柚皮苷對(duì)高糖引起血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用與CX3CL1及抗氧化有關(guān)

許玉榮,盛 璇,郭晶晶,姜懷德,梁尚棟，李桂林

(南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

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柚皮苷對(duì)高糖引起血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用與CX3CL1及抗氧化有關(guān)

許玉榮,盛 璇,郭晶晶,姜懷德,梁尚棟，李桂林

(南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

糖尿?。昏制ぼ?；CX3CL1；HUVEC；NO；ROS

糖尿病已成為一種具有嚴(yán)重危害的流行病，它是心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一。無論在發(fā)達(dá)國(guó)家或是發(fā)展中國(guó)家，糖尿病都是導(dǎo)致人口死亡率增加的原因之一[1]。糖尿病最主要危害在于其并發(fā)癥，其中糖尿病血管并發(fā)癥包括主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈等病變，這類是以動(dòng)脈粥樣硬化為主要特征的大血管病變，還有一類是視網(wǎng)膜病變、腎臟病變等微血管病變。血管內(nèi)皮細(xì)胞是人體各種主要器官的保護(hù)屏障，糖尿病情況下，內(nèi)皮細(xì)胞損傷會(huì)導(dǎo)致一些特定的細(xì)胞因子生產(chǎn)過剩，從而引起炎癥樣癥狀[2]。前期的基因芯片結(jié)果顯示慢性高糖會(huì)導(dǎo)致人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)趨化因子CX3CL1 (fractalkine)明顯升高[3]。CX3CL1是趨化因子CX3C家族唯一的成員，具有趨化作用和黏附分子的性質(zhì)。大血管內(nèi)皮細(xì)胞CX3CL1上調(diào)會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞附著力的增加。CX3CL1在血管炎性病癥如動(dòng)脈損傷、動(dòng)脈粥樣硬化和新內(nèi)膜形成的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[4]。Fractalkine還可以激活血管活性氧簇，使NO生物利用度降低而誘導(dǎo)血管功能異常，這表明CX3CL1可能與血管功能異?；蛐难芗膊∮嘘P(guān)[5]。了解引起內(nèi)皮炎癥的分子機(jī)制，將有助于防止糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損而最終導(dǎo)致的器官損傷。柚皮苷(naringin,Nar)是從柚子和相關(guān)柑桔類提取出來的黃酮苷，具有抗氧化、清除自由基以及抗細(xì)胞凋亡的活性，對(duì)2型糖尿病有抗炎、降血糖的作用[6-7]。在1型糖尿病大鼠模型中，柚皮苷通過其抗氧化作用調(diào)節(jié)p38和PKC-β蛋白的表達(dá)，使心肌纖維化得以改善，這對(duì)于延緩糖尿病心肌纖維化的進(jìn)展來說是有益的[8]。本文主要研究柚皮苷對(duì)血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用是否與其降低CX3CL1的表達(dá)和抗氧化作用有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 HUVEC購自ATCC公司(美國(guó));RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號(hào)SH30809，含有11.1 mmol·L-1葡萄糖) 和胎牛血清購自Hyclone公司(南非)；柚皮苷(標(biāo)準(zhǔn)品) 購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；CX3CL1抗體購自Abcam公司 (貨號(hào)ab25088)；CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) 購自Promega 公司(美國(guó))；ROS檢測(cè)試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所；β-actin抗體(sc-47778) 購自Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-HRP購自北京華美生物工程公司；引物由Invitrogen公司合成；用于RNA提取的TRIzol Reagent購自CW BIO公司；RevertAid First Strand cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；購自SinoBio公司的2×Taq Master Mix(E005)。

1.2 HUVEC的培養(yǎng) HUVEC培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和2%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%左右時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用無菌的PBS清洗3次，加入胰蛋白酶消化1～2 min，顯微鏡下觀察，等細(xì)胞之間的連接不再緊密，加入2～3 mL完全培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管，1 500 r·min-1離心5 min，棄去上清，加入1 mL培養(yǎng)基吹打，根據(jù)需求按不同比例進(jìn)行傳代，所用細(xì)胞控制在30代以內(nèi)。

