番茄抗葉霉病的生理指標(biāo)分析

劉冠+趙婷婷+薛東齊+楊歡歡+姜景彬+李景富+許向陽

摘要：為明確番茄葉霉病過敏性壞死反應(yīng)中的活性氧代謝、細(xì)胞保護(hù)酶和激素含量的變化，通過對(duì)番茄葉霉病抗病材料HN19（含Cf-19）、HN42（含Cf-11）、Ontrio7516（含Cf-5）和感病材料 Money Maker（含Cf-0）分別接種葉霉菌生理小種1.2.3.4。結(jié)果表明：在接種72 h后，不親和互作體系（抗病材料）出現(xiàn)壞死斑，番茄葉片活性氧的積累在接種后3、15 d出現(xiàn)2個(gè)峰值，而親和互作體系（感病材料）只在接種后5 d產(chǎn)生1個(gè)峰值。不親和互作體系中，第1次活性氧含量的高峰伴隨著過敏性壞死反應(yīng)（HR），表明高濃度的活性氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過對(duì)親和互作及非親和互作體系中的細(xì)胞保護(hù)酶系（超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶）活性及激素（乙烯、水楊酸、脫落酸）含量分析發(fā)現(xiàn)，含有不同Cf基因的番茄品種在活性氧的積累、細(xì)胞保護(hù)酶活性及激素含量上存在相對(duì)統(tǒng)一的變化規(guī)律。

關(guān)鍵詞：番茄葉霉?。贿^敏性壞死；ROS；保護(hù)酶系；激素

中圖分類號(hào)： S436.412.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0133-05

番茄（Solanum lycopersicum）是世界范圍內(nèi)分布的主要蔬菜作物，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，2012年全球番茄產(chǎn)量1.62億t，創(chuàng)造了550億美元的凈利潤[1]。番茄葉霉?。–ladosporium fulvum）是番茄保護(hù)地生產(chǎn)中的主要病害，被侵染后既降低番茄的產(chǎn)量，又影響果實(shí)的品質(zhì)，有時(shí)甚至使植株死亡[2]。番茄Cf抗病基因介導(dǎo)對(duì)葉霉菌的抗性遵循基因?qū)蚣僬f，抗病基因Cf與無毒基因Avr的相互作用使得抗病品種對(duì)生理小種產(chǎn)生特異性識(shí)別。有研究表明，Avr9/Cf-9和Avr4/Cf-4介導(dǎo)番茄產(chǎn)生的過敏壞死在產(chǎn)生速度、強(qiáng)度和組織特異性等方面均存在顯著差異[3]。當(dāng)番茄抗性品種被葉霉病菌侵染后，多數(shù)在侵染區(qū)域產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive response，HR）[4]。有學(xué)者認(rèn)為HR可能是細(xì)胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）的一種形式[5]，因?yàn)橹参矬w內(nèi)發(fā)生HR時(shí)也表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的特征，如番茄原生質(zhì)體用HR激發(fā)子花生四烯酸處理時(shí)也形成DNA梯形帶[6]。番茄葉霉菌的侵染可以分為3個(gè)階段：早期包括蛋白激酶激活[7]、活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生[8-9]、膜質(zhì)氧化和谷胱甘肽積累；中期包括脂肪氧化酶活性增強(qiáng)、電解液滲漏[10]和防御基因表達(dá)[11-12]；后期包括水楊酸積累、病癥出現(xiàn)和細(xì)胞程序性死亡。HR中有多種信號(hào)分子參與，而活性氧是誘導(dǎo)HR的一個(gè)重要因子。當(dāng)病原菌侵染寄主植物時(shí)，可使其體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破[13]。在植物與病原菌大多數(shù)不親和互作中，伴隨HR的最顯著特征就是氧化暴發(fā)，在短時(shí)間內(nèi)積累大量的ROS，引起過敏性細(xì)胞死亡，在HR過程中發(fā)揮著重要的作用[14]。細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）等，它們有清除ROS的作用，使其維持在正常水平，防止其對(duì)細(xì)胞膜的毒害[15]。綜上所述，一方面ROS及細(xì)胞保護(hù)酶之間與植物過敏性抗病反應(yīng)有關(guān)，因而被認(rèn)為是植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)的組成部分；另一方面，ROS作為信號(hào)物質(zhì)參與植物對(duì)病原菌侵染的防御反應(yīng)、細(xì)胞死亡和抗病基因表達(dá)的調(diào)控等[16-17]。另外有研究表明，植物激素水楊酸（salicylic acid，SA）、乙烯（ethylene，ETH）是植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要調(diào)控因子[18]。此外，植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）、生長(zhǎng)素（auxin）、赤霉素（gibberellin，GA）、細(xì)胞分裂素（cytokinine，CK）和油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid，BR）等也被報(bào)道參與調(diào)控植物對(duì)病原菌的抗性[19-22]。

