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    雷公藤甲素脂肪乳的制備及其體外性質研究

    2015-03-08 05:32:36毛玉玲王淑君
    中國藥劑學雜志(網絡版) 2015年4期
    關鍵詞:脂肪乳甲素油相

    李 雪,毛玉玲,李 凱,程 丹,王淑君*

    (1. 沈陽藥科大學 中藥學院,遼寧 沈陽 110016;2. 沈陽藥科大學 藥學院,遼寧 沈陽 110016)

    雷公藤甲素脂肪乳的制備及其體外性質研究

    李 雪1,毛玉玲1,李 凱2,程 丹2,王淑君2*

    (1. 沈陽藥科大學 中藥學院,遼寧 沈陽 110016;2. 沈陽藥科大學 藥學院,遼寧 沈陽 110016)

    目的確定雷公藤甲素脂肪乳的處方及制備工藝,并對其體外性質進行考察。方法采用高壓勻質法制備雷公藤甲素脂肪乳,單因素和正交設計法考察制備工藝及處方;采用激光粒度測定儀測定其粒徑及電位;采用超濾離心法測定包封率;采用可見分光光度法對其進行體外溶血性評價。結果制備的雷公藤甲素脂肪乳劑外觀呈白色乳狀,粒徑為(154.6±8.3) nm;平均電位為(-0.903±0.024) mV;包封率可達到85%以上;溶血率均小于5%。結論高壓勻質法可用于雷公藤甲素脂肪乳的制備,并且所獲得的脂肪乳劑性質良好。

    藥劑學;脂肪乳;高壓勻質法;雷公藤甲素;包封率;溶血試驗

    雷公藤甲素(triptolide,TP)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook. F. )中分離出的活性最高的環(huán)氧二萜內酯化合物,是雷公藤的主要有效成分之一,具有免疫抑制、抗炎、抗生育及抗腫瘤等多種藥理活性[1]。在臨床上廣泛應用于治療風濕類疾病、器官移植、腎病、哮喘和腫瘤。近年來,廣泛的抗腫瘤作用使雷公藤甲素受到極大關注,其不僅可以抑制體外多種癌細胞的增殖,還能夠抑制體內實體瘤的生長和轉移[2-3]。但是由于雷公藤甲素的低水溶性及其對胃腸道、腎臟、造血系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)的毒性及不良反應使其臨床應用受到限制[4-5]。

    脂肪乳作為一種新型的載藥體系,是脂溶性藥物的良好載體,具有增溶和降低藥物不良反應等特點。同時,藥物被包裹于油相或油水界面層中,避免與體液直接接觸,降低刺激性。脂肪乳中油的種類、乳滴粒徑及表面電荷電性等因素直接影響靜脈乳劑的體內分布,并且具有一定的靶向性,能夠使其更好地發(fā)揮療效,降低藥物的毒性及不良反應[6]。由此可見,脂肪乳劑是雷公藤甲素靜脈給藥的良好載體。

    1 儀器與材料

    高效液相色譜儀(紫外SPD-10A 檢測器, LC-15C液相泵,日本Shimadzu 公司),pH計(上海宇隆儀器有限公司),TGL-18C-C快速離心機(上海安亭科學儀器廠),SCQ2201超聲波清洗器(上海聲彥超聲波儀器有限公司),分析天平(TG328A,上海精密科學儀器有限公司),DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠),AH100D高壓勻質機(加拿大 ATS公司),Mastersizer-2000-激光粒度電位測定儀(英國Malvern儀器公司),UV-2000紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)。

    雷公藤甲素(triptolide,TP,南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司),大豆磷脂(磷脂酰膽堿含量質量分數≥98%,上海太偉醫(yī)藥科技有限公司),油酸、注射用大豆油(LCT)、中鏈油(MCT)(中航鐵嶺藥業(yè)),F68(德國BASF公司),無水乙醇(分析純,天津富宇精細化工有限公司),甲醇、乙腈(色譜純,天津康科德科技有限公司),其他試劑(分析純,市售)。