1.3 MTS法確定高糖、柚皮苷濃度 HUVEC按每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板內(nèi)，柚皮苷濃度設(shè)置為0、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1共6組，每組各做3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)基中含有11.1 mmol·L-1的葡萄糖，以此為對(duì)照組，高糖濃度設(shè)置為22.2、33.3、44.4 mmol·L-1，共4組，每組各做3個(gè)復(fù)孔。5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)12 h后，按分組加入不同濃度的柚皮苷或葡萄糖，培養(yǎng)5 d后換成無血清培養(yǎng)液，每孔加入10%的MTS，培養(yǎng)2～4 h后，將培養(yǎng)板置于多功能酶標(biāo)儀內(nèi)，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD) 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 NO的測(cè)定 每組細(xì)胞各設(shè)3組復(fù)孔，使用24孔板，種板12 h后，加入葡萄糖或柚皮苷處理5 d，用硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞上清液中NO的含量，具體操作過程嚴(yán)格按照NO試劑盒檢測(cè)說明書進(jìn)行。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS的測(cè)定 細(xì)胞接種于24孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，種板12 h后加入葡萄糖或柚皮苷，試劑盒中熒光探針DCFH-DA用無血清培養(yǎng)液按1 ∶1 000的比例釋稀為10 μmol·L-1，培養(yǎng)5 d后，換成1 mL已稀釋的DCFH-DA培養(yǎng)液培養(yǎng)20 min，每隔3～5 min振蕩1次，用無血清培養(yǎng)液洗去未進(jìn)入細(xì)胞的熒光探針，洗滌重復(fù)3次，加入200 μL胰酶消化細(xì)胞，終止消化后，吹打成細(xì)胞懸液，使用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm條件下測(cè)定各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.6 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CX3CL1 mRNA的表達(dá) 各組細(xì)胞處理5 d后，采用TRIzol RNA提取法提取各組細(xì)胞總RNA，再按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳跑膠，Bio-Rad瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析光密度值。引物序列如下：β-actin (400 bp)：上游：5′- TTTTTTGGCTTGACTCAGGAT-3′, 下游：5′-GGGAGACCAAAAGCCTTCAT-3′；CX3CL1 (119 bp)：上游： 5′-CCTTGGTTAGGCATTGTGGG-3′，下游：5′-TTGGTGGCTTGATGGTGGAA-3′。

1.7 Western blot檢測(cè)CX3CL1蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)5 d后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗3次，10 mmol·L-1的PMSF加入到RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗 (兔多克隆抗體) CX3CL1(1 ∶800) 室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min，羊抗兔IgG-HRP二抗反應(yīng)液(1 ∶2 000) 室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，放入成像系統(tǒng)(Bio-Rad),加入化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影。IPP軟件分析光密度值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力確定柚皮苷和葡萄糖濃度 用不同濃度的柚皮苷處理HUVEC 5 d后，MTS作用2 h檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示柚皮苷濃度在0～50 μmol·L-1之間時(shí)對(duì)細(xì)胞活力并無明顯影響；但柚皮苷濃度在100～200 μmol·L-1時(shí)明顯減弱了細(xì)胞活力(P<0.01)，故選取柚皮苷濃度為50 μmol·L-1用于后續(xù)研究 (Fig 1)。HUVEC用不同濃度的葡萄糖處理5 d，結(jié)果顯示，22.2 mmol·L-1葡萄糖與對(duì)照組(11.1 mmol·L-1)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。之后，隨著糖濃度增加對(duì)細(xì)胞活力的影響越來越大，故選擇44.4 mmol·L-1用于后續(xù)研究 (Fig 2)。

2.2 柚皮苷對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的影響 細(xì)胞處理5 d后，硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度，結(jié)果顯示高糖組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量較對(duì)照組明顯減少(P<0.01)；與高糖組相比，高糖加柚皮苷組隨著柚皮苷濃度增加，NO含量逐漸增加，高糖加50 μmol·L-1柚皮苷組與高糖組比較，NO含量增加更明顯(P<0.01)；不同濃度柚皮苷組與對(duì)照組相比無明顯差異(P>0.05, Fig 3)。

