Preso調(diào)控nNOS在神經(jīng)元機械性損傷中的作用

岳康異 楊甜 李新 楊悅凡 戴舒惠 馬文科 蔣曉帆 羅鵬

(第四軍醫(yī)大學：1西京醫(yī)院神經(jīng)外科，2學員一旅;3西京醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710032；4西安交通大學醫(yī)學部，陜西 西安 710061)

·論著·

Preso調(diào)控nNOS在神經(jīng)元機械性損傷中的作用

岳康異1,4楊甜1,2李新3楊悅凡1戴舒惠1馬文科1蔣曉帆1羅鵬1*

(第四軍醫(yī)大學：1西京醫(yī)院神經(jīng)外科，2學員一旅;3西京醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710032；4西安交通大學醫(yī)學部，陜西 西安 710061)

目的通過建立神經(jīng)元機械性損傷模型，研究突觸后致密物質(zhì)(PSD)支架蛋白中的樹突棘突觸后致密物質(zhì)-95(PSD-95)相互作用調(diào)節(jié)蛋白(Preso)在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用及調(diào)控機制。方法建立神經(jīng)元機械性損傷模型，通過細胞活力和乳酸脫氫酶(LDH)檢測神經(jīng)元損傷程度，并通過Western blot檢測明確Preso在損傷后的表達變化；利用Preso慢病毒過表達載體上調(diào)Preso在神經(jīng)元中的表達，通過細胞活力和LDH檢測明確上調(diào)Preso在神經(jīng)元損傷中的作用；利用神經(jīng)元特異性一氧化氮合酶(nNOS)特異性抑制劑ARL 17477，通過細胞活力和LDH檢測明確抑制nNOS對上調(diào)Preso調(diào)控神經(jīng)元損傷的影響。結(jié)果神經(jīng)元機械性損傷后，Preso表達無明顯改變，而上調(diào)Preso表達可加重神經(jīng)元損傷；利用nNOS特異性抑制劑ARL 17477可顯著改善神經(jīng)元損傷，并抑制上調(diào)Preso表達對神經(jīng)元損傷的影響。結(jié)論神經(jīng)元機械性損傷后，Preso可促進神經(jīng)元損傷的形成，而nNOS是其重要的下游效應(yīng)分子。

創(chuàng)傷性腦損傷; 突觸后致密物質(zhì); 支架蛋白; 神經(jīng)元特異性一氧化氮合酶

世界衛(wèi)生組織的報告顯示，外傷是導致人群死亡或喪失正常生活能力的主要原因。在眾多外傷性疾病中，創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)的致殘、致死率最高，給傷者個人、家庭及社會帶來極大的負擔，是世界范圍內(nèi)亟待解決的公共衛(wèi)生問題[1]。突觸后致密物質(zhì)(postsynaptic density,PSD)是神經(jīng)元突觸后膜上一系列蛋白的統(tǒng)稱，包括谷氨酸受體、支架蛋白、信號轉(zhuǎn)導分子等上百種分子，與興奮性毒性損傷的調(diào)控密切相關(guān)[2]。大量的研究表明，PSD支架蛋白參與TBI后神經(jīng)元損傷的調(diào)節(jié)，是潛在的TBI治療關(guān)鍵點。

突觸后支架蛋白樹突棘突觸后致密物質(zhì)-95(PSD-95)相互作用調(diào)節(jié)蛋白(PSD-95 interacting regulator of spine morphogenesis,Preso)是一種包含多個蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的PSD支架蛋白，可以同時連接谷氨酸受體及其他PSD支架蛋白，進而參與突觸功能調(diào)控[3]。我們的前期研究證實，Preso可通過差異性調(diào)節(jié)代謝性谷氨酸受體和離子型谷氨酸受體的功能，影響神經(jīng)元興奮性毒性損傷，提示其可作為神經(jīng)元保護的重要靶點[4]。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究利用機械性神經(jīng)元損傷模型在離體神經(jīng)元上模擬TBI，旨在探討Preso在TBI后神經(jīng)元損傷中的作用及機制。

材料與方法

一、材料

孕14～16 d 昆明小鼠購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心；Preso抗體購自美國Ramp;D公司；β-actin抗體購自美國CST公司；山羊抗兔二抗、兔抗小鼠二抗均購自北京鼎國公司；神經(jīng)元特異性一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)特異性抑制劑ARL17477購自英國Tocris公司；神經(jīng)元基質(zhì)培養(yǎng)基(neurobasal)、B27、10%胎牛血清、改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)均購自美國Gibco公司；多聚賴氨酸、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)均購自美國Sigma公司；Preso慢病毒過表達載體(lentiviral vector-Preso,LV-Preso)、慢病毒對照載體(lentiviral vector-control,LV-Con)均購自上海吉凱公司；細胞活力檢測試劑盒、蛋白裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)、苯甲基磺酞氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、凝膠電泳試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白定量試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)公司。

