小西葫蘆黃花葉病毒研究進(jìn)展

唐超+陳遠(yuǎn)超+朱春暉+劉勇+張德詠

摘要：小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），同時(shí)也是一種侵染葫蘆科植物的主要病毒，近年來(lái)該病毒的危害愈加嚴(yán)重，如何防控ZYMV已經(jīng)成為種植戶和社會(huì)高度關(guān)注的問(wèn)題。本研究就ZYMV的分類地位、傳播途徑、檢測(cè)方法、防治方法等進(jìn)行綜述，并進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：小西葫蘆黃花葉病毒；分類；傳播途徑；檢測(cè)方法；防治方法

中圖分類號(hào)： S432.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0018-03

小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）最早是由Lisa等[1]在意大利和法國(guó)的小西葫蘆上發(fā)現(xiàn)的一種嚴(yán)重危害生產(chǎn)的病毒。ZYMV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），同時(shí)也是一種侵染葫蘆科植物的主要病毒。整個(gè)病毒粒子大小約為750 nm×11 nm，無(wú)包膜，由4.5%～7%的核苷酸和93%～95%的蛋白質(zhì)組成，基因組大小為9.6 kb，是單個(gè)ORF，編碼10個(gè)功能蛋白[2]。ZYMV能夠侵染葫蘆科、莧科、藜科、豆科在內(nèi)的11個(gè)屬的植物。在自然環(huán)境下，葫蘆科植物感染病毒后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的系統(tǒng)性葉緣壞死、花葉、斑駁、褪綠黃化等癥狀；造成瓜類作物產(chǎn)量降低，果實(shí)出現(xiàn)不同程度的畸形，果實(shí)口感僵硬，味道苦澀，商品價(jià)值降低[3]。苗期感染將會(huì)對(duì)葫蘆科作物造成95%～100%的損失，同時(shí)感病植株所收獲種子的發(fā)芽率大大降低[4]。

隨著葫蘆科作物種植面積擴(kuò)大，如何防控ZYMV已經(jīng)成為種植戶和社會(huì)高度關(guān)注的問(wèn)題。因此，本研究就ZYMV的分類地位、傳播途徑、檢測(cè)方法、防治方法等進(jìn)行綜述，并就相關(guān)方面進(jìn)行展望，以期為葫蘆科作物生產(chǎn)中防控ZYMV提供相關(guān)的基礎(chǔ)知識(shí)。

1 ZYMV的分類與分布

ZYMV的分類：目前ZYMV主要有3種分類方法：癥狀學(xué)分類、血清學(xué)分類以及分子生物學(xué)分類。癥狀學(xué)分類方法主要通過(guò)寄主癥狀來(lái)分類，但存在無(wú)法區(qū)分多種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。血清學(xué)分類主要是利用病毒外殼蛋白與特異性抗體發(fā)生特殊免疫反應(yīng)來(lái)進(jìn)行分類，目前可以將ZYMV分為15種血清學(xué)型，Ⅰ型最為常見(jiàn)，而我國(guó)的ZYMV血清學(xué)型主要為Ⅵ型[5]。由于病毒與寄主存在協(xié)同進(jìn)化，病毒基因組可能發(fā)生變異，導(dǎo)致血清學(xué)分類不準(zhǔn)確，為此分子生物學(xué)分類得到廣泛應(yīng)用，通常以CP基因核苷酸序列多樣性為基礎(chǔ)進(jìn)行分類。Lin等將11個(gè)來(lái)源于不同地區(qū)的ZYMV分為4個(gè)不同的Groups[6]，而Gu等將世界ZYMV分為5個(gè)或6個(gè)Groups[7]，其中有個(gè)別中國(guó)分離物屬于獨(dú)特的Groups；Chen等利用CP基因相對(duì)保守的氨基酸核心區(qū)域和C端序列把25個(gè)ZYMV分離物劃分為5個(gè)Groups[8]；Coutts等利用ZYMV分離物CP基因全基因序列比對(duì)分析將來(lái)自5大洲的143個(gè)ZYMV分離物劃分為A、B、C 3個(gè)Groups[9]，其中Groups A中又細(xì)化分為4個(gè)subgroups，分別為A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ，Groups B分為2個(gè)subgroups，分別為B-Ⅰ、B-Ⅱ，隨后Vuurovic等[10]和秦碧霞等[4]以不同的分型標(biāo)準(zhǔn)得出相似的結(jié)果。