目前對(duì)于番茄葉霉菌的研究主要集中在抗病基因及其無毒基因的克隆，而很少集中在生理指標(biāo)的測(cè)定上，本試驗(yàn)旨在探究番茄抗葉霉病菌侵染的過程中活性氧、細(xì)胞保護(hù)酶活性和激素水平的變化規(guī)律，以及親和互作體系與非親和互作體系的區(qū)別，以明確番茄抗葉霉病的生理機(jī)制，揭示其抗病機(jī)制，為番茄的抗葉霉病育種提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄品種（表1）及供試葉霉菌生理小種1.2.3.4，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組提供；HN19（含Cf-19）、Ontrio7516（含Cf-5）、HN42（含Cf-11）與葉霉菌生理小種1.2.3.4均為不親和互作（incompatible interaction），即表現(xiàn)為免疫或高抗；Money Maker（簡(jiǎn)稱 mm，含Cf-0）與葉霉菌生理小種之間的相互作用是親和互作（compatible interaction），即表現(xiàn)為感病。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料的種植與接種 將供試材料種于溫室中，每份供試材料設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)40株。將供試材料用噴霧接種法分別接種葉霉菌生理小種1.2.3.4，接種苗齡為4～5張真葉。接種前轉(zhuǎn)入小棚保濕24 h，使空氣相對(duì)濕度達(dá)到100%。用小型噴霧器將菌液噴于葉片背面，接種后保持濕度在85%以上，溫度在20～25 ℃。接種后0、1、3、5、8、15、18、21 d分別取供試材料第5或第6張真葉，每個(gè)材料取4～5張葉，用無菌水洗凈，液氮冷凍后于-80 ℃保存。

1.2.2 錐蟲藍(lán)染色觀察 在接種葉霉菌后96 h，采用洪薇的方法進(jìn)行錐蟲藍(lán)染色觀察[23]，用OLYMPUS SZX10顯微鏡鏡檢，并拍照。

1.2.3 ROS、CAT、POD、SOD活性及ETH、ABA、SA含量的測(cè)定 分別采用上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司的植物活性氧（ROS）ELISA試劑盒E-60016、植物乙烯（ETH）ELISA試劑盒E-60049、植物激素脫落酸（ABA）ELISA試劑盒E-60004、植物激素水楊酸（SA）ELISA試劑盒E-60046進(jìn)行測(cè)定；SOD活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定，CAT活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 錐蟲藍(lán)染色觀察

葉片接菌前都呈現(xiàn)健康，在接菌3 d時(shí)，親和與不親和互作體系的葉片表征沒有任何變化（圖1）。但用錐蟲藍(lán)染色后，不親和互作番茄葉片在接種后72 h出現(xiàn)HR現(xiàn)象（圖2）， 圖2-a、圖2-b、圖2-c中在沿葉脈方向出現(xiàn)壞死細(xì)胞群。而與葉霉菌親和互作的Money Maker在接種后96 h時(shí)，尚未出現(xiàn)HR現(xiàn)象。接菌后15 d時(shí)，親和互作葉片表面可看出有1小塊葉霉菌霉層（圖1），而此時(shí)染色圖片中可看出親和互作體系Money Maker葉片壞死斑的面積大于不親和互作體系（圖2），由此推測(cè)菌絲生長(zhǎng)更為快速。