二、方法

1.小鼠腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)：孕14～15 d昆明小鼠，常規(guī)處死后在無菌狀態(tài)下快速取出小鼠胚胎，在解剖顯微鏡下剝離小鼠胚胎大腦皮層。剪碎腦皮層，加入胰蛋白酶并置于37℃、5% CO2孵箱中消化20 min。在室溫下加入含10%胎牛血清的DMEM終止消化10 min，并在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中將組織塊吹打成細胞懸液。室溫靜置5 min，顯微鏡下計數(shù)，以2.5×105個細胞/cm2將細胞接種于6孔和96孔細胞培養(yǎng)板，神經(jīng)元體外培養(yǎng)2 w后備用。

2.體外培養(yǎng)神經(jīng)元機械性損傷：以10 μl的微量移液器塑料槍頭于6孔板內(nèi)劃割，造成神經(jīng)元機械性損傷，劃傷道寬度為1 mm，兩相鄰劃傷道間隔4 mm。依據(jù)預(yù)先在培養(yǎng)皿底面畫好的標記線(9×9)劃割培養(yǎng)好的神經(jīng)元，標記線均勻分布在培養(yǎng)皿底面，保證同一組內(nèi)的神經(jīng)元損傷程度和范圍一致。

3.神經(jīng)元轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前6 h對神經(jīng)元換液，按照1×105TU/ml的濃度分別加入LV-Preso和LV-Con，轉(zhuǎn)染48 h后在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，72 h后可進行實驗分組操作。

4.乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性測定：每培養(yǎng)皿收集100 μl培養(yǎng)基用于LDH活性測定，方法按照試劑盒說明書操作，反應(yīng)結(jié)束后在440 nm測定樣品吸光度計算LDH活性。標準以每克乳酸脫氫酶蛋白37℃與基質(zhì)作用15 min，反應(yīng)體系中產(chǎn)生1 μmol丙酮酸記為1 U LDH活性。

5.蛋白印跡法(Western blot)檢測蛋白表達：將損傷區(qū)域腦組織加入蛋白裂解液后在冰上進行勻漿，完成后將組織勻漿離心30 min，取上清液進行蛋白定量檢測，并制備成Western Blot樣品。常規(guī)電泳，Preso一抗(1∶800)、β-actin一抗(1∶1 500)，顯色壓片后使用掃描儀采集電子圖像信息進行分析。

6.統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標準誤表示，通過GraphPad Prism software version 5.0對獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。多區(qū)間數(shù)據(jù)比較采用雙因素方差分析(ANOVA)，若總體差異顯著，再以t檢驗分析相應(yīng)兩組間的顯著性差別。以Plt;0.05為有顯著性差異。

結(jié) 果

一、神經(jīng)元機械性損傷后Preso的表達變化

在不同時間點對離體神經(jīng)元進行機械性損傷，細胞活力檢測結(jié)果顯示，神經(jīng)元細胞活力隨損傷時間延長不斷降低(圖1A)；LDH檢測結(jié)果顯示，LDH釋放含量隨損傷時間延長不斷增加(圖1B)；這些結(jié)果提示機械性神經(jīng)元損傷模型造模成功。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，損傷后6 h、12 h、24 h神經(jīng)元中的Preso表達未見明顯變化(圖1C)，提示Preso在損傷后穩(wěn)定表達。

二、Preso在神經(jīng)元機械性損傷中的作用

利用LV-Preso和LV-Con對神經(jīng)元進行轉(zhuǎn)染，72 h后建立機械性神經(jīng)元損傷模型。Western blot結(jié)果顯示，LV-Preso轉(zhuǎn)染組與LV-Con組相比，Preso表達明顯上調(diào)(圖2A)；細胞活力檢測結(jié)果顯示，上調(diào)Preso表達顯著降低損傷后神經(jīng)元細胞活力(圖2B)；LDH檢測結(jié)果顯示，上調(diào)Preso表達顯著升高LDH釋放量(圖2C)。這些結(jié)果提示，Preso可促進機械性神經(jīng)元損傷的形成。

