應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)甜菜霜霉病菌

張娜，乾義柯，魏霜，張維，焦子偉，張祥林

(1. 伊犁師范學(xué)院生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧 835000；2. 伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆伊寧 835000；3. 汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東汕頭 515041；4. 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，烏魯木齊 830052)

?

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)甜菜霜霉病菌

張娜1，乾義柯2，魏霜3，張維1，焦子偉1，張祥林4

(1. 伊犁師范學(xué)院生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧 835000；2. 伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆伊寧 835000；3. 汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東汕頭 515041；4. 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，烏魯木齊 830052)

【目的】建立用于快速檢測(cè)甜菜霜霉病菌Peronosporafarinosaf. sp.beteaByford的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法?！痉椒ā扛鶕?jù)已報(bào)道的P.farinosaf. sp.BeteaByford及近似種 28S rDNA序列同源性比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)用于檢測(cè)甜菜霜霉病菌的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物。利用所建立的方法對(duì)包括P.farinosaf. sp.Betea在內(nèi)的6種甜菜上的病原菌和5種其他霜霉病菌基因組DNA及12份甜菜種子樣品進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的檢測(cè)特異性、靈敏度及實(shí)用性?！窘Y(jié)果】所建立的檢測(cè)方法僅對(duì)甜菜霜霉病菌得到陽(yáng)性擴(kuò)增，其它參照菌株及陰性對(duì)照均無(wú)熒光信號(hào)擴(kuò)增，準(zhǔn)確排除了甜菜上其他5種病菌的干擾，其檢測(cè)靈敏度顯示最低限量為100 fg病菌DNA，應(yīng)用該方法對(duì)不同來(lái)源的12份甜菜種子樣品進(jìn)行檢測(cè)，田間監(jiān)測(cè)結(jié)果一致?！窘Y(jié)論】所建立的熒光檢測(cè)方法能夠?qū)μ鸩怂共【M(jìn)行快速篩查，為甜菜霜霉病菌的早期診斷和防控提供了一種技術(shù)手段。

甜菜霜霉病菌；實(shí)時(shí)熒光PCR；檢測(cè)