ZYMV的分布：該病毒自首次在法國(guó)以及意大利發(fā)現(xiàn)并報(bào)道以來(lái)，相繼在地中海、東歐、南美洲、澳洲以及亞洲的中部和南部也發(fā)現(xiàn)了ZYMV的分布，經(jīng)過(guò)短短幾十年的時(shí)間已經(jīng)遍布全球50多個(gè)國(guó)家與地區(qū)[11]，主要處在熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū)。我國(guó)1991年由鄭光宇等首次在新疆西瓜上發(fā)現(xiàn)了ZYMV，此后相繼在華北、華南、西南和華東地區(qū)也發(fā)現(xiàn)ZYMV的分布。

2 ZYMV傳播途徑

在自然條件下，ZYMV可以通過(guò)3種方式進(jìn)行傳播：介體傳播、種子傳播和機(jī)械接觸傳播。

介體傳播主要通過(guò)蚜蟲(chóng)以非持久性方式傳毒。目前已報(bào)道桃蚜（Myzus persicae）、棉蚜（Aphis gossypii）等多種蚜蟲(chóng)可以傳播ZYMV病毒，傳毒效率在10%～100%，不同蚜蟲(chóng)的傳毒效率不一致，而且蚜蟲(chóng)的傳毒率與蚜蟲(chóng)取食的時(shí)間成正相關(guān)[12-13]，同時(shí)需要指出的是蚜蟲(chóng)在獲毒后30 h，帶毒率仍能保持在1%～1.9%。研究表明，在蚜蟲(chóng)、植株與病毒之間的互作關(guān)系中發(fā)現(xiàn)感染ZYMV的植株相對(duì)于蚜蟲(chóng)來(lái)說(shuō)更有吸引力，尤其是黃色的葉片，同時(shí)帶毒蚜蟲(chóng)群體壽命將更長(zhǎng)，更加活躍，有翅蚜的數(shù)量相對(duì)來(lái)說(shuō)也會(huì)增加，這些改變導(dǎo)致ZYMV能夠傳播到更遠(yuǎn)的地方。

早年由于檢測(cè)技術(shù)的限制，ZYMV的種子傳毒方式一直存在爭(zhēng)議，近年來(lái)越來(lái)越多的研究結(jié)果證明ZYMV能夠通過(guò)種子進(jìn)行傳播，但是種子帶毒率普遍不高，一般為0～18.9%[14]。有研究者發(fā)現(xiàn)帶毒種子的第一代與第二代傳毒效率存在一定的差異，通過(guò)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，帶毒的種子的低發(fā)芽率導(dǎo)致了這種差異的存在[15]。

機(jī)械傳播是ZYMV一種重要的傳播途徑。由于ZYMV病毒粒子存在于表皮細(xì)胞中濃度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，所以它能夠通過(guò)植株間葉片的接觸、農(nóng)機(jī)具及修剪工具污染、人和動(dòng)物的活動(dòng)等方式在不同的植株之間進(jìn)行傳播，Simmons等的研究結(jié)果證明人類活動(dòng)對(duì)于ZYMV的傳播起到關(guān)鍵作用[16]。

ZYMV短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)散至全球與其多樣的傳播方式有關(guān)。隨著全球化貿(mào)易的加強(qiáng)，地區(qū)間瓜類水果蔬菜的貿(mào)易越來(lái)越頻繁，帶毒的種子與瓜果將會(huì)隨著貿(mào)易帶入其他地區(qū)，因此如何加強(qiáng)監(jiān)測(cè)是防控ZYMV的重要手段。

3 ZYMV檢測(cè)方法

隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，ZYMV的檢測(cè)方法主要有生物學(xué)檢測(cè)、電子顯微檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)4種方法。生物學(xué)檢測(cè)方法是一種傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，同時(shí)也是研究純化病毒與其危害必不可少的手段，成本低且操作簡(jiǎn)單，但是檢測(cè)周期長(zhǎng)，同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)多種病毒復(fù)合侵染干擾的現(xiàn)象。ZYMV在細(xì)胞中可以形成獨(dú)特的內(nèi)含體，這使得使用電子顯微鏡來(lái)檢測(cè)ZYMV成為可能，但是由于高昂的設(shè)備費(fèi)用以及對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)需求卻限制了這種檢測(cè)手段的廣泛應(yīng)用。血清學(xué)方法因成本低廉、檢測(cè)周期較短、靈敏度高等特點(diǎn)被普遍用于ZYMV的檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上已經(jīng)衍生出來(lái)的免疫膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)，使得這種技術(shù)更加貼近大眾化。目前國(guó)內(nèi)已有ZYMV試劑盒開(kāi)發(fā)成功[17]，尚無(wú)ZYMV試紙條的研發(fā)與銷售。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法因其重復(fù)性好、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度和精確度高等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于ZYMV的檢測(cè)，一般根據(jù)ZYMV相對(duì)保守的CP序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，隨后又開(kāi)發(fā)出了能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病毒的多重RT-PCR[18]。此后基于ZYMV保守基因核苷酸片段的差異性而相繼開(kāi)發(fā)出來(lái)的基因芯片技術(shù)[19]、分子雜交技術(shù)[20]以及一維電泳肽指紋技術(shù)等[21]提高了對(duì)ZYMV種群內(nèi)部的辨識(shí)度和靈敏度。

