大豆中不同除草劑作用靶標(biāo)酶的miRNA前體克

陶波+劉洋+李向勇+金龍國(guó)+邱麗娟

摘要：對(duì)前人已預(yù)測(cè)的大豆miRNA的4個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、克隆miRNA前體，先將設(shè)計(jì)好的接頭與大豆小RNA的3′末端連接，然后利用與接頭序列互補(bǔ)的引物對(duì)小RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，即可得到加接頭的第1鏈cDNA，再用基因特異引物GSP和通用接頭引物的組合，經(jīng)PCR擴(kuò)增后即可捕獲位于已知序列區(qū)和接頭之間的3′端RNA序列。結(jié)合3′端引物的測(cè)序結(jié)果，初步預(yù)測(cè)成熟miRNA可能的6個(gè)組合是同一家族。

關(guān)鍵詞：miRNA；EPSPS（5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶）；基因序列；草甘膦；克隆

中圖分類號(hào)： S482.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0024-04

草甘膦是一類具有特異性，且能有效抑制葉綠體酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的除草劑[1-2]。對(duì)EPSPS作用的草甘膦能阻斷莽草酸酯途徑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）與EPSPS結(jié)合，形成穩(wěn)定的三元絡(luò)合物，從而阻斷PEP與3-磷酸莽草酸（S3P）反應(yīng)生成EPSPS，最終阻止芳香族氨基酸的生物合成，抑制芳香族氨基酸的生成，導(dǎo)致植物死亡[3-4]。

microRNA（miRNA）是指真核生物中長(zhǎng)度約為21～25 nt的小型內(nèi)源的非編碼單鏈RNA家族。microRNA是Lee等于1993年在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的。此后，大量的microRNA在植物和動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)和克隆[5]，到目前為止，植物中發(fā)現(xiàn)的microRNA分子已逾200種[6]。microRNA是近年來(lái)非編碼RNA研究的熱點(diǎn)。它們?cè)诮M織發(fā)育和細(xì)胞分化的特定階段表達(dá)，可以在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)許多基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用[7]。miRNA通過(guò)2種途徑發(fā)揮其作用：（1）miRNA與靶mRNA序列不完全互補(bǔ)，它主要通過(guò)與靶mRNA的不完全互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)而阻抑mRNA的翻譯過(guò)程，這種途徑對(duì)mRNA的穩(wěn)定性無(wú)任何影響，屬于翻譯水平基因調(diào)節(jié)；（2）miRNA與靶mRNA序列完全互補(bǔ)，它可以通過(guò)與小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）類似的途徑與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)而降解靶mRNA，屬于轉(zhuǎn)錄后水平基因調(diào)節(jié)[8]。

在各類小分子RNA中，miRNA具有最廣泛的基因調(diào)節(jié)功能[9]，內(nèi)含子miRNA具有反向調(diào)節(jié)其宿主基因的功能[10-11]，可能有以下幾種情況：（1）當(dāng)宿主基因是內(nèi)含子miRNA的靶基因時(shí)，內(nèi)含子miRNA直接下調(diào)宿主基因的表達(dá)，抑制其功能的發(fā)揮，這是直接作用。譬如，內(nèi)含子miR-204被預(yù)測(cè)可直接靶向其宿主基因[WTBX][STBX]TRPM3[WTBZ][STBZ][12]。（2）內(nèi)含子miRNA還可以通過(guò)下調(diào)促進(jìn)宿主基因功能的靶基因，從而拮抗宿主基因的功能。目前還未見(jiàn)有這方面的試驗(yàn)證據(jù)，但不能否定這種情況存在的可能性。文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)含子miR-25的可能靶基因是[WTBX][STBX]FHL2[WTBZ][STBZ]基因，而FHL2蛋白則通過(guò)與宿主基因編碼的蛋白MCM7相互作用從而促進(jìn)其功能[13]。因此，我們推測(cè)內(nèi)含子miR-25有可能有反向調(diào)節(jié)宿主基因[WTBX][STBX]FHL2[WTBZ][STBZ]的功能，當(dāng)然這還有待今后進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。擬南芥中的miR160通過(guò)負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（auxin response factors）ARF10和ARF16的表達(dá)而控制根冠細(xì)胞的形成[14]。玉米中的GL15活性增高不僅使幼年期葉片增多，而且延緩生殖發(fā)育，而miR172對(duì)GL15mRNA水平進(jìn)行負(fù)調(diào)控，從而促進(jìn)玉米幼葉向成熟葉片轉(zhuǎn)變[15]。賈小云等發(fā)現(xiàn)，miR828可以通過(guò)靶向SlMyb7-like負(fù)調(diào)控花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控番茄植株中花青素的生物合成[2]。這些都表明植物中miRNA具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[16]。

