小麥愈傷組織的誘導(dǎo)和再生體系的建立

陸玉建+王書(shū)平+王寧寧+劉俊華+高春明

摘要：以普通小麥的成熟胚為試驗(yàn)材料，研究不同激素組合對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的影響。結(jié)果表明，小麥愈傷組織誘導(dǎo)效果最好的培養(yǎng)基為W5[MS+0.5 g/L 水解絡(luò)蛋白（CH）+2.0 mg/L 2，4-D+0.15 g/L天冬酰胺（Asn）]，在此培養(yǎng)基中，成熟胚產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量最好，誘導(dǎo)率最高。對(duì)于不定芽誘導(dǎo)，最適培養(yǎng)基為WF8（MS+0.5 g/L CH+4.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA），在此培養(yǎng)基中，愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽數(shù)量最多，速度最快，分化率最高。比較適宜誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基為WR4（1/2MS+0.5 g/L CH+0.5 mg/L NAA），在此培養(yǎng)基中，不定芽生根速度最快，數(shù)量最多，并且較為粗壯。本試驗(yàn)旨在探索小麥組織培養(yǎng)的最適條件，為今后通過(guò)基因工程手段改良小麥的品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥；成熟胚；愈傷組織；不定芽；再生體系

中圖分類號(hào)： S512.104.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0067-04

小麥為禾本科小麥屬植物，是世界上最早栽培的重要農(nóng)作物之一[1]。小麥品質(zhì)的改良是提高小麥產(chǎn)量的主要措施，而穩(wěn)定的組織培養(yǎng)體系的建立則是小麥育種的重要基礎(chǔ)和保證[2]。目前，有關(guān)小麥愈傷組織的誘導(dǎo)、分化和再生已有不少的報(bào)道，但小麥植株再生率低，建立穩(wěn)定的再生體系比較困難[2-6]。影響小麥再生的因素有很多，包括外植體來(lái)源、基因型、生理狀態(tài)和培養(yǎng)條件等[3，5-8]。建立高效的植株再生體系需要良好的外植體來(lái)源。小麥幼胚是公認(rèn)的最好的外植體源，其愈傷組織誘導(dǎo)效果好，植株再生能力強(qiáng)，且以幼胚為轉(zhuǎn)化受體，已成功獲得轉(zhuǎn)基因植株[2，6，9]。雖然小麥幼胚再生能力強(qiáng)，但取材受時(shí)間和空間限制，適宜轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)難以掌握，轉(zhuǎn)化周期也比較長(zhǎng)；而成熟胚取材方便、生理狀態(tài)一致、不受生長(zhǎng)季節(jié)限制，是組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化理想的外植體[7，10-12]。

現(xiàn)階段，雖然有關(guān)小麥成熟胚離體培養(yǎng)方面的研究較多，但穩(wěn)定的高頻率植株再生體系仍未建立，因此本試驗(yàn)以黃河流域廣泛種植的普通小麥豫寶1號(hào)成熟胚為外植體，研究不同激素組合對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響，進(jìn)而獲得比較適合成熟胚高效再生的培養(yǎng)基類型。通過(guò)探索小麥組織培養(yǎng)的最適條件，為今后小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和品質(zhì)的改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為普通小麥種子（豫保1號(hào)），由濱州學(xué)院生命科學(xué)系基因工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 MS基本培養(yǎng)基的制備 在小麥組織培養(yǎng)過(guò)程中，采用MS或1/2MS作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中均添加3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH值為5.8。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制 以MS為基本培養(yǎng)基，添加一定濃度的水解酪蛋白（CH）、2，4-D、NAA、天冬酰胺（Asn）或谷氨酰胺（Gln），配制小麥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表1）。

1.2.3 分化培養(yǎng)基的配制 在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，配制誘導(dǎo)小麥分化的培養(yǎng)基（表2）。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的配制 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，配制誘導(dǎo)小麥生根培養(yǎng)基（表3）。

1.2.5 小麥種子的消毒及成熟胚的剝離 挑取籽粒飽滿的小麥種子，用水浸泡，26 ℃處理24 h左右，70%乙醇消毒5 min，HgCl2處理15 min，無(wú)菌水沖洗5～6次，剝胚，然后接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，26 ℃暗培養(yǎng)15 d。