0 引 言

【研究意義】甜菜霜霉病菌Peronosporafarinosa(Fr.)Fr. f. sp.beteaByford是我國(guó)重要的植物檢疫性病原菌，對(duì)甜菜生產(chǎn)的危害極大，其病原菌屬鞭毛菌亞門(mén)，霜霉目，霜霉屬，粉霜霉，異名P.schachtiiFucke。主要侵染甜菜地上部幼嫩器官，多為害心葉，感病葉片初為淺綠色后為黃色至褐色的不規(guī)則形病斑。在潮濕條件下，病斑背面長(zhǎng)有灰紫色的霉層，為病原菌從氣孔中伸出的菌絲、孢囊梗和孢囊孢子。糖用甜菜是僅次于甘蔗的重要糖料作物，我國(guó)最大的甜菜糖產(chǎn)區(qū)在新疆，年產(chǎn)糖50×104t左右[1]。近幾年新疆甜菜制種基地減少，甜菜霜霉病隨環(huán)境氣候小面積零星發(fā)生，但我國(guó)每年從德國(guó)、法國(guó)、比利時(shí)等國(guó)進(jìn)口大量甜菜種子，可能攜帶的檢疫性有害生物嚴(yán)重威脅我國(guó)甜菜產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)安全，高效快速檢測(cè)是預(yù)防甜菜霜霉病傳入及擴(kuò)散的技術(shù)關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】該病害在以色列、前蘇聯(lián)、肯尼亞、摩洛哥、加拿大、美國(guó)、阿根廷、澳大利亞、新西蘭等國(guó)家均有分布。1997年甜菜霜霉病菌列入我國(guó)檢疫性有害生物目錄，據(jù)國(guó)內(nèi)學(xué)者調(diào)查報(bào)道，該病害發(fā)生區(qū)為西南三省葉用甜菜和新疆伊犁地區(qū)糖用甜菜，20世紀(jì)90年代新疆糖用甜菜霜霉病引起學(xué)者廣泛關(guān)注，并對(duì)其病原形態(tài)特征、危害狀、發(fā)病流行規(guī)律及檢疫防治措施進(jìn)行了研究和報(bào)道[2-5]。甜菜霜霉病菌為專(zhuān)性寄生菌，很難進(jìn)行常規(guī)的分離培養(yǎng)，有關(guān)PCR檢測(cè)方面的報(bào)道較少，但PCR檢測(cè)技術(shù)在霜霉目病原菌的檢測(cè)方面已廣泛應(yīng)用。R. loos等[6]基于Plasmoparahalstedii28S rDNA設(shè)計(jì)了特異性檢測(cè)引物，能夠從向日葵種子中特異檢出向日葵霜霉病菌，其靈敏度達(dá)到3 pg。秦文韜等[7]基于Plasmoparaviticola細(xì)胞色素C氧化酶亞型2基因序列設(shè)計(jì)特異檢測(cè)引物，可以檢測(cè)出3.3 pg/μL的葡萄霜霉病菌DNA。劉艷等[8]基于P.manshurica的ITS區(qū)設(shè)計(jì)特異檢測(cè)引物，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.1 pg/μL大豆霜霉病菌DNA。Feng C.等[9]基于ITS區(qū)間設(shè)計(jì)了引物和Taqman熒光探針，成功從菠菜種子中檢出菠菜霜霉病菌(P.farinosaf.sp. Spinacia oleracea)。以上研究為建立P.farinosasp.beteaByford的快速檢疫和防控技術(shù)措施奠定了基礎(chǔ)。【本研究切入點(diǎn)】SYBR Green是一種小分子 DNA染料，游離時(shí)不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，但當(dāng)與雙鏈DNA特異地結(jié)合時(shí)，熒光染料摻入 DNA 雙鏈，發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，同時(shí) PCR產(chǎn)物的特異性可以用熔解曲線(xiàn)分析進(jìn)一步確認(rèn)，利用SYBR Green這一特性建立的實(shí)時(shí)熒光PCR在植物病原菌檢測(cè)方面已廣泛應(yīng)用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究利用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，對(duì)甜菜上的霜霉病菌進(jìn)行快速篩查，獲得一種靈敏、簡(jiǎn)便及快速的檢測(cè)方法，為進(jìn)出口種子檢驗(yàn)檢疫、病害防治預(yù)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試病原菌

伊犁地區(qū)甜菜上采集的6種甜菜病原菌，其他5種霜霉病及健康甜菜葉片。表1

表1 供試病原菌及寄主
Table 1 The selected pathogen and host

編號(hào)NO．病原菌Pathogen寄主Host來(lái)源Source1甜菜霜霉病菌Peronosporafarinosef．sp．beteaByford甜菜Betavulgaris實(shí)驗(yàn)室保存2甜菜蛇眼病菌Pleosporabetae(Bert)Ncvodovsky甜菜Betavulgaris實(shí)驗(yàn)室保存3甜菜褐斑病菌CercosporabeticolaSacc．甜菜Betavulgaris實(shí)驗(yàn)室保存4甜菜白粉病菌Erysiphebetae(Vanha)Weltziem．甜菜Betavulgaris實(shí)驗(yàn)室保存5甜菜莖點(diǎn)霉根腐病菌PleosporabjoerlingiiByford甜菜Betavulgaris實(shí)驗(yàn)室保存6甜菜黑斑病菌Alternariatenuis甜菜Betavulgaris伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院7向日葵霜霉病菌Plasmoparahalstedii向日葵Helianthusannuus伊犁檢驗(yàn)檢疫局8十字花科霜霉病菌Peronsporaparasitica蘿卜Daucuscarota實(shí)驗(yàn)室保存9辣椒霜霉病菌Peronosporacapsici辣椒CapsicumannuumL．實(shí)驗(yàn)室保存10葡萄霜霉病菌Plasmoparaviticola葡萄Vitisvinifera實(shí)驗(yàn)室保存11大豆霜霉病菌Peronosporamanshurica大豆Glycinemax伊犁檢驗(yàn)檢疫局

1.1.2 試劑

植物基因組提取試劑盒(TIANGEN BIOTECH公司，DP305-02)；SuperReal PreMix( SYBR Green)(TIANGEN BIOTECH公司，F(xiàn)P204)。

