小鼠異種皮膚移植模型的建立及對(duì)免疫抑制藥物的藥效評(píng)價(jià)

蔡春曉，馬春梅，孟立正，田華潔，黃曉星，劉 莉，梅其炳

(1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院藥理評(píng)價(jià)研究中心，上海 200040；2. 上海市生物物質(zhì)成藥性評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200437；3. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200437)

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◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

小鼠異種皮膚移植模型的建立及對(duì)免疫抑制藥物的藥效評(píng)價(jià)

蔡春曉1，2，3，馬春梅1，2，3，孟立正1，2，3，田華潔1，2，3，黃曉星1，2，3，劉 莉1，2，3，梅其炳1，2，3

(1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院藥理評(píng)價(jià)研究中心，上海 200040；2. 上海市生物物質(zhì)成藥性評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200437；3. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200437)

目的 建立小鼠異種皮膚移植模型，以期為免疫抑制藥物提供研究模型。方法 將C57BL/6小鼠耳部皮膚移植到BALB/c小鼠背部，同時(shí)設(shè)立同種移植對(duì)照(BALB/c小鼠耳部皮膚移植到BALB/c小鼠背部)。選用環(huán)孢素A作為抑制異種移植引起的免疫排斥反應(yīng)的免疫抑制劑，利用該模型評(píng)價(jià)環(huán)孢素A免疫抑制效果。在移植和給藥后，對(duì)移植排斥評(píng)分和移植皮膚的存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。移植手術(shù)4 d和9 d后，ELISA法對(duì)血清中IL-4、IL-12 和 IFN-γ的水平進(jìn)行測(cè)定。12 d后，計(jì)算胸腺和脾臟系數(shù)，對(duì)脾臟T細(xì)胞中CD4+和CD8+的比例進(jìn)行分析，同時(shí)將移植皮膚進(jìn)行病理觀察。結(jié)果 皮膚移植后，排斥評(píng)分逐漸增加，移植皮膚的存活率逐漸下降，有明顯的水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥反應(yīng)。環(huán)孢素A可明顯降低移植排斥評(píng)分，提高移植皮膚的存活率，使小鼠胸腺和脾臟系數(shù)明顯降低，高劑量可明顯降低脾臟T細(xì)胞中CD4+和CD8+細(xì)胞的比例。同時(shí)，環(huán)孢素A處理可明顯降低移植皮膚的炎癥反應(yīng)。結(jié)論 小鼠經(jīng)異種皮膚移植后會(huì)出現(xiàn)急性移植排斥反應(yīng)，環(huán)孢素A可有效抑制移植排斥反應(yīng)，并呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

異種皮膚移植；同種皮膚移植；環(huán)孢素A；免疫抑制劑；移植排斥評(píng)分；移植皮膚存活率

器官移植引起的排斥反應(yīng)可分為3個(gè)階段，即移植物抗原使宿主致敏的感應(yīng)階段、宿主T細(xì)胞被激活的增殖分化階段和移植物被宿主免疫系統(tǒng)攻擊、破壞的效應(yīng)階段。整個(gè)移植免疫應(yīng)答過程是一個(gè)T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)[1-2]，其中心環(huán)節(jié)在于T細(xì)胞的活化、增殖。針對(duì)器官移植引起的排斥反應(yīng)，臨床上通常會(huì)采用免疫抑制劑來進(jìn)行抗排異治療[3-4]。環(huán)孢素A (cyclosporine A，CsA) 是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫抑制劑之一，它可以有效地降低移植患者術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。環(huán)孢素A的免疫抑制效應(yīng)主要是通過對(duì)移植免疫應(yīng)答中T細(xì)胞激活過程的抑制來實(shí)現(xiàn)，同時(shí)對(duì)效應(yīng)階段和體液免疫也有一定作用。

目前，皮膚移植模型大多采用背部皮膚移植和尾部皮膚移植[5-6]。背部皮膚移植和尾部皮膚移植對(duì)于供體皮膚取材的手術(shù)要求較高，不同動(dòng)物之間所取皮膚的均一性較差，且容易感染。本實(shí)驗(yàn)采用耳部皮膚移植到小鼠背部的方法建立皮膚移植模型，具有操作簡(jiǎn)單快捷、不同動(dòng)物間均一性好、不易感染、移植皮膚生長(zhǎng)狀態(tài)好、易存活等優(yōu)點(diǎn)，并選用環(huán)孢素A作為陽性對(duì)照藥，以移植排斥評(píng)分、移植皮膚存活率、動(dòng)物體重變化、皮膚移植小鼠血清中IL-4、 IFN-γ、IL-12的含量、胸腺和脾臟系數(shù)、脾臟T細(xì)胞中CD4+和CD8+細(xì)胞比例以及移植皮膚的病理等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)耳-背皮膚移植模型的特點(diǎn)進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)環(huán)孢素A的藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c小鼠55只(♀小鼠25只，♂小鼠30只，其中5只♂小鼠作為同種皮膚移植手術(shù)的供體小鼠)，SPF級(jí)C57BL/6♂小鼠20只，體質(zhì)量18～20 g， 購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016 。