三、nNOS在Preso調(diào)控神經(jīng)元機械性損傷中的作用

利用LV-Preso和LV-Con對神經(jīng)元進行轉(zhuǎn)染，72 h后建立機械性神經(jīng)元損傷模型，并給予nNOS特異性抑制劑ARL 17477(10 μM)。細胞活力檢測和LDH檢測結(jié)果顯示，與DMSO組相比，ARL 17477可明顯改善神經(jīng)元活力、減少LDH釋放(圖3)。然而，給予ARL 17477后，LV-Con組與LV-Preso組相比在細胞活力、LDH釋放上并無顯著差異(圖3)。以上結(jié)果提示，抑制nNOS活性可在神經(jīng)元機械性損傷后發(fā)揮保護作用，并明顯抑制Preso對神經(jīng)元損傷的影響，表明nNOS在Preso調(diào)控神經(jīng)元機械性損傷中發(fā)揮重要作用。

圖1 神經(jīng)元機械性損傷后細胞活力、LDH釋放及Preso表達的變化
Fig 1 Alterations of cell viability,LDH release,and Preso expression after neuronal mechanical injury
A:Cell viability assay showed a significant reduction of cell viability at 6 h,12 h,and 24 h after injury;B:LDH assay showed a significant elevation of LDH release at 6 h,12 h,and 24 h after injury;C:Western blot did not show a significant change of Preso expression after injury.
aPlt;0.05,vsCon.

圖2 上調(diào)Preso對神經(jīng)元機械性損傷的影響
Fig 2 Effects of Preso up-regulation on neuronal mechanical injury
A:Western blot showed a significant elevation of Preso expression in LV-Preso group;B:Cell viability assay showed a significant reduction of cell viability in LV-Preso after injury;C:LDH assay showed a significant elevation of LDH release in LV-Preso after injury.
aPlt;0.05,vsLV-Con.

圖3 nNOS抑制ARL 17477對Preso調(diào)控神經(jīng)元機械性損傷的影響
Fig 3 Effects of ARL 17477,a nNOS inhibitor,on regulation of neuronal mechanical injury by Preso
A:Cell viability assay showed a significant elevation of cell viability in ARL 17477 group,but no significant difference between LV-Con group and LV-Preso group after ARL 17477 treatment;B:LDH assay showed a significant reduction of LDH release in ARL 17477 group,but no significant difference between LV-Con group and LV-Preso group after ARL 17477 treatment.
aPlt;0.05,vsDMSO;bPlt;0.05,vsLV-Con.

討 論

PSD支架蛋白是PSD分子網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，一方面可通過PSD-95/Dlg/ZO-1(PDZ)結(jié)構(gòu)域(例如PSD-95)聚集PSD蛋白，發(fā)揮穩(wěn)定PSD結(jié)構(gòu)的作用；另一方面，PSD支架蛋白(例如Homer、Shank)通過相互連接形成一種分子網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，為PSD中的受體和信號轉(zhuǎn)導蛋白提供作用平臺，調(diào)節(jié)PSD功能[5]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，TBI后PSD支架蛋白PSD-95、Homer1a及Homer1b/c表達均有所變化，提示TBI后突觸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。而近期的研究表明，PSD-95抑制劑ZL006可顯著降低TBI后腦水腫反應(yīng)，改善神經(jīng)功能，并抑制TBI后損傷灶周邊的氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。此外，上調(diào)Homer1a或下調(diào)Homer1b/c能夠減輕TBI及興奮性毒性損傷引起的神經(jīng)元凋亡、腦組織破壞及神經(jīng)功能障礙[7,8]。以上結(jié)果證實，PSD支架蛋白不但是TBI后突觸結(jié)構(gòu)改變的標志蛋白，同時也可作為潛在的功能性分子參與TBI病理過程。

Preso是一種包含多個蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的PSD支架蛋白，可以同時連接PSD-95、mGluR和Homer，進而參與突觸結(jié)構(gòu)與功能調(diào)節(jié)。研究表明，Preso羧基末端的PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域可直接與PSD-95的PDZ結(jié)構(gòu)域相連，從而為PSD-95及其連接的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)提供了分子作用平臺，使其構(gòu)成的NMDAR/PSD-95復合體在發(fā)揮調(diào)節(jié)突觸結(jié)構(gòu)和功能的作用[4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Preso在神經(jīng)元中的表達，可明顯減輕神經(jīng)元谷氨酸興奮性毒性損傷，其具體機制與抑制NMDAR受體引起的Ca2+超載密切相關(guān)[5]。本研究證實，上調(diào)Preso在神經(jīng)元中的表達，可加重神經(jīng)元機械性損傷，進一步說明Preso可直接參與TBI后神經(jīng)元損傷的形成，而其作用機制與Preso調(diào)控NMDAR/PSD-95復合體下游信號密切相關(guān)。