1.1.3 供試引物

根據(jù)GenBank中P.farinosasp.beteaByford及其近似種的28S rDNA基因序列比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)檢測(cè)引物PmDF(5'-TCTTGGTGGACTAGTCGTCG-3')/PmDR(5'-GAACGGCAACAAGTTAGAGTCTAC-3')。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.4 主要儀器

LightCycle Roche 480熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；ND-1000微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Therme公司)；AIIegra 25R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

P.farinosasp.beteaByford、Erysiphebetae(Vanha)Weltziem及其他5種霜霉病菌，參照Feng C.等[9]報(bào)道的方法提取DNA，研究中略有改動(dòng)：用滅菌去離子水清洗感病葉片組織，將病菌孢子及菌絲洗下，再5 000 r/min離心10 min富集病原菌，后參照試劑盒操作(天根生物科技有限公司試劑盒，DP305-02)。其它菌株分離純化后挑取菌絲冷凍干燥用液氮研磨，取30 mg參照試劑盒提取DNA。 種子帶菌DNA提取參照喬志文等[10]報(bào)道的方法，研究略有改動(dòng)：取甜菜種子50 g，加蒸餾水100 mL，200 r/min振蕩4 h，用雙層滅菌紗布過(guò)濾入滅菌試管中，5 000 r/min離心10 min富集病原菌，后參照試劑盒操作。表1

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及程序

反應(yīng)體系為25.0 μL：12.5 μL 2×SuperReal PreMix、10 μM PmDF/PmDR引物各1.0 μL、1.0 μL 模板DNA、RNase-free ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性15 min；然后以95℃ 10 s，60℃ 30 s(熒光信號(hào)收集)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)

按1.2.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及程序，對(duì)11個(gè)供試菌株DNA進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，同時(shí)用健康甜菜植株DNA做陰性對(duì)照，對(duì)所建立的熒光PCR檢測(cè)體系的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.4 熒光PCR靈敏度檢測(cè)

用核酸濃度測(cè)定儀ND-1000測(cè)定提取的甜菜霜霉病菌DNA濃度，標(biāo)定至10.0 ng/μL，再按10倍梯度稀釋為1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103和1.0×102fg/μL，每個(gè)梯度重復(fù)3次，分別取1.0 μL DNA做模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，并做空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測(cè)

11個(gè)供試菌株熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，僅供試菌株甜菜霜霉病菌出現(xiàn)熒光信號(hào)增加，表現(xiàn)為陽(yáng)性擴(kuò)增，而甜菜上的其他5種病菌都沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)的增加，5種其他霜霉病菌也沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)的增加，陰性對(duì)照甜菜健康植株DNA也沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)增加，結(jié)果表現(xiàn)為陰性。研究所建立的檢測(cè)方法可以將P.farinosasp.beteaByford與甜菜上其他5種病原菌進(jìn)行區(qū)分。圖1

2.2 靈敏度檢測(cè)

對(duì)梯度稀釋的甜菜霜霉病菌DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度檢測(cè)，結(jié)果表明，當(dāng)甜菜霜霉病菌DNA濃度稀釋到1.0×102fg/μL時(shí)，取1.0 μL DNA做模板仍可以檢測(cè)到熒光信號(hào)的增加，CT值在30～35，表現(xiàn)為陽(yáng)性擴(kuò)增，而空白對(duì)照沒(méi)有熒光信號(hào)增加。說(shuō)明研究建立的實(shí)時(shí)熒光 PCR 的方法至少可檢測(cè)到甜菜霜霉病菌DNA 為100 fg。圖2

1：甜菜霜霉病菌；2～11：甜菜蛇眼病菌、甜菜褐斑病菌、甜菜白粉病菌、甜菜莖點(diǎn)霉根腐病菌、甜菜黑斑病菌、向日葵霜霉病菌、蘿卜霜霉病菌、辣椒霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、大豆霜霉病菌；12：陰性對(duì)照

1：P.farinosef. sp. betea Byford；2-11：Pleosporabetae(Bert) Ncvodovsky，CercosporabeticolaSacc.，Erysiphebetae(Vanha)Weltziem，PleosporabjoerlingiiByford，Alternariatenuis，Plasmoparahalstedii，P.parasitica，P.capsici，Plasmoparaviticola，P.manshurica；12：Negative control