1.1.2 藥品與試劑 環(huán)孢素A注射液購(gòu)自諾華制藥有限公司(批號(hào)：S0060A)。小鼠IL-4 、IFN-γ和IL-12 ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)分別為：0119C0410、0727B0421、0709C0437)?？剐∈驝D4抗體和CD8抗體購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司(批號(hào)分別為3248572、553030)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠皮膚移植模型的建立 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉后，用體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇對(duì)供體小鼠的耳朵和受體小鼠的背部皮膚進(jìn)行消毒。將供體小鼠的耳朵從根部取下，置于冰冷的無菌PBS中備用。將受體小鼠背部一側(cè)皮膚的表皮剪下(直徑約1 cm)，將供體小鼠的耳朵內(nèi)外側(cè)皮膚分離，取內(nèi)側(cè)皮膚，分離面朝下，貼到受體小鼠背部創(chuàng)口處，用剪刀將未完全吻合的皮膚進(jìn)行剔除修理，接著用無菌創(chuàng)口貼包扎，再用絲線將創(chuàng)口貼縫合固定。4 d后，將創(chuàng)口貼輕輕剪下，暴露移植部位，對(duì)移植排斥反應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在本實(shí)驗(yàn)中，異種皮膚移植(allograft)將C57BL/6小鼠皮膚移植到BALB/c小鼠身上，同種皮膚移植(isograft)將BALB/c小鼠皮膚移植到BALB/c小鼠身上。將BALB/c小鼠分為5組，每組10只，♀♂各半，其中4組小鼠接受異種皮膚移植，1組小鼠接受同種皮膚移植。

1.2.2 藥物配制及給藥 移植當(dāng)天計(jì)為d 0，開始給藥，每天1次，直至d 12，將環(huán)孢素A注射液根據(jù)給藥劑量用生理鹽水進(jìn)行稀釋。環(huán)孢素A高劑量組給藥量為40 mg·kg-1，中劑量為20 mg·kg-1，低劑量為10 mg·kg-1。給藥方式采用尾靜脈注射，空白對(duì)照組注射生理鹽水。

1.2.3 移植排斥評(píng)分(graft rejection score)和移植皮膚存活率(graft survival rate)的計(jì)算

1.2.3.1 移植排斥評(píng)分 根據(jù)文獻(xiàn)[8]，將移植后皮膚的排斥反應(yīng)分為0～5級(jí)，對(duì)應(yīng)移植排斥評(píng)分0～5分(Fig 1、Tab 1)。

Fig 1 Scores to characterize mouse skin graft rejection

A:Score 0;B:Score 1;C:Score 2;D:Score 3;E:Score 4;F:Score 5

Tab 1 Scores to characterize mouse skin graft rejection

Rejection is described as percentage of total graft area. Any artificial lesion, e.g. by the suture or suture material, or any trauma is excluded from evaluation.

1.2.3.2 移植皮膚存活率 當(dāng)皮膚移植排斥級(jí)別達(dá)到5級(jí)時(shí)，我們定義為移植的皮膚死亡，并根據(jù)出現(xiàn)5級(jí)排斥的動(dòng)物數(shù)量，計(jì)算移植皮膚存活率。移植皮膚存活率/%=(每組總動(dòng)物數(shù)-排斥評(píng)分5級(jí)動(dòng)物數(shù))/ 每組總動(dòng)物數(shù)×100%。

1.2.4 血清中IL-4、 IL-12和IFN-γ含量的測(cè)定 小鼠眼內(nèi)眥采血，離心取血清，分裝后凍存于-80℃冰箱。測(cè)定前，融化后按照ELISA試劑盒的說明書對(duì)血清中的IL-4、IL-12和IFN-γ的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 CD4+和CD8+細(xì)胞比例分析

