔14〕。hMLH1是無(wú)病生存率(DFS)的強(qiáng)預(yù)后因子，但是也有人發(fā)現(xiàn)甲基化與預(yù)后好的關(guān)聯(lián)性只在結(jié)腸癌二期及三期中出現(xiàn)〔15〕。但是，同時(shí)具有hMLH1和MSI的腫瘤患者預(yù)后較差。根據(jù)MSI和甲基化狀態(tài)對(duì)腫瘤進(jìn)行分類可以有效反映細(xì)胞的遺傳及表觀遺傳狀態(tài)。因此以hMLH1狀態(tài)對(duì)腫瘤進(jìn)行分類，可以得到DFS預(yù)后較好的一類腫瘤。綜上，MSI可以作為進(jìn)一步區(qū)分基因hMLH1高甲基化腫瘤的標(biāo)志。通過(guò)結(jié)合MSI及hMLH1高甲基化的特征對(duì)腫瘤進(jìn)行精確分型更加有助于臨床治療和預(yù)后。

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〔2015-02-25修回〕

(編輯 苑云杰)

天津市衛(wèi)生局科技基金(No.2012KY20)

楊景文(1981-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事結(jié)直腸腫瘤研究。

郝東明(1978-),男,碩士,主治醫(yī)師,主要從事結(jié)直腸腫瘤研究。

R735.3

A

1005-9202(2016)20-4947-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.004