    2 方法與結果

    2.1 雷公藤甲素脂肪乳的制備

    將處方量雷公藤甲素和磷脂分散于注射用油、油酸中,于 80 ℃加熱磁力攪拌下溶解均勻,得澄清得含藥油相;將處方量甘油、F68、EDTA分散于適量注射用水中,于80 ℃加熱磁力攪拌使分散均勻得水相。在高速組織搗碎機攪拌下(1×104r·min-1)迅速將水相加入到油相中,高速剪切10 min,制得均勻初乳。初乳冷卻至室溫,以0.1 mol·L-1氫氧化鈉或鹽酸調節(jié)溶液pH值,注射用水稀釋至全量,轉移至高壓勻質機中,800 bar勻質8次。裝瓶,充氮,密封,121 ℃熱壓蒸汽滅菌10 min,取出后于冷水浴中迅速冷卻。

    2.2 雷公藤甲素脂肪乳制備工藝的考察

    2.2.1 初乳制備溫度的選擇

    磷脂存在相轉化溫度,在其相轉化溫度為70~80 ℃內制備的乳劑粒徑較小,也比較穩(wěn)定[7];而在高溫時油相的黏度較低,外部施加的剪切力所作的功較小,利于乳化。因此采用 80 ℃為水相、油相的制備溫度。

    2.2.2 藥物加入方法的考察

    不同藥物制備載藥型脂肪乳的方法和技術各不相同,一般情況下制備載藥型脂肪乳的方法是將脂溶性藥物與乳化劑直接溶解于油相中,利用兩步乳化法進行制備。但是,在本實驗中,若將藥物與磷脂直接加入到油相中,80 ℃加熱攪拌1 h后仍不能溶解完全,說明藥物與磷脂未完全溶解于油相中,且高溫長時間的溶解對藥物的化學穩(wěn)定性也很不利。因此,本研究中將藥物與磷脂先溶解于適量無水乙醇中,然后揮干乙醇加入油相,藥物與磷脂溶解迅速而完全,能夠得到澄清的載藥油相,避免磷脂和藥物長時間加熱而引起的降解。

    2.2.3 高壓勻質壓力和次數的考察

    脂肪乳的粒徑大小及分布是影響制劑物理穩(wěn)定性的重要因素,而高壓勻質過程對粒徑大小和粒徑分布影響很大,因此,本實驗對高壓勻質操作參數進行了優(yōu)化。勻質壓力的考察范圍為 600~1 000 bar,每個樣品勻質8次,結果見圖1A。在確定最佳勻質壓力后,根據所確定的勻質壓力勻質4~12次,進行勻質次數的考察,結果見圖1B。

    Fig. 1 Influence of different homogenization pressures on particle size of TP-LE(A) and different cycle times on particle size of TP-LE (B)±s, n=3)圖1 不同勻質壓力對雷公藤甲素脂肪乳粒徑的影響(A)和不同勻質次數對雷公藤甲素脂肪乳粒徑的影響(B)

    由圖1A可見,隨著勻質壓力的不斷增加,TP-LE的粒徑逐漸減小,當壓力達到800 bar時,進一步增加壓力,粒徑基本不再降低,而代表粒徑分布的PDI值卻有增大趨勢??紤]到較高的勻質壓力需要更多的能量消耗,同時在較大的勻質壓力下進行高壓勻質易出現制劑過熱而影響制劑的穩(wěn)定性,因此,將制備TP-LE的高壓勻質壓力確定為800 bar。由圖1B可見,在高壓勻質壓力為800 bar時,隨著勻質次數的增加,TP-LE的平均粒徑都逐漸減小,當勻質次數達到8次以后,繼續(xù)增加勻質次數,粒徑不再減小,而代表粒徑分布的PDI值卻有增大趨勢,因此,將制備TP-LE的高壓勻質次數確定為8次。

    2.2.4 pH值的考察

    pH值是影響制劑物理穩(wěn)定性的重要因素之一,臨床常用的脂肪乳注射液pH值多在5~8內,而雷公藤甲素在酸性條件下較穩(wěn)定,堿性條件下降解明顯,在pH值為6時降解最慢。本實驗分別考察了pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時TP-LE的物理和化學穩(wěn)定性。實驗發(fā)現,pH值在5.0~7.0內乳劑滅菌前后的物理穩(wěn)定性均較好,進一步對制劑的化學穩(wěn)定性進行了考察,不同 pH值的脂肪乳劑滅菌后的藥物含量變化見圖2。結果表明,pH值為6時藥物含量最高,化學穩(wěn)定性最好。考慮到TP-LE的滅菌穩(wěn)定性及人體的耐受性,最終確定滅菌前以0.1 mol·L-1氫氧化鈉將TP-LE的pH值調為5.5~6.0。