本研究對(duì)前人預(yù)測(cè)的除草劑作用靶標(biāo)酶的大豆miRNA的4個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，克隆miRNA前體，從而進(jìn)一步研究它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育中的生物學(xué)意義和分子水平上的調(diào)節(jié)機(jī)制，而且還可以有目的、有計(jì)劃地利用它們進(jìn)行植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控和生理結(jié)構(gòu)的改造，使植物更大限度地表現(xiàn)出對(duì)人類研究有利的性狀，從而為人類生產(chǎn)生活造福。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大豆基因組EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/；RNA-fold predict：http：//frontend.bioinfo.rpi.edu/zukerm/home.html；Mipred confirm：http：//www.bioinf.seu.edu.cn。

1.2 試驗(yàn)方法

利用生物信息學(xué)方法，對(duì)不同除草劑作用靶標(biāo)酶EST序列進(jìn)行miRNA預(yù)測(cè)。通過(guò)RNA-fold predict軟件對(duì)原始EST序列預(yù)測(cè)，初步得到12個(gè)microRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用Mipred confirm（http：//www.bioinf.seu.edu.cn）進(jìn)一步篩選，共篩選到4個(gè)miRNA前體，其中2個(gè)EPSP合成酶、1個(gè)谷氨酰胺合成酶、1個(gè)原卟啉原氧化酶。

本試驗(yàn)中，先將設(shè)計(jì)好的接頭與大豆小RNA的3′末端連接，然后利用與接頭序列互補(bǔ)的引物對(duì)小RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，即可得到加接頭的第1鏈cDNA；再用基因特異引物GSP和通用接頭引物的組合，經(jīng)PCR擴(kuò)增即可捕獲位于已知序列區(qū)和接頭之間的3′ 端RNA序列。

1.2.1 連接3′接頭 3′接頭序列：5′-PO4-UUUCACTAGCACGAGCTCGCTACGCTCACTACTCGGCATTATGTACGCTAACTAACTCGTGGTC（idT）-3′。首先將總RNA與3′接頭均勻混合，80 ℃下處理2 min后置于冰中冷卻。配制反應(yīng)體系：無(wú)核酸酶的水18.6 μL、10×T4 RNA 連接酶緩沖液[不含牛血清白蛋白（BSA-free）]4.0 μL、BSA（0.1%）2.4 μL 、3′接頭2.0 μL、總RNA 11 μL、T4 RNA連接酶（40 U/μL）2.0 μL（100 μmol/L），5 ℃反應(yīng)16 h后，加入2 μL 0.5 mol/L EDTA終止反應(yīng)；70 ℃下處理10 min以滅活連接酶，之后置于冰中保存。需要注意的是，配制反應(yīng)體系時(shí)須按照以下順序：無(wú)核酸酶的水→10×T4 RNA連接酶緩沖液→0.1% BSA→總RNA & 3′接頭混合液。

1.2.2 連接5′接頭 5′接頭序列：5′-GGAATTCGGATC-3′，通過(guò)TaKaRa生產(chǎn)的末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用，使5′接頭poly（G）連接到cDNAs的3′末端，隨后利用BamHⅠ（dC）16引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果5′接頭被克隆到質(zhì)粒pTZ18上。

1.2.3 合成cDNA cDNA文庫(kù)合成反應(yīng)體系：10×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液8.0 μL、MgCl2（25 mmol/L）16 μL、dNTP（10 mmol/L）8.0 μL、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（20 U/μL）4.0 μL、RNasin（RNA酶抑制劑，40 U/μL） 2.0 μL、 RT引物（100 μmol/L）4.0 μL、連接有3′接頭的總RNA38 μL。首先將反應(yīng)液與RT引物均勻混合，80 ℃下處理2 min后置于冰中冷卻。RT引物序列：5′-GACCACGAGTTAGTTAGCGTACAT-3′。然后參照配制反應(yīng)體系（Promega公司試劑盒），按照以下程序合成cDNA文庫(kù)：30 ℃ 10 min→42～55 ℃1 h→95 ℃ 5 min→5 ℃ 5 min。

1.2.4 PCR檢測(cè)反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 遞減PCR（Touchdown PCR）是在引物的最高退火溫度與最適退火溫度之間，以一定溫度梯度逐步遞減至最適退火溫度，即通過(guò)在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)退火條件以提高擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的方法。例如循環(huán)可設(shè)在比估算的退火溫度高約5 ℃的退火溫度下開(kāi)始，然后每個(gè)循環(huán)降低1～2 ℃，直到降至退火溫度（也可低于退火溫度5 ℃）。特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增并占據(jù)優(yōu)勢(shì)。

1.2.5 割膠回收、轉(zhuǎn)化連接、測(cè)序 DNA純化后利用瓊脂糖凝膠DNA回收方法割膠回收。在微量離心管中配制下列DNA溶液（全量為5 μL）：pMD19-T載體1 μL；Control Insert（TaKaRa提供的DNA片段） 1 μL；ddH2O 3 μL。加入5 μL（等量）的 Solution I，16 ℃反應(yīng)30 min。全量（10 μL）加入至100 μL JM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30 min。42 ℃加熱45 s 后，再在冰中放置1 min。加入890 μL SOC培養(yǎng)基，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)60 min。在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落；挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)載體中插入片段的大??；將培養(yǎng)液送出測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)已預(yù)測(cè)的4個(gè)miRNA前體序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)

