加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)防治2型糖尿病大鼠心肌損害的影響

陳青揚(yáng)，黃惠勇*，劉卜菡，曾光，潘繼興

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷，湖南長(zhǎng)沙410208）

·方藥研究·

加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)防治2型糖尿病大鼠心肌損害的影響

陳青揚(yáng)，黃惠勇*，劉卜菡，曾光，潘繼興

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的觀察加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)2型糖尿病大鼠模型血糖及心肌組織結(jié)構(gòu)的影響，初步探討加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)糖尿病心肌纖維化和肥大的防治作用。方法40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組7只，實(shí)驗(yàn)組33只，通過(guò)高糖高脂飼料+小劑量STZ構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型。將成模后的實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)心丹（BXD）組和羅格列酮（RSG）組各11只，BXD組以濃縮后加味生脈補(bǔ)心丹湯劑灌胃；RSG組按照羅格列酮鈉溶液灌胃。給藥8周后測(cè)各組大鼠空腹血糖，并處死取材，光鏡觀察心肌組織變化，Masson染色觀察纖維沉積情況，免疫組化法觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和沉默信息調(diào)節(jié)因子3（Sirt3）蛋白的表達(dá)。結(jié)果成模時(shí)各實(shí)驗(yàn)組空腹血糖（FPG）均較空白組升高（P＜0.05），造模成功。治療完成時(shí)，RSG組、BXD組FPG均較模型組下降（P＜0.05），RSG組FPG較BXD組更低（P＜0.05）。模型組心肌組織破壞嚴(yán)重，膠原纖維含量增多，RSG組和BXD組心肌組織破壞程度較輕，膠原纖維含量較少。模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原和Sirt3的表達(dá)明顯高于其他組（P＜0.05）。BXD組Ⅲ型膠原的表達(dá)明顯高于空白組（P＜0.05）。RSG組Sirt3的表達(dá)顯著高于BXD組（P＜0.05）。結(jié)論加味生脈補(bǔ)心丹能夠明顯降低2型糖尿病大鼠的血糖，并能夠明顯減輕心肌纖維化、肥大的程度，延緩糖尿病所致心肌病的進(jìn)程。

加味生脈補(bǔ)心丹；2型糖尿?。虎裥湍z原蛋白；Ⅲ型膠原蛋白；沉默信息調(diào)節(jié)因子3；心肌損害；太子參；黃芪

2型糖尿病是一種以胰島素抵抗為主的有多種并發(fā)癥的代謝性疾病，其中糖尿病心肌病是其主要并發(fā)癥之一，臨床表現(xiàn)以左室舒張（或）收縮功能障礙為主。心肌纖維化是糖尿病心肌病的重要特征性病理改變，隨著病情的進(jìn)展會(huì)導(dǎo)致心功能減退、心臟擴(kuò)大和各種心律失常。研究認(rèn)為，膠原纖維的大量沉積是糖尿病心肌病心肌纖維化的重要致病因素[1]。膠原纖維在心肌細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積將增加心室壁的僵硬度，減低心室的順應(yīng)性從而導(dǎo)致心室的收縮與舒張功能不全。沉默信息調(diào)節(jié)因子3（Sirt3）能夠保護(hù)心肌細(xì)胞減少由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷，從而延緩心肌肥厚導(dǎo)致的心功能惡化的進(jìn)程[2-3]。本文通過(guò)建立2型糖尿病大鼠模型，觀察大鼠心肌組織的病理改變、Masson染色改變以及Ⅰ、Ⅲ型膠原與Sirt3蛋白表達(dá)水平的改變，探討加味生脈補(bǔ)心丹在早期治療2型糖尿病的同時(shí)，對(duì)心肌組織的保護(hù)作用和預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物健康雄性SPF級(jí)SD大鼠，5周齡，40只，體質(zhì)量（150±20）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCKX（湘）2011-0003。

1.1.2 飼料配方普通飼料：由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。供給空白組。高糖高脂飼料配方如下：蔗糖15%，膽固醇4%，膽酸鈉0.3%，豬油10%，蛋黃粉10%，基礎(chǔ)膳食60.7%，混合、攪拌均勻，加水適量，塑形，烤箱烘干，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工。供給除空白組外的其他組。

1.1.3 藥物加味生脈補(bǔ)心丹：方劑來(lái)源于《內(nèi)外傷辨惑論》卷中方和《攝生秘剖》卷一方加減：太子參10 g，丹參15 g，生地黃15 g，天花粉12 g，黃芪20 g，茯苓8 g，炙甘草6 g。飲片均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，加水煎煮2次，合并煎液，分別離心過(guò)濾，濃縮至含生藥2 g/mL，滅菌后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。羅格列酮鈉片，規(guī)格4 mg/片，太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠(chǎng)有限公司。取羅格列酮研碎成粉末，溶于雙蒸水中。