    Fig. 2 Influence of pH value on the content of TP-LE圖2 pH值對雷公藤甲素脂肪乳含量的影響

    2.3 正交試驗設計處方優(yōu)化

    油相和乳化劑是脂肪乳處方中重要的組成部分,油相的組成和比例直接影響脂肪乳的溶解性能、外觀和粒徑分布,乳化劑直接影響脂肪乳乳化過程,進而影響制劑的物理化學穩(wěn)定性。本實驗對脂肪乳處方組成中油相比例、磷脂、F68及油酸的用量進行了正交設計優(yōu)化,各因素安排見表1。

    Table 1 Factors and levels of the orthogonal design表1 正交設計試驗表

    采用L9(34)正交設計進行處方篩選,按表2所示制備雷公藤甲素脂肪乳后,以外觀和粒度測定結果為指標進行處方篩選,以粒徑均勻且較小為好。

    Table 2 Investigation on the optimum conditions for preparing TP-LE by orthogonal design表2 雷公藤甲素脂肪乳處方正交設計優(yōu)化

    Continued table 2

    根據表2中極差值(R)可知,各因素對粒徑影響的主次順序是B>C>A>D,說明磷脂和F68的用量對TP-LE影響最為顯著,其次是油相比例和油酸用量。由此得出各因素最佳組合為A3B3C2D2。通過分析正交設計表及綜合因素篩選得最優(yōu)處方為(質量分數):LCT為2.5%、MCT為7.5%、磷脂為2.4%、F68為0.2%和油酸為0.05%。

    2.4 雷公藤甲素脂肪乳穩(wěn)定性研究

    以雷公藤甲素脂肪乳粒徑、含量、包封率、pH值為指標,對雷公藤甲素脂肪乳進行穩(wěn)定性考察。

    2.4.1 滅菌穩(wěn)定性考察

    制備3批雷公藤甲素脂肪乳樣品分別裝瓶、充氮、密封,121 ℃熱壓蒸汽滅菌10 min,取出后于冷水浴中迅速冷卻,滅菌后進行各項理化性質檢查和測定,與滅菌前相比較,結果見表 3。結果表明,雷公藤甲素脂肪乳滅菌穩(wěn)定性良好。

    Table 3 Results of TP-LE autoclave test表3 雷公藤甲素脂肪乳滅菌穩(wěn)定性考察

    2.4.2 凍融穩(wěn)定性考察

    將滅菌后的3批雷公藤甲素脂肪乳樣品于-20 ℃條件下凍融3次循環(huán),凍融后的脂肪乳樣品進行理化性質檢查和測定,與凍融前相比較,結果見表 4。結果表明,雷公藤甲素脂肪乳凍融穩(wěn)定性良好。

    Table 4 Results of freeze-thaw stability表4 雷公藤甲素脂肪乳凍融穩(wěn)定性考察

    2.4.3 加速穩(wěn)定性考察

    將滅菌后的3批雷公藤甲素脂肪乳樣品于 (40±2) ℃加速試驗3個月,進行理化性質檢查和測定,與加速試驗前相比較,結果見表5。結果表明,雷公藤甲素脂肪乳穩(wěn)定性良好。

    Table 5 Results of accelerated stability表5 雷公藤甲素脂肪乳加速穩(wěn)定性考察

    2.5 雷公藤甲素脂肪乳處方工藝的確定

    雷公藤甲素脂肪乳的處方為:雷公藤甲素12.5 mg、油相(LCT-MCT質量分數比為2.5∶7.5)10 g、磷脂2.4 g、油酸50 mg、F68 0.2 g、甘油2.5 g和EDTA50 mg,制成100 mL。

    雷公藤甲素脂肪乳的制備工藝:稱取處方量注射用油(LCT-MCT質量分數比2.5∶7.5)、油酸于80 ℃下攪拌分散均勻得油相,稱取處方量雷公藤甲素、磷脂于適量無水乙醇中,80 ℃下攪拌至完全溶解,揮盡乙醇,加入油相,80 ℃下繼續(xù)攪拌,得澄清含藥油相;稱取處方量甘油、F68、EDTA加至適量注射用水中,80 ℃下磁力攪拌使溶解,分散均勻得水相;在高速組織搗碎機攪拌下(1×104r·min-1)迅速將水相加入到油相中,高速剪切10 min,制得均勻初乳;將初乳冷卻至室溫,以0.1 mol·L-1氫氧化鈉調節(jié)溶液pH值至5.5~6.0,注射用水稀釋至全量,轉移至高壓勻質機中,800 bar勻質8次,制得終乳;將所得終乳裝瓶、充氮、密封,于121 ℃熱壓蒸汽滅菌10 min,取出后于冷水浴中迅速冷卻即得雷公藤甲素脂肪乳。