1.2.6 愈傷組織的增殖培養(yǎng) 選取生長(zhǎng)良好的愈傷組織，除胚，將愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)基中，26 ℃暗培養(yǎng)2周；選擇生長(zhǎng)效果較好的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基的類型和培養(yǎng)條件不變。

1.2.7 不定芽的誘導(dǎo) 選取增殖效果比較好的愈傷組織，接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d左右。

1.2.8 生根誘導(dǎo) 當(dāng)不定芽的長(zhǎng)度5～6 cm時(shí)，切取生長(zhǎng)較為健壯的不定芽，接種到生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)不定芽生根。

1.3 結(jié)果觀測(cè)與統(tǒng)計(jì)

成熟胚接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，15 d后進(jìn)行第1次繼代培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率；愈傷組織經(jīng)過(guò)2次繼代培養(yǎng)，然后進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，分別于接種后15、30 d統(tǒng)計(jì)不定芽分化率；不定芽接種到生根培養(yǎng)基中30 d后統(tǒng)計(jì)生根率。有關(guān)計(jì)算公式如下：出愈率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

分化率=產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

生根率=產(chǎn)生不定根的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析及Duncans多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，選取12種培養(yǎng)基進(jìn)行小麥愈傷組織的誘導(dǎo)。采用微損法將消毒后的小麥剝胚，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（圖1-A），26 ℃暗培養(yǎng)約1周，可以觀察到胚上已有明顯的白色透明的愈傷組織產(chǎn)生（圖1-B）；繼續(xù)培養(yǎng)15 d，愈傷組織體積明顯增大，形成蓬松的球形（圖1-C），統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率并進(jìn)行繼代增殖。圖2表明，在W1～W12這12種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，W5的誘導(dǎo)效果最好，愈傷組織誘導(dǎo)率超過(guò)90%，差異極顯著（P<0.01）。通過(guò)分析愈傷組織的誘導(dǎo)情況，初步獲得比較適合愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基類型。

2.2 愈傷組織的繼代增殖

挑取生長(zhǎng)良好的小麥愈傷組織，接種到增殖培養(yǎng)基（W5）中，26 ℃暗培養(yǎng)2周后觀察愈傷組織的生長(zhǎng)情況（圖1-D），由此可以看到愈傷組織細(xì)胞分裂旺盛，體積明顯增大，但結(jié)構(gòu)還不夠致密；將愈傷組織再次繼代培養(yǎng)2周，愈傷組織的團(tuán)塊繼續(xù)增大，細(xì)胞排列更加緊密，適合不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)（圖1-E）。

2.3 不定芽的形成

將繼代培養(yǎng)后的小麥愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，于26 ℃下光照培養(yǎng)。愈傷組織接種2 d后，可以觀察到部分愈傷組織的顏色開(kāi)始變綠，出現(xiàn)少量的深綠色芽點(diǎn)；分化培養(yǎng)2周左右即可清楚地看到愈傷組織塊上長(zhǎng)出成簇的不定芽（圖1-F）。繼續(xù)培養(yǎng)30 d左右，產(chǎn)生不定芽的愈傷組織增多，不定芽生長(zhǎng)旺盛（圖1-G）。對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)（圖3），在愈傷組織分化誘導(dǎo)后15 d，不定芽分化率較低，最高在15%左右；當(dāng)分化誘導(dǎo)30 d時(shí)，不定芽分化率迅速提高，最高達(dá)到60%。顯著性分析表明，在WF1～WF8這8種不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，WF5～WF8的誘導(dǎo)效果較好，和WF1～WF4之間存在極顯著差異。在WF5～WF8這4種培養(yǎng)基中，WF8誘導(dǎo)愈傷組織分化的效果則最好。此外，通過(guò)觀察愈傷組織的分化情況，發(fā)現(xiàn)愈傷組織在WF1～WF4這4種培養(yǎng)基中主要分化產(chǎn)生大量的不定根，而不定芽則極少。通過(guò)分析愈傷組織不定芽的誘導(dǎo)情況，初步獲得比較適合愈傷組織分化的培養(yǎng)基類型。