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性檢測(cè)
Fig.1 The detection specificity of real-time PCR

1～3：DNA濃度1.0×106fg/μL；4～6：1.0×105fg/μL；7～9：1.0×104fg/μL；10～12：1.0×103fg/μL；13～15：1.0×102fg/μL；16：空白對(duì)照

1-3：The concentration of DNA 1.0×106fg/μL；4-6：1.0×105fg/μL；7-9：1.0×104fg/μL；10-12：1.0×103fg/μL；13-15：1.0×102fg/μL；16：Blank control

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)靈敏度
Fig.2 The detection sensitivity of real-time PCR

2.3 樣品DNA的檢測(cè)

按照1.2.1中種子帶菌DNA提取方法，對(duì)伊犁地區(qū)田間采集的3份甜菜種子和進(jìn)口的9份甜菜種子進(jìn)行DNA提取，取1.0 μL作模板做實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為樣品12-8和13-6出現(xiàn)熒光信號(hào)的增加，CT值均小于25，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；其它樣品及陰性對(duì)照沒(méi)有熒光信號(hào)增加，檢測(cè)結(jié)果判為陰性。熒光PCR檢測(cè)結(jié)果與田間實(shí)際監(jiān)測(cè)及形態(tài)鑒定結(jié)果一致，田間調(diào)查及形態(tài)鑒定方法參照嚴(yán)進(jìn)[4]，乾義柯等[11]報(bào)道。表2

表2 甜菜種子樣品中P. farinosa sp. betea Byford檢測(cè)
Table 2 The detection of P. farinosa sp. betea Byford in beet seeds

序號(hào)No．樣品編號(hào)Samplenumber樣品來(lái)源Samplesource年份Years熒光PCR檢測(cè)結(jié)果(CT值)TestresultsofPCR(CTvalue)田間監(jiān)測(cè)結(jié)果TheresultsofFieldmonitoring111-8新疆伊犁2011--212-8新疆伊犁2012226+313-6新疆伊犁2013205+4BETA218德國(guó)2014--5BETA064德國(guó)2014--6KWS2409德國(guó)2014--7KWS0143德國(guó)2014--8ST13092德國(guó)2014--9ADV0401比利時(shí)2014--10HI0466法國(guó)2014--11HI0135法國(guó)2014--12HI0099法國(guó)2014--

注：“-”為陰性；“+”為陽(yáng)性

Note：“-”negative；“+”positive

3 討 論

準(zhǔn)確定義植物病原菌的分類(lèi)是對(duì)其檢疫和防控的先決條件，只有準(zhǔn)確定義病原菌的分類(lèi)才能進(jìn)一步評(píng)估其對(duì)作物的潛在威脅。乾義柯等[11]對(duì)新疆伊犁地區(qū)甜菜霜霉病菌28S rDNA序列進(jìn)行測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析，從分子水平確認(rèn)其為粉霜霉(P.farinose)。國(guó)外在P.farinosa的系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)上做較為廣泛的研究，2007年Choi Y J等[12]對(duì)亞洲、歐洲、大洋洲等17個(gè)國(guó)家的58份P.farinosaf.sp. Spinacia oleracea進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，研究結(jié)構(gòu)證明P.farinosaf.sp. Spinacia oleracea形成一個(gè)明顯的單群系，認(rèn)為菠菜霜霉病菌應(yīng)該恢復(fù)以Peronosporaeffusa命名。2015年Choi Y J等[13]利用多基因系統(tǒng)發(fā)育和物種樹(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)分析，證明甜菜和菠菜不同于其它藜科的霜霉病寄主，P.farinosasp.beteaByford是濱藜上一個(gè)獨(dú)立的物種，且很明顯只發(fā)生在甜菜上，甜菜霜霉(P.farinosasp.beteaByford)和菠菜霜霉(P.farinosaf.sp. Spinacia oleracea)應(yīng)分別做為一個(gè)獨(dú)立物種。Testen A L等[14]利用PCR及測(cè)序技術(shù)對(duì)南美洲藜麥上霜霉病病原菌P.farinosaf.sp. Chenopodum quinoa進(jìn)行了檢測(cè)，進(jìn)一步證明了P.farinosaf.sp. Chenopodum quinoa的地理多樣性和宿主特異性[15-16]?；谝陨涎芯?，幾種P.farinosa在寄主專(zhuān)化型上的明顯差異，研究建立的方法主要針對(duì)甜菜上的P.farinosasp. betea Byford的檢測(cè)，對(duì)P.farinosasp.beteaByford的檢測(cè)特異性驗(yàn)證主要以區(qū)分甜菜上5種真菌病害為主，同時(shí)在引物設(shè)計(jì)上兼顧寄主專(zhuān)化型基因間的差異，但還需收集更多霜霉病菌對(duì)其特異性進(jìn)行廣泛驗(yàn)證。