Fig 1 Effect of different concentrations of naringin on cell viability in HUVEC

**P<0.01vscontrol group (0 μmol·L-1naringin)

Fig 2 Effect of high glucose on cell viability in HUVEC

Fig 3 Effect of naringin on nitric oxide (NO)content in high glucose-injured HUVEC

A: Control; B: Nar 12.5 μmol·L-1; C: Nar 25 μmol·L-1; D: Nar 50 μmol·L-1; E: HG; F: HG+Nar 12.5 μmol·L-1; G: HG+Nar 25 μmol·L-1; H: HG+Nar 50 μmol·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group

2.3 柚皮苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 DCFH-DA探針本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。結(jié)果顯示高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS含量較對(duì)照組明顯增加(P<0.01)；與高糖組相比，高糖加柚皮苷組隨著柚皮苷濃度增加，細(xì)胞內(nèi)ROS含量逐漸降低，高糖加50 μmol·L-1柚皮苷組ROS含量減少最明顯(P<0.01)；不同濃度柚皮苷組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05, Fig 4)。

Fig 4 Effect of naringin on intercellular ROS in high glucose-injured HUVEC

A: Control; B: Nar 12.5 μmol·L-1; C: Nar 25 μmol·L-1; D: Nar 50 μmol·L-1; E: HG; F: HG+Nar 12.5 μmol·L-1; G: HG+Nar 25 μmol·L-1; H: HG+Nar 50 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group

2.4 柚皮苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)CX3CL1 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，高糖組HUVEC中CX3CL1 mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加(P<0.01)，高糖加不同濃度柚皮苷處理后CX3CL1 mRNA的表達(dá)量隨柚皮苷濃度的增加而降低 (P<0.01)；對(duì)照組HUVEC中CX3CL1 mRNA的表達(dá)量與不同濃度柚皮苷組之間無明顯變化(P>0.05, Fig 5)。

2.5 柚皮苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)CX3CL1蛋白表達(dá)的影響 CX3CL1蛋白印跡結(jié)果經(jīng)各組相應(yīng)β-actin標(biāo)化后顯示，高糖組的CX3CL1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加(P<0.01)，高糖加柚皮苷組CX3CL1蛋白表達(dá)量較高糖組明顯下調(diào)(P<0.01)，對(duì)照組與柚皮苷組、高糖加柚皮苷組之間差異無顯著性(P>0.05, Fig 6)。

3 討論

糖尿病引起的心血管病變累及身體各臟器，并導(dǎo)致各種并發(fā)癥。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是糖尿病微血管和大血管病變的初始原因。因此，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞防止高血糖損傷可作為糖尿病血管并發(fā)癥的治療靶點(diǎn)[9]。慢性高血糖癥是血管內(nèi)皮的激活源，正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞具有合成并釋放血管活性物質(zhì)的功能，長(zhǎng)期高濃度葡萄糖會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，引起血管擴(kuò)張因子和血管收縮因子釋放的不平衡。一氧化氮(NO)是血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的最主要、最有效的內(nèi)皮源性舒張因子。除此之外，NO還可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[10]。正常條件下，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與修復(fù)過程達(dá)到平衡。而高糖條件下，內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放NO減少，導(dǎo)致血管收縮，血流速度減慢，易導(dǎo)致血栓形成并增加白細(xì)胞黏附。此外，糖尿病高血糖癥，影響內(nèi)皮細(xì)胞多種代謝途徑，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞死亡和抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，從而破壞內(nèi)皮細(xì)胞損傷和修復(fù)之間的平衡，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高糖明顯減少細(xì)胞上清液中NO的含量，同時(shí)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，說明高糖已造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

Fig 5 Effect of naringin on expression of CX3CL1 mRNA in high glucose-injured HUVEC