2.4 生根誘導(dǎo)

切取生長(zhǎng)健壯的不定芽，接種到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基WR1～WR6中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后，即可獲得試管苗（圖1-H）。在這6種生根培養(yǎng)基中，不定芽均可誘導(dǎo)產(chǎn)生根，且在WR4中不定芽產(chǎn)生根的效果最好，生根率超過(guò)50%（圖4）。顯著性分析表明，WR4和其他5種生根培養(yǎng)基之間存在極顯著差異。

3 結(jié)論與討論

小麥在長(zhǎng)期種植的過(guò)程中，由于受到諸多因素的影響，其產(chǎn)量及品質(zhì)不斷下降，利用基因工程技術(shù)是提高小麥產(chǎn)量和改良小麥品質(zhì)的有效途徑。雖然目前有關(guān)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究較多，但效果不佳，其中限制因素之一就是小麥植株的再生頻率低，建立穩(wěn)定的再生體系比較困難。因此，如何建立起高效的小麥再生體系是提高小麥產(chǎn)量和品質(zhì)面臨的重要問(wèn)題。本試驗(yàn)以小麥成熟胚為外植體，通過(guò)研究不同激素組合對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)、分化以及植株再生的影響，以此探索小麥組織培養(yǎng)的最適條件。與幼胚相比，成熟胚的取材方便容易，不受季節(jié)限制，因此逐漸成為小麥組織培養(yǎng)的首選材料。在小麥無(wú)性系建立的過(guò)程中，乙醇和HgCl2處理種子的時(shí)間要適度，70%乙醇消毒5 min，HgCl2處理15 min效果較好。時(shí)間太短，消毒不徹底，污染率較高；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響胚的活性，愈傷組織的能力下降。成熟胚的剝離是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，剝胚前，須事先將種子浸泡，再于26 ℃下處理24 h左右，為的是使種子膨脹疏松，從而利于剝胚，其中浸泡的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則造成種子腐爛，胚易破碎且活力下降，愈傷組織誘導(dǎo)率下降；浸泡的時(shí)間也不宜過(guò)短，否則種子比較堅(jiān)硬，胚難剝離。CH營(yíng)養(yǎng)豐富，是多種氨基酸混合物，對(duì)胚狀體、不定芽的分化具有良好的促進(jìn)作用。在小麥成熟胚培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中添加0.5 g/L CH有利于愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化。生長(zhǎng)素的主要作用為誘導(dǎo)愈傷組織的形成和根的分化，促進(jìn)根、莖、芽的生長(zhǎng)。2，4-D可以促進(jìn)細(xì)胞脫分化，產(chǎn)生愈傷組織，因此是愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中比較常用的生長(zhǎng)素類似物。通過(guò)比較小麥愈傷組織的誘導(dǎo)情況可以看出，2.0 mg/L 2，4-D對(duì)于小麥成熟胚愈傷組織的形成非常重要，而NAA的效果似乎并不明顯。Asn或Gln是培養(yǎng)基中重要的有機(jī)氮源，在培養(yǎng)基中添加一定濃度的Asn或Gln有助于小麥愈傷組織的誘導(dǎo)。Asn和Gln相比，0.15 g/L Asn對(duì)小麥愈傷組織誘導(dǎo)的促進(jìn)作用更明顯。因此，在小麥成熟胚誘導(dǎo)過(guò)程中，可在添加2，4-D和CH的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中附加一定含量的Asn或Gln，從而能夠獲得質(zhì)量較高的愈傷組織，這對(duì)于隨后進(jìn)行的愈傷組織分化培養(yǎng)很有必要。如果直接將小麥的愈傷組織進(jìn)行分化誘導(dǎo)，往往不能產(chǎn)生不定芽，可能是因?yàn)槌跗诋a(chǎn)生的愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，主要為非胚性愈傷組織，但通過(guò)2次繼代培養(yǎng)，可以使愈傷組織的結(jié)構(gòu)變得更為致密，胚性愈傷組織的比例大大提高，從而有利于不定芽的誘導(dǎo)。在小麥愈傷組織的分化誘導(dǎo)過(guò)程中，WF8的效果最好，愈傷組織的分化率最高，不定芽產(chǎn)生的速度快、數(shù)量多，但不定根的產(chǎn)生則不明顯。在前4種分化培養(yǎng)基中，愈傷組織產(chǎn)生不定芽的速度要慢得多，數(shù)量極少，并且有大量的不定根形成。對(duì)照各培養(yǎng)基的成分發(fā)現(xiàn)，在KT濃度為1.0～4.0 mg/L時(shí)，其含量的變化對(duì)不定芽的誘導(dǎo)率影響不大，但在培養(yǎng)基中加入NAA和6-BA后，不定芽的誘導(dǎo)率明顯提高，說(shuō)明NAA和6-BA對(duì)不定芽誘導(dǎo)影響較大，是愈傷組織分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用的激素。而培養(yǎng)基中包含NAA和6-BA的前提下，KT濃度達(dá)到4.0 mg/L 時(shí)，不定芽的分化率顯著提高，可見(jiàn)只有在合適種類和濃度激素的協(xié)同作用下，小麥愈傷組織的分化方可達(dá)到比較理想的效果。對(duì)于小麥生根誘導(dǎo)，應(yīng)用1/2MS作為基本培養(yǎng)基，附加一定濃度NAA和IBA均可促進(jìn)根的生成，但NAA的效果要優(yōu)于IBA，其中比較適宜的NAA濃度為0.5 mg/L，在此濃度下，不定芽生根速度快，數(shù)量多，根系較為發(fā)達(dá)。