    2.6 雷公藤甲素脂肪乳粒徑及zeta電位的測定

    將按“2.5”條方法制備的雷公藤甲素脂肪乳過0.22 μm微孔濾膜,注射用水稀釋500倍,采用Mastersizer-2000-激光粒度分析儀測定其粒徑大小及分布。制備的雷公藤甲素脂肪乳劑為均一穩(wěn)定而帶有淡藍色乳光的均勻分散體系,其粒徑分布在(154.6±8.3) nm,PDI值為(9.3±0.8)×10-2;以Mastersizer-2000-激光粒度分析儀測定其電位,平均電位為(-0.903±2.4×10-2) mV。

    2.7 雷公藤甲素脂肪乳的含量及包封率考察

    2.7.1 含量測定

    以雷公藤甲素為指標,采用HPLC法測定雷公藤甲素脂肪乳中雷公藤甲素的含量。

    色譜條件:色譜柱為Kromasil C18柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈-水(體積比40∶60),流速為1 mL·min-1,檢測波長為220 nm,進樣量為20 μL,柱溫為室溫。

    取0.1 mL雷公藤甲素脂肪乳劑置于10 mL量瓶中,用甲醇破乳稀釋并定容至刻度。用0.22 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液20 μL注入高效液相色譜儀,以外標一點法測定雷公藤甲素脂肪乳中雷公藤甲素含量。HPLC法測定3批雷公藤甲素脂肪乳中雷公藤甲素含量質量分數均在98%以上。

    2.7.2 包封率考察

    采用超濾離心法測定雷公藤甲素脂肪乳包封率,分別測定脂肪乳劑中藥物總量及水相中藥物含量,由以下公式計算包封率(EE%):w(EE) =(ρtotalVtotal-ρwaterVwater)/ρtotalVtotal×100%。

    式中ρtotal為脂肪乳中藥物總質量濃度(g·L-1);Vtotal為脂肪乳總體積(L);ρwater為水相中藥物質量濃度(g·L-1);Vwater為水相體積(L)。

    藥物總量的測定:按“2.7.1”條色譜條件測定脂肪乳劑中藥物總量。

    水相中藥物含量測定:精密吸取雷公藤甲素脂肪乳液2 mL置于截留分子質量為1×104u的超濾離心管中,4 000 r·min-1離心15 min,重復3次,取濾液20 μL注入高效液相色譜儀,測定水相中藥物含量。

    包封率計算:按上式計算3批雷公藤甲素脂肪乳包封率,結果表明雷公藤甲素脂肪乳包封率質量分數均大于85%。

    2.8 雷公藤甲素脂肪乳體外溶血試驗

    紅細胞懸液的配制:取新鮮家兔耳緣靜脈血5 mL,置燒杯中,玻璃棒攪拌除去纖維蛋白原,1 000 r·min-1離心10 min,除去上清液,沉淀的紅細胞用生理鹽水輕輕搖勻,洗滌數次,直至上清液不顯紅色為止,棄去上清液,用生理鹽水配制體積分數為2%的紅細胞懸液。

    溶血試驗:取潔凈試管7支,1~5號管為供試品,按表6依次加入體積分數2%紅細胞懸液、生理鹽水、雷公藤甲素脂肪乳注射夜;6號管為陰性對照;7號管為陽性對照?;靹?~7號管,置(37±0.5)℃恒溫水浴中溫浴。3 h后取樣,1 000 r·min-1離心10 min,取上清液適當稀釋后,以蒸餾水為對照,于波長545 nm處測定吸光度,按下式計算溶血率:HD=(As-An-ATP-LE)/(A0-An)×100%。

    式中:As為供試品吸光度、An為陰性對照品吸光度、Ao為陽性對照品吸光度、ATP-LE為雷公藤甲素脂肪乳樣品吸光度。表6結果表明各管雷公藤甲素脂肪乳的溶血率均小于5%。