確定3′端對(duì)預(yù)測(cè)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)3′端引物。設(shè)計(jì)原則：在4個(gè)莖環(huán)上游，根據(jù)堿基配對(duì)比例設(shè)計(jì)1條引物，分別前移3個(gè)堿基、后移3個(gè)堿基，設(shè)計(jì)3條引物（表1）。

由于microRNA本身序列較短，加接頭的目的是與 microRNA 連接便于擴(kuò)增與識(shí)別，3′接頭（64 bp）為：5′-PUUUCACTAGCACGAGCTCGCTACGCTCACTACTCGGCATTATGTACGCTAACTAACTCGTGGTCX-3′。

2.2 小RNA的回收、轉(zhuǎn)化連接、PCR檢測(cè)及測(cè)序

對(duì)設(shè)計(jì)的12條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收、轉(zhuǎn)化連接和PCR檢測(cè)。圖1顯示，每個(gè)引物挑5個(gè)克隆，目標(biāo)片段大小約85 bp（3′接頭64 bp，小RNA 20 bp左右），每個(gè)引物選1管菌液送去測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果表明：引物EPSP-2-1在3′端擴(kuò)出TGG，而引物EPSP-2-2在3′端擴(kuò)出AA，而且堿基TGG和AA均存在于已經(jīng)預(yù)測(cè)的小RNA前體序列中，如果這種3′端多態(tài)性確實(shí)存在，那么這個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的miRNA初步認(rèn)為是家族式的。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種多態(tài)性的可靠性，在2個(gè)cDNA文庫(kù)中去擴(kuò)增：“B Lib.”文庫(kù)（含豆粒）和“R Lib.”（不含豆粒）文庫(kù)（圖2），每個(gè)平板挑10個(gè)克隆，進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果表明：在上述2個(gè)文庫(kù)中，每個(gè)文庫(kù)挑10個(gè)克隆，可以看出3′端序列存在多態(tài)性，且重復(fù)性較高，3′端端點(diǎn)有4種可能（表3）。

測(cè)序結(jié)果表明：在上述2引物中，每個(gè)引物挑5個(gè)克隆，可以看出5′端序列存在多態(tài)性，5′端序列有5種可能，詳見(jiàn)表4。

后續(xù)的試驗(yàn)將主要依賴核酸雜交技術(shù)。利用試驗(yàn)認(rèn)定是同一家族的可能6個(gè)microRNA組合基因序列作為探針進(jìn)行Northern Blotting，可以在RACE的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證microRNA是否表達(dá)。

3 討論

本試驗(yàn)從4個(gè)靶標(biāo)酶入手，首先通過(guò)軟件預(yù)測(cè)miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可知miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是莖環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)已知miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)堿基配對(duì)比例，通過(guò)篩選，挑選出可能的miRNA前體，miRNA前體在形成成熟miRNA的過(guò)程中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的一條莖被降解，另一條莖形成成熟的miRNA[17]。盡管從理論上來(lái)說(shuō)，成熟的miRNA產(chǎn)生是隨機(jī)選擇的結(jié)果，但由于2條鏈的穩(wěn)定性有所不同，導(dǎo)致機(jī)會(huì)的不等[18]。而本研究只是對(duì)4個(gè)莖環(huán)中其中1條莖設(shè)計(jì)引物，沒(méi)有對(duì)另外的莖設(shè)計(jì)引物，所以不能排除其他3個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)中也含有成熟的miRNA。本研究確定6個(gè)miRNA組合，可能是同一家族。植物miRNA具有簇集現(xiàn)象，多數(shù)miRNA不是分散分布的，而是2個(gè)或多個(gè)基因由1個(gè)前體miRNA加工而來(lái)，成簇排列的基因協(xié)同表達(dá)，顯現(xiàn)出在基因表達(dá)方面的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)[19]。

后續(xù)試驗(yàn)將主要依賴核酸雜交技術(shù)[20]。利用試驗(yàn)認(rèn)定為同一家族可能的6個(gè)microRNA組合基因序列作為探針進(jìn)行Northern Blotting，可以在RACE的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證microRNA的表達(dá)與否。由于microRNA基因的表達(dá)比蛋白基因更迅速，且不受翻譯過(guò)程影響，對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控效率更高，我們可以把它作為一種強(qiáng)有力的工具，借助它來(lái)完成突變體的構(gòu)建與特定基因表達(dá)的調(diào)控。雖然對(duì)植物microRNA的研究取得了很大進(jìn)展，但是植物miRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上其本身如何被調(diào)控及其被調(diào)控后的結(jié)果是怎樣的，這些問(wèn)題都需要人們?nèi)パ芯亢吞剿鱗21]。隨著植物microRNA越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn)，可以繼續(xù)研究它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育中的生物學(xué)意義和在分子水平上的調(diào)節(jié)機(jī)制，而且還可以有目的、有計(jì)劃地對(duì)它們進(jìn)行植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控和生理結(jié)構(gòu)的改造，使植物更大限度地表現(xiàn)出對(duì)我們有利的性狀，從而為人類的生產(chǎn)生活造福。

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