在小麥組織培養(yǎng)過(guò)程中，不同種類和含量的激素組合在愈傷組織誘導(dǎo)和再生植株的獲得方面具有不同的效果。本研究通過(guò)探索小麥組織培養(yǎng)的最適條件，并初步建立起較為穩(wěn)定的小麥再生體系，本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于今后小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和品質(zhì)的改良具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Chin J C，Scott K J. Studies on the formation of roots and shoots in wheat callus cultures[J]. Ann Bot，1997，41：473-481.

[2]覃建兵，何光源.不同小麥基因型及其不同外植體離體培養(yǎng)研究初探[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20（6）：522-527.

[3]李 娜，焦 湞，谷運(yùn)紅，等. 小麥組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（8）：11-15.

[4]Delporte F，Mostade O，Jacquemin J M. Plant regeneration through callus initiation from thin mature embryo fragments of wheat[J]. Plant Cell Tiss Org Cult，2001，67：73-80.

[5]李根英，黃承彥，隋新霞，等. 小麥不同外植體的組織培養(yǎng)效果研究[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)，2006，26（1）：21-25.

[6]何勇剛，林 剛，劉曼西，等. 小麥不同生理狀態(tài)的幼穗和幼胚盾片與誘導(dǎo)分化能力關(guān)系的研究[J]. 武漢植物學(xué)研究，2001，19（5）：363-368.

[7]李新玲，曲 敏，閆玉清，等. 影響小麥成熟胚培養(yǎng)及植株再生因素的研究[J]. 植物研究，2005，1 （1）：49-52.

[8]Machii H，Mizuno H，Hirabayashi T，et al. Screening wheat geno-types for high callus induction and regeneration capability from anther and immature embryo cultures[J]. Plant Cell Tiss Org Cult，1998，53：67-74.

[9]He G Y，Rooke L，Cannell M，et al. Current status of transformation in bread and durum wheats and modifications of gluten quality[J]. Acta Agronomica Hungarica，1998，46（4）：449-462.

[10]畢瑞明，王洪剛. 小麥成熟胚的組織培養(yǎng)[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（2）：53-57.

[11]陶麗莉，殷桂香，葉興國(guó). 小麥成熟胚組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)，2008，28（4）：713-718.

[12]Patnaik D，Khurana P. Genetic transformation of Indian bread （T. aestivum） and pasta （T. durum） wheat by particle bombardment of mature embryo-derived calli [J]. BMC Plant Biology，2003，3（5）：1-11.