ZYMV的快速暴發(fā)以及巨大危害性引起了國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的關(guān)注，同時(shí)ZYMV的檢測(cè)技術(shù)也受到了國(guó)內(nèi)外的重視，經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)展，隨著對(duì)ZYMV檢測(cè)靈敏度和精確性要求的提高，ZYMV的檢測(cè)技術(shù)從傳統(tǒng)的生物學(xué)檢測(cè)發(fā)展到現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)。但是，目前現(xiàn)有的各種檢測(cè)手段存在一定的限制，不適用于大規(guī)模檢測(cè)和大眾化推廣應(yīng)用，因此開(kāi)發(fā)大規(guī)模檢測(cè)和大眾化快速檢測(cè)手段勢(shì)在必行。

4 ZYMV防治方法

4.1 控制或避開(kāi)傳毒介體

隨著全球氣候變暖，自然傳播介體的流行導(dǎo)致ZYMV危害越來(lái)越嚴(yán)重，因此控制或避開(kāi)蚜蟲(chóng)對(duì)于ZYMV的防治來(lái)說(shuō)至關(guān)重要?？刂蒲料x(chóng)的方法主要有：使用藥劑、套種、物理覆蓋、天敵昆蟲(chóng)以及RNAi技術(shù)。施用農(nóng)藥直接控制蚜蟲(chóng)數(shù)量是最直接與簡(jiǎn)便的方式，目前常用的藥劑有煙酰亞胺類、合成除蟲(chóng)菊酯類，但是長(zhǎng)期使用將無(wú)法避免蚜蟲(chóng)抗性增強(qiáng)，從而對(duì)農(nóng)作物造成更大的危害，因此具有殺蟲(chóng)活性的植物源農(nóng)藥[22]、蚜蟲(chóng)信息素[23]以及微生物農(nóng)藥等新型農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)受到國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的重視。

葫蘆科作物與小麥、玉米或者蕓薹屬作物套種能夠在一定程度上減輕ZYMV的危害；銀灰色鋁箔或地膜對(duì)蚜蟲(chóng)均有趨避作用。利用介體天敵防治蚜蟲(chóng)符合當(dāng)前可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展要求，通過(guò)繁殖蚜繭蜂（Asaphes vulgaris Walker）、蚜小蜂（Aphytis sp.）來(lái)防治三葉草彩斑蚜（Therioaphis trifolii）、麥二叉蚜（Schizaphis graminums）等均取得成功[24]。

上述防治蚜蟲(chóng)介導(dǎo)的病毒病方法存在著污染環(huán)境、高成本以及蚜蟲(chóng)易產(chǎn)生抗性等缺陷，而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的基因沉默現(xiàn)象為解決蚜蟲(chóng)傳毒提供了新思路。利用 RNA干擾技術(shù)（RNA interfernce，RNAi）阻斷病毒與其傳毒介體的特異性互作從而減少蚜蟲(chóng)的帶毒率，阻止病毒在植株間的水平傳播[25]。Whyard等設(shè)計(jì)特異性的雙鏈RNA通過(guò)注射和飼喂等方法在蚜蟲(chóng)中實(shí)現(xiàn)了靶基因的高效沉默[26]，Xu等的研究也發(fā)現(xiàn)蚜蟲(chóng)中存在與dsRNA跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)攝入方式相關(guān)蛋白SID-1，為外源dsRNA誘導(dǎo)昆蟲(chóng)RNAi引起其靶基因沉默來(lái)控制蚜蟲(chóng)傳毒提供了可能[27]。