1.2.5.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞分離 迅速脫頸椎處死小鼠，用體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇浸泡消毒(2～3 min)。在超凈工作臺(tái)中，無菌操作打開腹腔，取出脾臟，除去其周圍的脂肪組織，并用Hank’s試劑淋洗1～2次，轉(zhuǎn)入放有Hank′s試劑的無菌玻璃培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿冰浴)。將脾臟置于200目篩網(wǎng)上用剪刀剪碎后，倒入Hank′s試劑沖洗，得到脾臟細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液離心10 min(1 000 r·min-1)，棄上清，再加入2 mL 裂紅液(ACK lysis buffer)裂解紅細(xì)胞3～5 min，加入5 mL RPMI 1640培養(yǎng)液(或者Hank′s試劑)離心10 min(1 000 r·min-1)，沉淀用Hank′s試劑沖洗2次，再用含體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞至所需濃度。

1.2.5.2 CD4+和CD8+細(xì)胞計(jì)數(shù) 將脾淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整為5×109·L-1，取每個(gè)待測(cè)樣品100 μL，向待測(cè)樣品中分別加入2.5 μL CD4抗體、1 μL CD8抗體、2.5 μL CD3抗體，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(不加任何抗體)、CD3對(duì)照(只加CD3抗體)、CD4對(duì)照(只加CD4抗體)、CD8對(duì)照(只加CD8抗體)，各對(duì)照組需加入一定體積的培養(yǎng)基來保證樣品總體積的一致?；靹蚝?，室溫下避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀對(duì)CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 臟器系數(shù)計(jì)算 小鼠處死后，解剖，取胸腺和脾臟稱重，利用公式：臟器系數(shù)=臟器重量(g)/體質(zhì)量(100 g)，計(jì)算臟器系數(shù)。

1.2.7 病理組織學(xué)檢查 將移植皮膚取下，用體積分?jǐn)?shù)為0.04的甲醛固定，石蠟包埋、切片、HE染色后進(jìn)行病理切片觀察。參考文獻(xiàn)[8]，與皮膚移植排斥評(píng)分方法一致，將移植皮膚壞死情況進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，評(píng)分方法見Tab 2 。

Tab 2 Pathological scores of necrosis and inflammation for evaluation of mouse skin graft rejection

2 結(jié)果

2.1 移植排斥評(píng)分 由Fig 2可以看出，同種皮膚移植小鼠未出現(xiàn)明顯的移植排斥反應(yīng)，手術(shù)后d 12受體小鼠皮膚生長(zhǎng)良好，說明移植手術(shù)成功，其他實(shí)驗(yàn)操作對(duì)移植皮膚的生長(zhǎng)未見明顯影響。空白對(duì)照組小鼠d 6開始觀察到移植排斥反應(yīng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，移植排斥反應(yīng)評(píng)分逐漸增高，在d 12，移植排斥評(píng)分基本達(dá)到5分。環(huán)孢素A可抑制移植排斥反應(yīng)，與空白對(duì)照組相比，40 mg·kg-1環(huán)孢素A能有效地抑制移植排斥反應(yīng)，20 mg·kg-1環(huán)孢素A能一定程度地降低移植排斥反應(yīng)，10 mg·kg-1環(huán)孢素A對(duì)移植排斥有一定的抑制作用，但抑制作用不明顯。

Fig 2 Dose-response and time-course of effect of cyclosporine A on graft rejection ±s, n=10)

**P<0.01vssaline group

2.2 移植皮膚存活率 由Fig 3所示，同種移植組小鼠皮膚100%存活，說明移植手術(shù)成功，各種實(shí)驗(yàn)操作對(duì)皮膚移植存活率無明顯影響。異種移植小鼠，d 8開始出現(xiàn)移植皮膚死亡現(xiàn)象，至d 12，異種移植空白對(duì)照組小鼠的皮膚全部死亡。給予環(huán)孢素A進(jìn)行治療，每天1次，連續(xù)給藥至d 12。結(jié)果表明，40 mg·kg-1環(huán)孢素A能明顯減少小鼠皮膚移植引起的排斥反應(yīng)，使移植皮膚的存活率達(dá)到100%，20 mg·kg-1環(huán)孢素A能使移植皮膚存活率達(dá)到83.35%，而10 mg·kg-1的環(huán)孢素A能一定程度地抑制因排斥引起的移植皮膚死亡，12 d后移植皮膚存活率為25%。 皮膚存活率是評(píng)價(jià)免疫抑制劑在皮膚移植手術(shù)中抗排斥反應(yīng)有效性的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量環(huán)孢素A免疫抑制作用能達(dá)到100%，中劑量環(huán)孢素A對(duì)移植排斥的抑制效果為83.35%，而低劑量環(huán)孢素A雖然能起到一定的免疫抑制作用，但可能并不能達(dá)到臨床所需的治療效果。