1.1.4 主要試劑二步法試劑盒（中山金橋有限公司），DAB試劑盒（中山金橋有限公司），CollagenⅠ一抗（CST公司，貨號(hào)：14695-AP），CollagenⅢ一抗（Proteintech公司，貨號(hào)：135548-1-AP），Sirt3一抗（Abcam公司，貨號(hào)：10099-1-AP）。

1.2 方法

1.2.1 造模根據(jù)國(guó)內(nèi)外常用2型糖尿病大鼠制備方法，即高糖高脂飼料+小劑量STZ誘導(dǎo)法改良的高糖高脂飼料+小劑量STZ體質(zhì)量聯(lián)合體表面積法構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型[4]。將40只SD大鼠隨機(jī)分為7只空白組，33只實(shí)驗(yàn)組，空白組給予普通飼料，實(shí)驗(yàn)組予以高糖高脂飼料。所有大鼠均飼養(yǎng)于在自由飲食、分籠飼養(yǎng)，自由飲水飲食，溫度（20± 3）℃、背景噪音為（40±10）db、光/暗周期為12 h/ 12 h的條件下。喂養(yǎng)4周后，從第5周開(kāi)始實(shí)驗(yàn)組以mg/（kg+m2）法計(jì)算出的劑量腹腔注射STZ：體質(zhì)量≤200 g的部分：按25 mg/kg計(jì)算STZ量；體質(zhì)量＞200 g部分：按162.45 mg/m2[體表面積=大鼠體型系數(shù)（0.09）×體質(zhì)量2/3]計(jì)算，二者相加即為1次STZ的注射劑量。間隔2 d后，再予以同樣的方法注射STZ?？瞻捉M則給予2次腹腔注射等容積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。最后一次注射STZ后的第6 d，禁食12 h尾端測(cè)空腹血糖，以2次空腹血糖＞11.1 mmol/L為2型糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 分組將造模成功的33只實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為：模型對(duì)照組（簡(jiǎn)稱(chēng)模型組）11只，羅格列酮鈉組（簡(jiǎn)稱(chēng)RSG組）11只，加味生脈補(bǔ)心丹組（簡(jiǎn)稱(chēng)BXD組）11只。

1.2.3 動(dòng)物給藥造模成功后第2天，BXD組以濃縮后加味生脈補(bǔ)心丹湯劑10 mL/（kg·d）灌胃，相當(dāng)于20 g/（kg·d）生藥；RSG組按照羅格列酮鈉溶液10 mL/（kg·d）予以灌胃?？瞻捉M和模型組每天以相同體積的生理鹽水灌胃。每天灌胃給藥1次，時(shí)間為9：00～11：00 a.m，持續(xù)給藥8周。

1.3 標(biāo)本收集與指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 外觀表征實(shí)驗(yàn)期間觀察并記錄造模中各組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、尿量、毛發(fā)情況、活動(dòng)及精神狀態(tài)、墊料、大便等一般指標(biāo)。

1.3.2 空腹血糖檢測(cè)最后一次注射STZ后的第6 d，各組大鼠禁食12 h后，在非麻醉情況下剪尾取血測(cè)空腹血糖值，觀察藥物對(duì)大鼠空腹血糖的影響。

因此，電磁編碼器電路的輸出信號(hào)和碼盤(pán)的旋轉(zhuǎn)是緊密相連的。通過(guò)測(cè)定輸出信號(hào)的周期數(shù)或周期時(shí)間就可知道磁鼓的位置和旋轉(zhuǎn)速度。電磁旋轉(zhuǎn)編碼器結(jié)構(gòu)示意如圖4所示。

1.3.3 心肌組織光鏡觀察各組大鼠，隔夜禁食12 h后稱(chēng)重，分別進(jìn)行斷尾釆血，即時(shí)測(cè)定空腹血

糖并予以記錄。隨后各組大鼠被腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）以麻醉。麻醉成功后，快速打開(kāi)胸腔切除心臟，去除包膜，剪取心肌組織置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，經(jīng)過(guò)脫水、包埋，制成切片，分別進(jìn)行HE和Masson染色處理。封片后于光鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變及膠原沉積情況。

1.3.4 檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ與Sirt3的表達(dá)將心肌組織切片通過(guò)免疫組化法分別作Ⅰ、Ⅲ型膠原以及Sirt3染色。經(jīng)Image-Pro Plus圖像分析軟件隨機(jī)取3個(gè)視野分析光密度，判定1、3型膠原蛋白和Sirt3的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般生存狀況

注射STZ后，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠活動(dòng)明顯減少，日平均消耗飼料量、飲水量、尿量增加，墊料氣味甜膩，毛發(fā)發(fā)黃、易脫落，精神萎靡，尾部潮濕。隨治療的進(jìn)行，RSG組和BXD組大鼠一般狀況逐漸改善。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，因灌胃損傷、炎癥等因素，模型組死亡1只，RSG組死亡1只。最后各組大鼠數(shù)目為：空白組7只，模型組10只，RSG組10只，BXD組11只。