    Table 6 Design and results of hemolysis test of TP-LE表6 雷公藤甲素脂肪乳溶血試驗設計及結果

    3 討論

    a. 脂肪乳的制備受到許多因素的影響,其中工藝參數包括藥物加入方法、pH值的調節(jié)、高壓勻質壓力和次數;處方因素包括油相的組成和比例、乳化劑的選擇及用量等。脂肪乳注射液油相最初主要是選擇植物來源的長鏈甘油三酯(LCT),如大豆油、玉米油等。雖然 LCT脂肪乳能夠為患者提供必需的脂肪酸和能量,但LCT進入線粒體代謝需依賴于肉毒堿轉運,氧化代謝速度慢,長期使用可能對機體免疫功能有抑制作用。中鏈甘油三酯(MCT)分子質量較小,有較大的水溶性及較低的 pKa值,不需依賴肉毒堿即可進入線粒體進行快速氧化,在血液循環(huán)中的清除速度較快,不易在肝臟中蓄積。但不足之處是不能提供必需的脂肪酸,應用純MCT可引起代謝性酸中毒和神經系統(tǒng)不良反應。所以根據正交試驗設計結果將LCT與MCT按照質量分數2.5∶7.5比例進行物理混合后所制備的脂肪乳能夠達到揚長避短的效果[8-9]。磷脂是最常用的天然乳化劑,具有良好的乳化性能,無毒且生物相容性好。但對于載藥型脂肪乳來說,單一的乳化劑并不足以維持脂肪乳的穩(wěn)定,通常將磷脂與F68合用,制備載藥脂肪乳注射液以增加制劑的穩(wěn)定性[10]。油酸能夠促進磷脂、F68分子間的相互作用,形成復合膜[11];同時能夠增加分子間作用力及乳滴表面靜電電荷,進而增大界面膜的穩(wěn)定性。作者通過正交設計考察最終確定油相組成為LCT與MCT的質量分數比為2.5∶7.5,磷脂用量的質量分數為2.4%,F68用量的質量分數為0.2%,油酸用量的質量分數為0.05%。

    b. 超濾離心法是常見的藥物測定包封率的方法,本文作者利用該法成功分離出脂肪乳中水相,由于藥物主要包裹于油相和油水界面層中,處方組成中其水相的體積占總體積的90%,通過測定水相中藥物含量和脂肪乳中藥物總量,計算脂肪乳包封率。該法操作簡單、快速、重現性好。

    c. 注射藥物的安全性評價是藥物安全性試驗的一個重要組成部分,溶血試驗結果表明不同濃度的雷公藤甲素脂肪乳并未產生溶血現象,不會導致紅細胞發(fā)生溶血和凝聚反應,為臨床安全用藥提供重要依據。

    參考文獻:

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    Preparation and characterization of triptolide-loaded lipid emulsion

    LI Xue1, MAO Yu-ling1, LI Kai2, CHENG Dan2, WANG Shu-jun2*
    (1. School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

    ObjectiveTo optimize the formulation and preparation of triptolide-loaded lipid emulsion (TP-LE) and investigate its characterization in vitro.MethodsTP-LE was prepared by a high-pressure homogenization method. The preparation technology and formulation were investigated by single factor exploration and orthogonal design. The particle size and zeta potential were determined by a laser scattered particle analyzer. The ultrafiltration centrifugation method was used to determine drug entrapmentefficiency (EE%) of triptolide in TP-LE. UV-VIS spectrophotometry was used for in vitro hemolytic evaluation.ResultsThe prepared TP-LE was milky white in appearance, with particle size of (154.6±8.3) nm; zeta potential of (-0.903±0.024) mV; EE% of >85%; hemolysis ratio of <5%.ConclusionsHigh-pressure homogenization method can be used to prepare triptolide-loaded lipid emulsion for i.v. administration, and the character of TP-LE was pretty good.

    Pharmaceutics; Lipid emulsion; High-pressure homogenization method; Triptolide; Entrapment efficiency; Hemolysis test

    R94

    :A

    (本篇責任編輯:趙桂芝)

    (2015)04-0134-10

    10.14146/j.cnki.cjp.2015.04.003

    2015-02-12

    李雪(1990-), 女(漢族), 遼寧沈陽人, 碩士研究生,,E-mail lixuelixue75@163.com; *

    : 王淑君(1972-), 女(漢族), 遼寧沈陽人, 教授, 博士, 博士生導師, 主要從事藥物制劑研究, Tel. 024-23986360, E-mail 1252116911@qq.com。

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