Fig 3 Dose-response and time-course of effect of cyclosporine A on graft skin survival ±s,n=10)

**P<0.01vssaline group

2.3 動(dòng)物體重 由Fig 4可以看出，低、中、高劑量的環(huán)孢素A連續(xù)尾靜脈給藥對(duì)♀♂小鼠的生長(zhǎng)均存在抑制作用，且存在一定劑量依賴性，其中40 mg·kg-1環(huán)孢素A對(duì)小鼠生長(zhǎng)的抑制作用最為明顯。

2.4 血清中IL-4、 IL-12和IFN-γ含量 IL-4屬于抗炎因子，在器官移植手術(shù)中，IL-4的血清水平不應(yīng)該有明顯的變化。在本實(shí)驗(yàn)中，取手術(shù)(給藥)后d 4和d 9的受體小鼠血清，用ELISA試劑盒測(cè)定血清中IL-4的含量。結(jié)果見Fig 5A，和同種移植組相比，空白對(duì)照組小鼠血清中的IL-4均未見明顯增加。同樣，和空白對(duì)照組相比，環(huán)孢素A各劑量組小鼠血清中的IL-4含量也未出現(xiàn)明顯的變化。

手術(shù)(給藥)后d 4，和同種移植小鼠血清中IL-12水平相比，空白對(duì)照組小鼠血清中的IL-12含量明顯增加(P<0.01)；10 mg·kg-1的環(huán)孢素A在給藥后d 4未能明顯降低血清中IL-12的含量，20、40 mg·kg-1的環(huán)孢素A在給藥后d 4均能明顯降低血清中IL-12的含量。在手術(shù)(給藥)后d 9,與同種移植組相比，空白對(duì)照組小鼠血清中的IL-12明顯增加(P<0.01)，10 mg·kg-1的環(huán)孢素A未能明顯降低血清中IL-12的含量，而20 mg·kg-1和40 mg·kg-1的環(huán)孢素A在d 9均明顯降低了血清中IL-12的含量(P<0.01)，且劑量依賴性良好(Fig 5B)。

Fig 4 Effects of different doses of cyclosporine A on body weight of male mice (A) and female mice ±s,n=5)

**P<0.01vssaline group

手術(shù)(給藥)后d 4，和同種移植組相比，空白對(duì)照組小鼠血清中的IFN-γ明顯增加(P<0.01)，環(huán)孢素A在低、中、高給藥劑量下均能明顯降低皮膚移植受體小鼠血清中IFN-γ的含量(P<0.01)，且呈現(xiàn)出很好的劑量依賴性。在手術(shù)(給藥)后d 9，和同種移植組相比，空白對(duì)照組小鼠血清中IFN-γ水平明顯增加(P<0.01)。低、中、高劑量的環(huán)孢素A在d 9均能明顯降低小鼠血清中IFN-γ的含量，且存在很好的劑量依賴性(Fig 5C)。

2.5 CD4+和CD8+細(xì)胞比例 手術(shù)(給藥)后d 12，取脾細(xì)胞進(jìn)行CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)，與同種移植組小鼠CD4+細(xì)胞百分比相比，異種移植組小鼠未見明顯變化，給藥后3個(gè)劑量組的CD4+細(xì)胞比例也無明顯差別(Fig 6A)。對(duì)于CD8+細(xì)胞，在手術(shù)(給藥)后d 12，與同種移植組小鼠相比，空白對(duì)照組小鼠脾臟CD8+細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05)。40 mg·kg-1環(huán)孢素A組小鼠脾臟CD8+細(xì)胞比例較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，10、20 mg·kg-1環(huán)孢素A劑量組小鼠脾臟CD8+細(xì)胞出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但差異無顯著性(Fig 6B)。