2.2 番茄抗葉霉病過敏性壞死反應(yīng)中ROS含量的變化

病原菌的侵染可破壞植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡，從圖3可見，在番茄品種與葉霉菌互作體系中，接種后0～21 d內(nèi)不親和互作體系與親和互作體系中ROS變化趨勢(shì)完全不同，但不親和互作體系中變化趨勢(shì)大致相同。不親和互作體系Cf-5、Cf-11、Cf-19中，ROS含量出現(xiàn)2個(gè)高峰，而親和互作體系Money Maker中只有1個(gè)峰。不親和互作體系Cf-5、Cf-11、Cf-19的ROS含量在接種后3 d達(dá)到第1個(gè)峰值，而親和互作體系Money Maker的ROS含量接種后變化不大，接種后3 d呈上升趨勢(shì)，到接種后5 d達(dá)到峰值。不親和互作體系Cf-5、Cf-11、Cf-19的ROS峰值高于親和互作體系Money Maker。雖然3個(gè)不親和互作體系在葉霉菌侵染后，ROS含量都出現(xiàn)了2個(gè)峰值且變化趨勢(shì)大致相同，但略有區(qū)別。對(duì)于不親和互作體系而言，接種后3 d，ROS大量積累，此時(shí)有可能是出現(xiàn)HR的時(shí)間。對(duì)于親和互作體系而言，接種后5 d左右活性氧含量突增，此時(shí)有可能是病斑產(chǎn)生時(shí)間。由此推斷，ROS積累高峰期基本與番茄葉片壞死斑產(chǎn)生是同步的。

2.3 番茄抗葉霉病過敏性壞死過程中細(xì)胞保護(hù)酶活性的變化

SOD、POD、CAT都是植物膜脂過氧化酶促防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶。SOD在細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)中的作用是清除超氧陰離子等活性氧，同時(shí)產(chǎn)生歧化產(chǎn)物H2O2，CAT、POD在保護(hù)酶系統(tǒng)中主要起到酶促降解H2O2的作用[24]。

2.3.1 SOD活性 SOD是植物體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵酶之一，它能催化植物體內(nèi)分子氧活化的第1個(gè)中間產(chǎn)物O-2[KG-*2]· 發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2 、H2O2， 其活性高低可用于衡量植物抗性的強(qiáng)弱[25]。由圖4可知，接種葉霉病菌后，番茄葉片中SOD活性在不同互作體系中有不同變化趨勢(shì)，但在不親和互作體系中變化趨勢(shì)大致相同。親和互作體系Money Maker中的SOD活性在接種后1 d迅速升高后迅速下降，在接種后3 d達(dá)到谷值，然后升高。不親和互作體系Cf-5、Cf-11、Cf-19中的SOD活性在接種后逐漸升高，并且均在接種后5 d達(dá)到峰值，之后迅速下降，在接種后15 d達(dá)到1個(gè)谷值。與ROS含量的變化相比可見，不親和互作體系中的ROS含量在出現(xiàn)第1個(gè)峰值時(shí)，其SOD活性處于中間值，表明此時(shí)有相對(duì)較高活性的SOD并沒有抑制ROS的積累。

2.3.2 POD活性 植物細(xì)胞內(nèi)存在的POD可催化分解H2O2生成H2O和O2，還可使脂肪酸、芳香胺和酚類物質(zhì)等氧化。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，POD活性升高是植物抗性的一種表現(xiàn)形式[26]。接種葉霉病菌后，番茄葉片中POD活性在不同互作體系中發(fā)生不同的變化趨勢(shì)，但不親和互作體系中的變化趨勢(shì)大致相同。從圖5可見，在取樣時(shí)間內(nèi)，親和互作體系Money Maker的POD 活性出現(xiàn)2個(gè)峰值，而不親和互作體系只有1個(gè)峰值，且其峰值高于親和互作體系。與ROS含量的變化相比，無論親和互作體系還是非親和互作體系，POD活性的變化與其沒有太大的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.3.3 CAT活性 接種葉霉病菌后，番茄葉片中CAT活性在不同互作體系中具有不同的變化趨勢(shì)。由圖6可見，親和互作體系的CAT活性在接種后迅速上升，并在接種后5 d達(dá)到1個(gè)峰值，之后迅速下降，在接種后8 d達(dá)到1個(gè)低谷，之后逐漸升高；在不親和互作體系中CAT活性變化趨勢(shì)大致相同，但其活性還是略有不同。在不親和互作體系中CAT活性在接種后略有下降后逐漸上升，在接種后5 d達(dá)到峰值。與ROS含量的變化相比，在親和互作體系中CAT活性的變化與ROS的積累相反。不親和互作體系的CAT活性在接種后有所降低，這說明在親和互作前期，植物體內(nèi)降解H2O2的能力下降，有利于H2O2的積累。