4.2 選育抗病品種

抗病抗蟲(chóng)育種是防治ZYMV最經(jīng)濟(jì)有效的途徑，也是最有應(yīng)用前景的防治方法。主要包括抗性種質(zhì)資源的篩選、利用和創(chuàng)制。Pitrat和Lecoq發(fā)現(xiàn)來(lái)自印度的甜瓜品系PI414723對(duì)棉蚜具有抗性；來(lái)自津巴布韋收的4個(gè)西瓜（Citrullus lanatus）地方品種對(duì)于ZYMV-FL、藥西瓜（Citrullus colocynthis）品系PI494528、PI494532對(duì)ZYMV均具有抗性，現(xiàn)已在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行推廣。在抗性資源創(chuàng)制方面：Gal-Lerani 等培育了2個(gè)雜交西葫蘆品種Sofia、Linia，擁有3種病毒病ZYMV、CMV、WMV-2的抗性；另外，物理化學(xué)誘變育種、轉(zhuǎn)基因、分子標(biāo)記等新技術(shù)的引入為抗病種植資源的創(chuàng)制提供了便利。

4.3 弱毒株系保護(hù)（交叉保護(hù)）

McKinney發(fā)現(xiàn)侵染植物后引起輕微癥狀的一種病毒株系（也叫弱毒株系）可保護(hù)植株免受挑戰(zhàn)病毒株系的侵染，因此可以有目的地讓植株感染一種弱毒株系，來(lái)保護(hù)其免受嚴(yán)重的病毒入侵。1934年美國(guó)學(xué)者Kunkel提出了利用弱毒株系防治植物病毒病的設(shè)想，1955年P(guān)osnett和Todd利用交叉保護(hù)防治可可腫枝病獲得成功，我國(guó)在利用交叉保護(hù)防治CMV方面獲得一定的成功。對(duì)于ZYMV，土耳其、美國(guó)和以色列已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了ZYMV弱毒株系的商品化，在夏威夷90%農(nóng)民利用商品化的ZYMV-WK來(lái)防治小西葫蘆黃花葉病毒取得良好的效果；對(duì)于弱毒株系的獲得研究者們也做了相關(guān)的研究，Desbiez等發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)ZYMV HC-Pro的點(diǎn)突變可以獲得弱毒株系[28]。

4.4 化學(xué)防治

化學(xué)防治以見(jiàn)效快、效率高受到廣大農(nóng)戶的歡迎，目前許多從植物以及其他有機(jī)體分離得到的物質(zhì)以及一些復(fù)合有機(jī)化合物已經(jīng)被證明具有抵抗植物病毒的活性，如葡聚糖、橘霉素、DHT和水楊酸等能夠在一定程度上減輕ZYMV的病癥[29]，但遺憾的是對(duì)于化學(xué)防治ZYMV的機(jī)制并不是很清楚，使得尚未廣泛使用，因此加強(qiáng)化學(xué)物質(zhì)抗病毒病的機(jī)制研究，有助于化學(xué)防治方法的廣泛應(yīng)用。

5 展望

隨著ZYMV對(duì)葫蘆科作物危害的加重，研究認(rèn)為關(guān)于ZYMV的研究可以從以下幾個(gè)重要的方向來(lái)展開(kāi)：一是開(kāi)發(fā)高效、快速的檢測(cè)方法如實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等，加強(qiáng)對(duì)ZYMV的監(jiān)控力度；二是研究ZYMV的傳播方式、新的傳播途徑，ZYMV的種傳問(wèn)題以及蚜蟲(chóng)介體傳毒的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型防治方法奠定基礎(chǔ)；三是研究ZYMV與寄主以及傳毒介體之間的互作，進(jìn)一步闡述ZYMV的致病機(jī)制和植物抗病的分子機(jī)制；四是加強(qiáng)化學(xué)防治機(jī)制的研究；五是加強(qiáng)抗ZYMV遺傳研究，重視抗病資源收集與抗病基因的挖掘，結(jié)合物理化學(xué)誘變育種、轉(zhuǎn)基因、分子標(biāo)記等新技術(shù)來(lái)加快抗病資源的改良與抗病品種的選育。

參考文獻(xiàn)：

[1]Lisa V，Occardo G，Dellavalle G，et al. Characterization of a potyvirus that causes zucchini yellow mosaic[J]. Phytopathology，1981，71（7）：667-672.

[2]Gal-On A.Zucchini yellow mosaic virus：insect transmission and pathogeni-city-the tails of two proteins[J]. Molecular PlantPathology，2007，8（2）：139-150.