2.6 胸腺、脾臟系數(shù) 手術(shù)(給藥)后d 12，和同種皮膚移植組小鼠相比，空白對(duì)照組小鼠胸腺系數(shù)無明顯增加。隨著環(huán)孢素A劑量的增加，小鼠胸腺系數(shù)逐漸減小，并呈現(xiàn)劑量依賴性，但和空白對(duì)照組相比差異均無顯著性(Fig 7A)。和同種皮膚移植組小鼠相比，空白對(duì)照組小鼠脾臟系數(shù)有一定程度的增加，但差異無顯著性。隨著環(huán)孢素A劑量的增加，小鼠脾臟系數(shù)逐漸減小，并呈現(xiàn)劑量依賴性，但和空白對(duì)照組相比，差異均無顯著性(Fig 7B)。

2.7 移植皮膚病理 手術(shù)(給藥)后d 12，將移植皮膚取下，石蠟包埋切片，HE染色后，進(jìn)行病理學(xué)觀察，并進(jìn)行皮膚壞死程度評(píng)分。如Fig 8所示，空白對(duì)照組和10 mg·kg-1環(huán)孢素A給藥組移植皮膚組織表皮下見一細(xì)長(zhǎng)伊紅色條狀異物與表皮平行排列分布，異物中間充滿大量大小不一的圓形空白結(jié)構(gòu)。異物上方皮下結(jié)締組織中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為淋巴細(xì)胞和部分中性粒細(xì)胞，組織水腫疏松，上方表皮層鱗狀細(xì)胞基本壞死(>95%)，部分脫落形成表皮潰瘍。異物下方有較多炎癥細(xì)胞沿異物呈帶狀集聚，局部有灶性炎癥細(xì)胞壞死，形成微小膿腫，中央壞死使組織分離呈小空腔。在下方深部皮下脂肪結(jié)締組織及肌層有較大量炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)。20 mg·kg-1環(huán)孢素A給藥組移植皮膚組織也存在長(zhǎng)條狀異物，異物上下兩側(cè)皮下組織有部分淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織結(jié)構(gòu)疏松。兩端表皮鱗狀細(xì)胞層尚保存，中間局部上皮也存在壞死脫落潰瘍(>50%)，但相對(duì)于空白對(duì)照組和低劑量環(huán)孢素A給藥組，脫落潰瘍程度較輕。40 mg·kg-1環(huán)孢素A給藥組和同種皮膚移植組移植皮膚組織皮下長(zhǎng)條狀異物不明顯，異物上下兩側(cè)皮下組織有輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或者無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織結(jié)構(gòu)較緊密，表皮鱗狀細(xì)胞層完整保存。 對(duì)皮膚壞死程度進(jìn)行病理評(píng)分，如Fig 9所示，同種移植組和40 mg·kg-1環(huán)孢素A給藥組移植皮膚病理評(píng)分較低，移植皮膚無明顯壞死，與空白對(duì)照組相比，差異存在顯著性。

The isolated splenic cells with low concentration(less than 5×109·L-1) were excluded from the analysis.*P<0.05vssaline group;#P<0.05vsisograft group.

Fig 7 Effects of different doses of cyclosporine A on thymus index (A) and spleen index ±s,n=10)

Fig 8 Effects of cyclosporine A on pathology of graft skin(×100)