2.4 番茄抗葉霉病過敏性壞死過程中植物激素含量的變化

2.4.1 ETH含量 乙烯作為植物中唯一的氣體激素，雖然分子量小，卻參與種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育、花葉以及果實(shí)的衰老與凋謝等植物生長(zhǎng)發(fā)育過程，在植物應(yīng)對(duì)各種脅迫的抗性反應(yīng)中亦具有至關(guān)重要的作用[27]。由圖7可知，在未接種葉霉菌時(shí)，各個(gè)品種內(nèi)的乙烯含量處于相同水平，接菌后含量均有所上升。Money Maker中ETH含量在接種后11 d達(dá)到1個(gè)頂峰后下降，最后逐漸穩(wěn)定。非親和互作體系中的ETH含量在接種后明顯高于非親和互作體系，基本在接種后18 d時(shí)達(dá)到頂峰值，之后變化穩(wěn)定。

2.4.2 ABA含量 脫落酸在植物受到環(huán)境中不利因素的脅迫后，可以調(diào)控下游基因幫助植物適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境。最新研究表明，脫落酸在植物抗病反應(yīng)中具有重要作用[28]。由圖8可以看出，番茄葉片接菌后，親和互作體系和非親和互作體系整體趨勢(shì)大致相同，但親和互作體系中ABA含量迅速增加，而不親和互作體系則變化較為緩慢。在接種后8 d，親和互作體系內(nèi)ABA含量達(dá)到最大值，而后趨于平緩。非親和互作體系中ABA含量雖然也在升高，但折現(xiàn)斜率相對(duì)于親和互作體系較低且含量少。

2.4.3 SA含量 水楊酸是一種酚類物質(zhì)，它廣泛參與植物的種子萌發(fā)、細(xì)胞生長(zhǎng)、呼吸作用、衰老相關(guān)等基因的表達(dá)以及對(duì)病害的抵抗等生命活動(dòng)[29]。由圖9可知，番茄接種葉霉菌后非親和互作體系中沒有相對(duì)統(tǒng)一的變化規(guī)律，各個(gè)品種內(nèi)SA含量變化比較復(fù)雜。Money Maker中SA含量先迅速升高，之后變化緩慢至接種后11 d時(shí)出現(xiàn)谷值后又升高。在非親和互作體系中，Cf-5、Cf-11、Cf-19的變化規(guī)律也各不相同。含有Cf-5基因的品種內(nèi)SA含量到接種后5 d達(dá)到頂峰，然后緩慢下降，最終變化趨勢(shì)相對(duì)穩(wěn)定；而含有Cf-11基因的品種內(nèi)SA含量到接種后5 d出現(xiàn)谷值，而后緩慢升高；含有Cf-19基因的品種內(nèi)SA含量變化則相對(duì)穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

本研究利用番茄抗葉霉病不同品種、感葉霉病品種與不同生理小種葉霉病菌之間不同的互作表現(xiàn)，從葉霉菌侵染番茄葉片后活性氧積累及細(xì)胞保護(hù)酶活性等方面出發(fā)，探討活性氧的產(chǎn)生變化及其細(xì)胞保護(hù)酶活性的變化，以期找到含有不同Cf基因的抗病品種在接種后的活性氧及保護(hù)酶活性變化規(guī)律。結(jié)果表明，親和互作體系與不親和互作體系在葉霉病菌侵染后，活性氧積累和細(xì)胞保護(hù)酶系活性變化是不同的，但不親和互作體系中活性氧的積累和細(xì)胞保護(hù)酶活性的變化規(guī)律大致相同。