2.2 大鼠空腹血糖變化情況

各組大鼠FPG檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)前各組大鼠血糖正常，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。成模時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組FPG均升高（P＜0.05），達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療完成時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組均較空白組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RSG組、BXD組均較模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RSG組FPG較BXD組更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明羅格列酮和加味生脈補(bǔ)心丹均具有較好的降糖效果，其中加味生脈補(bǔ)心丹降糖效果略遜于羅格列酮。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 心肌組織病理學(xué)改變與膠原沉積情況

大鼠心肌HE染色切片顯示，空白組心肌細(xì)胞排列整齊、核染色清晰。模型組心肌細(xì)胞肥大變性，排列紊亂，雖無(wú)明顯壞死灶，但部分細(xì)胞染色加深，橫紋消失，纖維腫脹。BXD組和RSG組心肌細(xì)胞亦不緊密，稍紊亂，核染色基本清晰，部分細(xì)胞染色不均勻，纖維腫脹，與模型組相比程度較輕。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 各組各時(shí)期空腹血糖的比較（±s，mmol/L）

表1 各組各時(shí)期空腹血糖的比較（±s，mmol/L）

注：與空白組比較*P＜0.05，與模型組比較#P＜0.05，與BXD組比較△P＜0.05。

組別空白組模型組BXD組RSG組n 7 1 0 10 11 F P實(shí)驗(yàn)前3.87±0.33 3.90±2.78 3.76±0.21 3.29±023 0.254 0.858成模時(shí)4.08±056 16.61±2.05* 17.68±2.53* 16.85±2.73* 49.349 0.00治療完成時(shí)3.86±0.39 11.61±0.85* 7.15±0.69*#5.24±1.15*#△77.824 0.00

圖1 各組大鼠心肌組織光鏡觀察圖（HE染色，×400）

Masson染色切片結(jié)果顯示，空白組膠原纖維網(wǎng)規(guī)則，膠原纖維含量少。模型組細(xì)胞間質(zhì)纖維變粗、增加，圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)斷裂、排列紊亂，間質(zhì)纖維化明顯。BXD組和RSG組膠原組織排列較模型組規(guī)整，亦有不同程度纖維化，與模型組相比較輕。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織光鏡觀察圖（Masson染色，×400）

2.4 Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和Sirt3蛋白平均光密度結(jié)果

Ⅰ型膠原模型組明顯高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RSG組、空白組、BXD組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Ⅲ型膠原模型組與其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RSG組與BXD組、空白組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Sirt3模型組與其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？瞻捉M與RSG組、BXD組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。RSG組與BXD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心?、?、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量（±s，g）

表2 各組大鼠心?、?、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量（±s，g）

注：與空白組比較*P＜0.05，與模型組比較#P＜0.05，與BXD組比較△P＜0.05。

組別空白組模型組BXD組RSG組n 7 1 0 10 11 F P / /Ⅰ型膠原0.0074±0.0043 0.0611±0.0047* 0.0112±0.0032#0.0125±0.0033#4.229 0.013Ⅲ型膠原0.0088±0.0017 0.0300±0.0054* 0.0142±0.0038#0.0137±0.0037#11.511 0.00 Sirt3 0.0125±0.0033 0.0236±0.0049* 0.0101±0.0027#0.0165±0.0030#△5.501 0.04

3 討論

糖尿病在中醫(yī)學(xué)屬消渴病，最早記載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，是一種以多飲、多食、多尿、身體消瘦為主要臨床癥狀的慢性病。防治或延緩并發(fā)癥的發(fā)生是糖尿病的主要治療目標(biāo)之一，與中醫(yī)“治未病”的理念相契合。加味生脈補(bǔ)心丹，由《內(nèi)外傷辨惑論》卷中方生脈散和《攝生秘剖》卷一方補(bǔ)心丹兩方化裁而來(lái)，是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院應(yīng)用十余年的經(jīng)驗(yàn)方[5]。本方心腎同治，陰陽(yáng)兼顧，共奏滋陰清熱、補(bǔ)脾益氣、活血化瘀、升清降糖之功效。將此方應(yīng)用于早期2型糖尿病及其心血管并發(fā)癥的防治也是中醫(yī)“治未病”思想的體現(xiàn)[6]。