A:Saline;B:10 mg·kg-1CsA; C:20 mg·kg-1CsA; D:40 mg·kg-1CsA; E:Isograft

Fig 9 Effects of cyclosporine A on pathological scores

**P<0.01vssaline group

3 討論

器官移植是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療的重要手段之一，臨床常見的移植器官有腎、肝、心、角膜移植、胰腺與胰島、甲狀旁腺、骨髓等[9-10]。免疫抑制劑在臨床上廣泛應(yīng)用，極大地推動(dòng)了器官移植的實(shí)施并提高了移植物的存活率，改善了患者的生存質(zhì)量，同時(shí)也為許多自身免疫性疾病的治療開辟了廣闊的應(yīng)用前景[11]。然而，目前免疫抑制劑在應(yīng)用過程中仍然存在毒副作用廣泛且強(qiáng)烈，治療對(duì)象和方案較局限的缺點(diǎn)。器官移植治療對(duì)免疫抑制劑在防治急、慢性排斥反應(yīng)、減少毒副作用方面提出了更高要求，因此，尋求高效低毒的藥物是研究新型免疫抑制劑的目標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)采用耳部皮膚移植到小鼠背部的方法建立了皮膚移植模型，并利用該模型對(duì)環(huán)孢素A的免疫抑制作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本模型中的皮膚移植手術(shù)操作簡(jiǎn)單快捷，大大減少了對(duì)動(dòng)物的損傷，同時(shí)降低了感染的風(fēng)險(xiǎn)。同種移植皮膚100%存活且移植皮膚生長(zhǎng)良好，幾乎無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)陽性對(duì)照藥環(huán)孢素A的藥效學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果表明，該模型可有效地體現(xiàn)環(huán)孢素A的免疫抑制作用，40 mg·kg-1的環(huán)孢素A可有效抑制免疫排斥反應(yīng)，該劑量和環(huán)孢素A臨床試驗(yàn)劑量相當(dāng)，免疫抑制結(jié)果和臨床結(jié)果吻合。同時(shí)，在本模型中，環(huán)孢素A明顯抑制動(dòng)物體重的增長(zhǎng)，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，對(duì)脾臟和胸腺也存在抑制作用，說明本模型不僅能有效地反映環(huán)孢素A的免疫抑制藥效，也充分地暴露了環(huán)孢素A的副作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)中建立的小鼠皮膚移植模型具有操作簡(jiǎn)單，手術(shù)成功率高，實(shí)驗(yàn)均一性好的優(yōu)點(diǎn)，在有效反映免疫抑制劑藥效的同時(shí)又可充分暴露藥物的副作用，不失為免疫抑制劑篩選和評(píng)價(jià)的可靠模型。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)是在中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院藥理評(píng)價(jià)研究中心完成。在此，向所有幫助過我的人表示最衷心的感謝！)

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Establishment of an allogenetic skin transplant model in mice for evaluating immunosuppressive drugs

CAI Chun-xiao1,2,3, MA Chun-mei1,2,3, MENG Li-zheng1,2,3,TIAN Hua-jie1,2,3, HUANG Xiao-xing1,2,3, LIU Li1,2,3, MEI Qi-bing1,2,3

(1.CenterforPharmacologicalEvaluationandResearch,ChinaStateInstituteofPharmaceuticalIndustry,Shanghai200040,China;2.ShanghaiProfessionalandTechnicalServiceCenterforBiologicalMaterialDruggabilityEvaluation,Shanghai200437,China;3.StateKeyLaboratoryofNewDrugandPharmaceuticalProcess,ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry,Shanghai200437,China)

Aim To establish an allogenetic mouse skin transplant model,in order to provide a research model for immunosuppressive drugs.Methods Skins from the ears of C57BL/6 mice were transplanted to the back of BALB/c mice and skin isografts(BALB/c mice to BALB/c mice) were used as control.Cyclosporin A(CsA) was used as a model compound to test the immnosuppresive effect on allogenetic graft rejection.Following the transplation and CsA treatment, the graft rejection score and graft skin survival rate were quantified.Four and nine days after transplantation,serum IL-4,IL-12 and IFN-γ levels were measured using ELISA kits.Twelve days after transplantation, mice were sacrificed.The weight of spleen and thymus was obtained, and CD4+and CD8+population of spleenic T cells were analyzed using flow cytometer.Histological features were assessed by hematoxylin-eosin(HE) staining of formalin-fixed, paraffin-embedded graft skins.Results After transplantion, the graft rejection score increased and graft skin survival rate decreased graduallly. Serum IL-12 and IFN-γ levels of allograft mice increased markedly. Compared with those of isograft mice, mice with skin allograft displayed a significant increase in the percentage of the CD8+T cell subpopulation. Remarkable inflammation, such as edema, inflammatory cell infiltration were observed in allograft mice. Compared with saline treated mice, CsA significantly reduced the graft rejection score and improved survival rate of skin grafts. And also, CsA treated mice had smaller spleen and thymus. Mice that received high doses of CsA had significantly less CD8+T cells than those treated with saline. Moreover, allograft skins in mice that received CsA had less inflammation.Conclusions Allogenetic mouse skin transplantation exhibits acute graft rejection. CsA can inhibit the rejection in a dose dependent manner.

allogenetic skin transplantation；isogenetic skin transplantation；cyclosporin A；immunosuppressive drugs；graft rejection score；graft skin survival rate

2016-08-17，

2016-09-13

上海市生物物質(zhì)成藥性評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(No 15DZ2291700)

蔡春曉(1991-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥理學(xué),E-mail: caichunxiao217@sina.com；

劉 莉(1967-)，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥調(diào)節(jié)免疫及中藥預(yù)防治療消化系統(tǒng)疾病，通訊作者，E-mail: liuli1129@hotmail.com；

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.050.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.025

A

1001-1978(2016)11-1613-07

R-332；R392.12；R622.1；R979.5

梅其炳(1953-)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: qbmei@fmmu.edu.cn