專(zhuān)性寄生菌不能像疫霉、炭疽病菌那樣可以獲得純培養(yǎng)，所以研究對(duì)感病葉片采用洗滌后離心富集方法提取DNA進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，靈敏度試驗(yàn)表明所建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR方法可以檢測(cè)出102fg/μL水平的基因組DNA，與Feng C.等[9]報(bào)道的利用熒光探針?lè)▽?duì)P.farinosaf.sp. Spinacia oleracea檢測(cè)靈敏度為 100 fg/μL DNA值一致。對(duì)種子帶菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，也采用洗滌后離心富集方法提取DNA，且實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與田間實(shí)際監(jiān)測(cè)結(jié)果一致，表明該檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的適用性。

4 結(jié) 論

研究根據(jù)P.farinosa28S rDNA基因序列設(shè)計(jì)合成引物，建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR方法可以區(qū)分甜菜上P.farinosasp.beteaByford與其它5種真菌病害，該方法檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到102fg/μL水平的病原菌基因組DNA值。利用洗滌后離心富集方法提取DNA，可以對(duì)甜菜種子中霜霉病菌進(jìn)行檢測(cè)，具有一定的適用性，在甜菜霜霉病菌的快速篩查、早期診斷和防控上具有一定的實(shí)踐意義。

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Fund project:Supported by science and technology research projects of Yili Teachers'University (2013YSYB13) and national public welfare industry (quality control) research project (201310091)

Detection of Peronospora farinosa sp. betea Byford by Real-time PCR

ZHANG Na1, QIAN Yi-ke2, WEI Shuang3, ZHANG Wei1, JIAO Zi-wei1, ZHANG Xiang-lin4

(1. College of Biology and Geography, Yili Normal University, Yining Xinjiang 835000, China;2.YiliEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,YiningXinjiang835000,China;3.ShantouEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,ShantouGuangdong515041,China;4.XinjiangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Urumqi830052,China)

【Objective】 The objective of this study is to develop a SYBR GreenⅠreal-time PCR for the detection ofPeronosporafarinosaf. sp.beteaByford rapidly.【Method】The real-time PCR primers were designed based on the reported 28S rDNA gene sequences ofP.farinosasp.beteaByford and similar species. Totally 6 pathogens of beet and other 5 pathogens and 12 samples of beet seeds were screened to test the specificity and sensitivity and applicability in this assay.【Result】The SYBR GreenⅠreal-time PCR assay could detect positive amplification fromP.farinosaf. sp.beteaByford only, negative results from other pathogens and negative control, and more than 100 fg genomic DNA ofP.farinosasp.beteaByford could be detected. The 12 samples of beet seeds from different sources were detected by this assay, suggesting that the results were consistent with the field monitoring results.【Conclusion】This assay can detectP.farinosasp.beteaByford rapidly, and offer a technology to early diagnosis and controlP.farinosasp.beteaByford.

Peronosporafarinosasp.beteaByford；Real-Time PCR；detection

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.11.015

2016-04-13

伊犁師范學(xué)院科研項(xiàng)目(2013YSYB13)；國(guó)家公益性行業(yè)(質(zhì)檢)科研項(xiàng)目(201310091)

張娜(1983-)，女，山西翼城人，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)，(E-mail)yucixue@163.com

張祥林(1964-)，男，新疆烏魯木齊人，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参餀z疫，(E-mail)xl6479@163.com

S432.1

A

1001-4330(2016)11-2077-06