在不親和互作體系中，葉霉病菌侵染番茄葉片內(nèi)活性氧的積累有2個(gè)高峰，這與Lamb等的研究結(jié)果[30]類似。其中第1次活性氧含量迅速增加是在接種后3 d，可能與葉片上產(chǎn)生過敏性壞死斑的時(shí)間相吻合；不親和互作體系第2個(gè)活性氧含量累計(jì)峰值產(chǎn)生在接種后15 d；親和互作體系中，在接種后5 d活性氧的積累達(dá)到了1個(gè)峰值。不親和互作體系的活性氧積累的第1個(gè)峰值低于第2個(gè)峰值，說明其應(yīng)該是作為信號(hào)分子啟動(dòng)了植物的抗病反應(yīng)，這與Jabs的研究[31]相一致。無論番茄是因?yàn)楦胁∪~片被破壞或是因抗病而產(chǎn)生大量壞死斑，都有強(qiáng)度極高的活性氧積累。這表明高強(qiáng)度活性氧含量的突增會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這與Tiwari等的結(jié)論[32]一致。

在親和互作體系與非親和互作體系中，細(xì)胞保護(hù)酶SOD、POD、CAT的功能和作用是不同的。在親和互作體系中，葉霉病菌侵染番茄后的前期SOD、CAT含量適中，因此沒有活性氧積累；而在非親和互作體系中，葉霉病菌侵染番茄后的前期SOD活性與CAT活性呈負(fù)相關(guān)，此時(shí)活性氧含量劇增，超氧陰離子含量增加，且從接種葉片的壞死斑癥狀看出，此時(shí)細(xì)胞死亡加劇，由此推測(cè)超氧陰離子在細(xì)胞死亡中有重要作用。龍書生等對(duì)小麥條銹病的過敏性壞死反應(yīng)的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[24]。

含有Cf基因的番茄材料接種葉霉病菌后，其SOD活性高于感病材料，可能是感病材料葉片中O-2含量增加超越了防御系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致脂膜過氧化反應(yīng)的結(jié)果。王全華等對(duì)外源GO基因?qū)敕押髮?duì)葉霉病的抗性機(jī)制的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[33]。

ETH、ABA、SA是在葉霉菌侵染番茄植株過程中產(chǎn)生變化較為明顯的3種激素。ABA是在植物抗病過程中重要的調(diào)節(jié)激素，而在親和互作體系中ABA含量明顯高于非親和互作體系，說明ABA在葉霉菌引起的生物脅迫反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用，這與Bari等的研究觀點(diǎn)相一致[34]。在蔡新忠等的以水楊酸積累缺失型nahG和乙烯不應(yīng)型etr11轉(zhuǎn)基因煙草植株為材料，對(duì)水楊酸和乙烯在依賴于番茄Cf-4和Cf-9基因的過敏壞死中的調(diào)控作用進(jìn)行比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水楊酸對(duì)植物抗病基因介導(dǎo)的過敏性壞死產(chǎn)生和調(diào)節(jié)中的作用，而且說明水楊酸對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)域相同的Cf抗病基因決定的過敏性壞死中的作用也有顯著區(qū)別。而本試驗(yàn)中非親和互作體系中ETH含量較高，由此可看出在HR反應(yīng)中ETH起到正調(diào)控作用，而SA含量變化較為復(fù)雜，與蔡新忠等研究結(jié)果[35]相吻合。

本試驗(yàn)主要通過測(cè)定在番茄抗葉霉病過程中活性氧的積累、細(xì)胞保護(hù)酶活性及激素含量的變化，發(fā)現(xiàn)含有不同Cf基因的番茄抗葉霉病品種在活性氧積累、保護(hù)酶活性和激素含量的變化上存在一致的規(guī)律，其中SA對(duì)非親和互作中結(jié)構(gòu)域相似Cf基因在HR反應(yīng)中的變化也各不相同。本研究為在分子水平上研究番茄對(duì)葉霉病菌產(chǎn)生過敏性反應(yīng)的機(jī)制，以及進(jìn)一步研究番茄與葉霉病菌的專一性識(shí)別及過敏性反應(yīng)的信號(hào)傳遞機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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