A: Control; B: Nar 12.5 μmol·L-1; C: Nar 25 μmol·L-1; D: Nar 50 μmol·L-1; E: HG; F: HG+Nar 12.5 μmol·L-1; G: HG+Nar 25 μmol·L-1; H: HG+Nar 50 μmol·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

Fig 6 Effect of naringin on expression of CX3CL1 protein in high glucose-injured HUVEC

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group

柚皮苷是從蕓香科植物柚果實(shí)中提取的一種雙氫黃酮類化合物。柚皮苷具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗突變、抗過敏、抗?jié)?、?zhèn)痛、降血壓活性，能降低血膽固醇，減少血栓的形成，改善局部微循環(huán)和營(yíng)養(yǎng)供給，抗凋亡和心血管保護(hù)作用[12]。柚皮苷能夠利用抗氧化成分清除活性氧，防止ROS積累和氧化損傷，發(fā)揮抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移或增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞再生能力、內(nèi)皮組織修復(fù)、內(nèi)皮功能恢復(fù)、減少心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)上具有重要的作用[13]。實(shí)驗(yàn)觀察到柚皮苷能明顯逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的減少，同時(shí)降低高糖時(shí)升高的ROS，表明柚皮苷可能通過影響NO和ROS的產(chǎn)生發(fā)揮保護(hù)血管的作用。

糖尿病是一種慢性低度炎癥反應(yīng)，趨化因子與糖尿病并發(fā)癥關(guān)系密切[14]。CX3CL1是一種以與膜結(jié)合形式或可溶性形式存在的趨化因子，具有跨膜結(jié)構(gòu)域和趨化因子結(jié)構(gòu)域的膜結(jié)合趨化因子。在炎癥、血管疾病條件下CX3CL1的表達(dá)增加。CX3CL1在人動(dòng)脈粥樣硬化的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)上調(diào)[15]，并促進(jìn)粥樣硬化的發(fā)展[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖組HUVEC細(xì)胞內(nèi)CX3CL1 mRNA與蛋白水平均上調(diào)，表明高濃度的葡萄糖可增加內(nèi)皮細(xì)胞CX3CL1的表達(dá)。 氧化應(yīng)激主要由氧自由基介導(dǎo)，許多刺激因素，如高血糖，可通過激活內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶的活性，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生[16]。產(chǎn)生的ROS可通過抑制磷酸化酪氨酸磷酸酶 (PTPS) 的活性，從而啟動(dòng)下游氧化還原反應(yīng)，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞活力、遷移、凋亡和血管生成過程。ROS能夠增加胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度，減少NO的生成，使血管舒張作用減弱。而鈣離子內(nèi)流消耗ATP，使ATP減少。NO和ATP共同減少導(dǎo)致血管內(nèi)皮進(jìn)一步受損[17]。在2型糖尿病(T2DM)和代謝綜合癥中，氧化應(yīng)激增加，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致胰島素抵抗、血脂異常、β細(xì)胞功能障礙、糖耐量受損，并最終導(dǎo)致2型糖尿病的有害因素。慢性氧化應(yīng)激、高血糖、高血脂異常對(duì)抗氧化能力最低同時(shí)又具有高氧化能量需求的β細(xì)胞是極度危險(xiǎn)的，可通過降低關(guān)鍵基因的表達(dá)誘導(dǎo)β細(xì)胞死亡[18]。本實(shí)驗(yàn)觀察在正常和慢性高糖狀態(tài)下，HUVEC中CX3CL1的mRNA和蛋白表達(dá)及柚皮苷對(duì)其影響，結(jié)果顯示慢性高糖可導(dǎo)致HUVEC中CX3CL1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，而柚皮苷可以明顯降低慢性高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)CX3CL1的mRNA和蛋白的表達(dá)。高糖培養(yǎng)可引起HUVEC 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量降低，而柚皮苷能明顯逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液中NO濃度降低的情況。高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS明顯升高，而柚皮苷可以明顯地降低高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS含量。因此，柚皮苷可能能夠通過下調(diào)趨化因子CX3CL1的表達(dá)、降低細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生并增加NO的釋放，從而改善糖尿病的慢性炎癥病癥，并在一定程度逆轉(zhuǎn)慢性高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷。