本研究旨在探索加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)2型糖尿病及其并發(fā)的早期心肌纖維化的影響。2型糖尿病的發(fā)病原因十分復(fù)雜，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)與腹腔注射STZ復(fù)合因素造?？梢暂^好地模擬其病理機(jī)制。大劑量STZ可引起胰島細(xì)胞的廣泛破壞而造成1型糖尿病，而小劑量STZ破壞一部分胰島細(xì)胞的功能，配合高糖高脂飲食喂養(yǎng)下的依賴(lài)高胰島素水平狀態(tài)，造成外周組織對(duì)胰島素不敏感，從而引起糖尿病[7]。此方法與2型糖尿病發(fā)病機(jī)制相似，且接近人類(lèi)2型糖尿病的生理和病理特點(diǎn)[8]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)糖尿病多飲、多食等癥狀均能起緩解作用，且有一定降糖效果，但不如羅格列酮。從光鏡下的HE、MASSON染色切片中可見(jiàn)本方對(duì)心肌有明顯的保護(hù)作用，纖維化程度明顯得到緩解。由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)結(jié)果可知本方與羅格列酮均有的防心肌纖維化作用。其中羅格列酮主要是通過(guò)控制血糖來(lái)實(shí)現(xiàn)，而本方的降糖作用不如前者，卻有著與其相當(dāng)?shù)淖o(hù)心作用，有理由認(rèn)為本方還有其他途徑達(dá)到這一效果。有研究認(rèn)為心肌細(xì)胞肥大、運(yùn)動(dòng)與壓力的超負(fù)荷可造成Sirt3表達(dá)的代償性增高[9-10]。根據(jù)Sirt3蛋白表達(dá)結(jié)果，我們可以推測(cè)本方還可以通過(guò)改善心肌代謝達(dá)到護(hù)心、防纖維化的作用。

綜上所述，加味生脈補(bǔ)心丹對(duì)2型糖尿病大鼠有良好的降糖、護(hù)心作用。有可能是在降糖與改善心肌代謝的協(xié)同作用下實(shí)現(xiàn)延緩心肌纖維化效果。本實(shí)驗(yàn)明確了加味生脈補(bǔ)心丹的療效，并為后續(xù)研究其作用機(jī)制開(kāi)拓了思路。

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（本文編輯楊瑛）

Therapeutic Effect of Modified Shengmai Buxin Pills on the Myocardial Damage in Type 2 Diabetes Rats

CHEN Qingyang,HUANG Huiyong*,LIU Bohan,ZENG Guang,PAN Jixing
(Institute of TCM Diagnosis,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To observe the effect of modified Shengmai Buxin pills on the FPG and myocardial structure in type 2 diabetes rats，and preliminary investigate the therapeutic effect on myocardial fibrosis and hypertrophy.Methods 40 SD ratswererandomlydistributedintotheblankgroupwith7ratsandexperimentalgroupwith33rats.Thetype 2 diabetes models were established by feeding the animals with high-fat and high-sucrose diet.The establisged model rats in experimental group were randomly divided into the model group，Buxindan group（BXD）and rosiglitazone group（RSG）group，11 rats in each group.The BXD group was given concentrated modified Shengmai Buxindan decoction by gavage and the RSG group was with rosiglitazone sodium.After 8 weeks，F(xiàn)PG of rats was measured and excuted for heart sample.The changes of myocardial tissue were observed.The fibrous deposition was observed by masson method.The expression of collagen I/III and silent information regulator-3（Sirt3）was determined by immunohistochemical method.Results The FPG of experimentalgroupwashigherthannormalgroup（P＜0.05）.TheFPGofRSGgroupandBXDgroupwashigher than model group（P＜0.05）.The FPG of RSG group was lower than BXD group（P＜0.05）.The myocardial structure of model group was severely damaged and collagen fiber content increased obviously.The damage of the myocardial structure was slighter and the content of collagen was lower in RSG group and BXD group.Compared with the model group，the expression level of collagen I/III and SIRT3 were decreased significantly（P＜0.05）in the other groups.Compared with the normal group，the expression level of collagen III was increased significantly（P＜0.05）in the BXD group.The expression level of Sirt3 in RSG group was increased significantly than the RSG group（P＜0.05）.Conclusion The modified Shengmai Buxin pillscansignificantlydecreasethelevelofbloodsugarintype2diabetesrats.Itcanalleviatethedegree of myocardial fibrosis and hypertrophy，and delay the progression of diabetic cardiomyopathy.

modified Shengmai Buxin pills；type 2 diabetes；collagen I；collagen III；silent information regulator-3；myocardial damage；Radix Pseudostellariae；Astragalus membranaceus

R285.5；R587.1

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.03.002

2015-12-17

國(guó)家自然科學(xué)基金（81373551）；教育部博士點(diǎn)博士導(dǎo)師基金（2013432311001）；湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（S2014S2032）；中醫(yī)診斷國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放基金（2013ZYZD04，2013ZYZD27，2014ZYZD05，2014ZYZD28）

陳青揚(yáng)，男，在讀碩士研究生，研究方向：心血管疾病的中醫(yī)辨治。

黃惠勇，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：tony27000@aliyun.com。