PSD-95可通過2個不同的PDZ結(jié)構(gòu)域分別和NMDA受體及nNOS相結(jié)合，形成NMDAR/PSD-95/nNOS復合體，發(fā)揮促進氧化應(yīng)激的作用。TBI后，nNOS選擇性結(jié)合環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)，通過亞硝基化激活COX-2，從而參與NMDAR介導的神經(jīng)毒性[9]。除NO外，線粒體內(nèi)Ca2+水平上調(diào)可引起包括超氧陰離子自由基在內(nèi)的ROS的產(chǎn)生。NO與ROS結(jié)合會形成具有高硝化活性的過氧亞硝基陰離子(ONOO-)。研究表明，TBI可產(chǎn)生大量的ONOO-，從而引起蛋白質(zhì)硝基化、脂質(zhì)過氧化和DNA斷裂，最終引起神經(jīng)細胞大量死亡[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)，nNOS特異性抑制劑可有效抑制上調(diào)Preso所引起的神經(jīng)元過度損傷，證實nNOS是TBI后Preso調(diào)控NMDAR/PSD-95復合體的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子。

本實驗以PSD支架蛋白Preso為切入點，證實其在TBI后發(fā)揮促進神經(jīng)元損傷的作用，并進一步探討了nNOS作為其重要效應(yīng)分子在TBI中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。這些研究結(jié)果不但豐富了TBI的分子病理機制，同時為有效干預(yù)TBI后神經(jīng)元損傷提供了關(guān)鍵靶點。

1Rubiano AM,Carney N,Chesnut R,et al. Global neurotrauma research challenges and opportunities [J]. Nature,2015,527(7578):S193-197.

2Sheng M,Hoogenraad CC. The postsynaptic architecture of excitatory synapses:a more quantitative view [J]. Annu Rev Biochem,2007,76:823-847.

3Lee HW,Choi J,Shin H,et al. Preso,a novel PSD-95-interacting FERM and PDZ domain protein that regulates dendritic spine morphogenesis [J]. J Neurosci,2008,28(53):14546-14556.

4Luo P,Yang Y,Liu W,et al. Downregulation of postsynaptic density-95-interacting regulator of spine morphogenesis reduces glutamate-induced excitotoxicity by differentially regulating glutamate receptors in rat cortical neurons [J]. FEBS J,2013,280(23):6114-6127.

5Hayashi MK,Tang C,Verpelli C,et al. The postsynaptic density proteins Homer and Shank form a polymeric network structure [J]. Cell,2009,137(1):159-171.

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EffectsofPresoonregulationofnNOSafterneuronalmechanicalinjury

YUEKangyi1,3,YANGTian1,2,LIXin4,YANGYuefan1,DAIShuhui1,MAWenke1,JIANGXiaofan1,LUOPeng1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,2FirstTroopsofUndergraduateStudents,3DepartmentofAnesthesiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032;4CollegeofMedicine,Xi'anJiaotongUniversity,Xi'an710061,China

ObjectiveThe role of postsynaptic density (PSD) scaffold protein PSD-95 interacting regulator of spine morphogenesis (Preso) in traumatic brain injury via establishment of neuronal mechanical injury model was investigated.MethodsAfter neuronal mechanical injury,neuronal injury was detected by cell viability and lactate dehydrogenase (LDH) assay;expression of Preso was detected by Western blot. After up-regulating Preso expression in neurons by transfection of lentiviral vector,neuronal injury was detected by cell viability and LDH assay. After administration of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) specific inhibitor,ARL 17477,neuronal injury was detected by cell viability and LDH assay.ResultsAfter neuronal mechanical injury,expression of Preso did not change. Overexpression of Preso reduced the neuronal injury. Neuronal injury was reversed by using ARL 17477. ARL 17477 suppressed the effects of Preso overexpression on neuronal injury.ConclusionPreso promotes the neuronal injury after neuronal mechanical injury and nNOS acts as an important downstream factor of Preso.

Traumatic brain injury;Postsynaptic density;Scaffold protein;Neuronal nitric oxide synthase

1671-2897(2016)15-510-04

R 651

A

國家自然科學基金資助項目(81301037,81371447)；陜西省自然科學基金資助項目(2014JM4200)；中國博士后基金資助項目(2015M572683)

岳康異，本科， E-mail:176214964@qq.com

*通訊作者：羅鵬，講師、主治醫(yī)師， E-mail:pengluo@fmmu.edu.cn

2016-07-08；

2016-10-10)