綜上所述，柚皮苷對(duì)慢性高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，且CX3CL1參與到這種保護(hù)作用過程中，其保護(hù)作用可能與柚皮苷的抗氧化應(yīng)激及抗炎作用有關(guān)。

(致謝：感謝實(shí)驗(yàn)過程中南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生理實(shí)驗(yàn)室老師和同學(xué)的幫助。)

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Protective effect of naringin on vascular endothelial injury induced by high glucose associated with reduced expression of CX3CL1 and antioxidant

XU Yu-rong, SHENG Xuan, GUO Jing-jing, JIANG Huai-de, LIANG Shang-dong, LI Gui-lin

(DeptofPhysiology,JiangxiMedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Aim To study the protective effect of the naringin on chemotactic factor CX3CL1 of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) induced by high glucose. Methods The effect of different concentrations of naringin on HUVEC cell viability was determined by MTS. HUVECs were divided into 4 groups: ① control group, ② high glucose group, ③ naringin group and ④ high glucose treated with naringin group. After treatment for 5 days, the concentration of nitric oxide (NO) in the culture medium was measured by nitrate reductase; intracellular reactive oxygen species (ROS) was analyzed with fluorescence probe; the expressions of CX3CL1 mRNA and protein were determined by the reverse transcription PCR (RT-PCR) and Western blot(WB). Results NO content in the culture medium of high glucose group was markedly decreased, which could be increased by naringin. Compared with the control group, intracellular ROS in the high glucose group was drastically elevated, but naringin decreased the elevated ROS induced by high glucose. The results of RT-PCR and WB showed that naringin could downregulate the increased expressions of CX3CL1 mRNA and protein induced by high glucose. Conclusion Naringin has protective effect on the injury of the HUVEC induced by high glucose, which is associated with reducing the expression of CX3CL1 and the antioxidative and anti-inflammatory action.

diabetes; naringin; CX3CL1; vascular endothelial cells; nitric oxide; reactive oxygen species

2016-07-17,

2016-08-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81560219，81570735，81200853)；江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)計(jì)劃(No 20153BCB23030)

許玉榮(1992-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)生理和藥理學(xué),E-mail：1511187481@qq.com;

李桂林(1972-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師,研究方向：神經(jīng)生理和藥理學(xué),通迅作者,Tel：0791-86360556，E-mail：li.guilin@163.com

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.048.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.024

A

1001-1978(2016)11-1608-06

R322.123；R284.1；R364.5；R543.02；R587.1摘要:目的 研究柚皮苷(naringin,Nar)對(duì)趨化因子CX3CL1參與的慢性高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷機(jī)制的保護(hù)作用。 方法 MTS法測(cè)定不同濃度的柚皮苷對(duì)正常HUVEC的活性影響，及不同葡萄糖濃度下對(duì)HUVEC的損傷程度。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Ctrl)、柚皮苷組(Nar)、高糖組(HG)和高糖加柚皮苷組(HG+Nar) 4組。細(xì)胞經(jīng)各種條件處理5 d后，硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞上清液中一氧化氮(NO)含量，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量，RT-PCR和Western blot檢測(cè)CX3CL1 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果 高糖組與正常對(duì)照組相比NO水平明顯降低，ROS含量則明顯升高，高糖處理后加入柚皮苷能增加NO的產(chǎn)生，同時(shí)降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量，柚皮苷組與對(duì)照組之間差異無顯著性。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示柚皮苷可以降低高糖組CX3CL1 mRNA和蛋白的表達(dá)，柚皮苷組與對(duì)照組相比無顯著性差異。結(jié)論 柚皮苷對(duì)趨化因子CX3CL1參與的慢性高糖引起的HUVEC損害具有保護(hù)作用，且其保護(hù)作用可能與其抗氧化應(yīng)激及抗炎作用有關(guān)。