甲基蓮心堿體外抑制人肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用機(jī)制研究

周雅君，時(shí) 菁，田 耕，周漢新，高國(guó)全

(1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510000；2. 深圳市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000)

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甲基蓮心堿體外抑制人肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用機(jī)制研究

周雅君1,2，時(shí) 菁2，田 耕2，周漢新2，高國(guó)全1

(1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510000；2. 深圳市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000)

目的 探討甲基蓮心堿(neferine，Nef)對(duì)人肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞侵襲的影響和作用機(jī)制。方法 人肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞體外培養(yǎng)，經(jīng)不同濃度的甲基蓮心堿處理后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察Nef對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響；免疫印跡檢測(cè)Rho相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 CCK-8結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，甲基蓮心堿干預(yù)組抑制人肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞增殖，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)；Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，3 μmol·L-1甲基蓮心堿明顯抑制HepG2和Bel-7402細(xì)胞的侵襲；免疫印跡結(jié)果顯示，3 μmol·L-1甲基蓮心堿作用HepG2和Bel-7402細(xì)胞12 h后，RhoA、RhoC和ROCK表達(dá)明顯降低。結(jié)論 甲基蓮心堿可體外抑制HepG2和Bel-7402細(xì)胞的增殖和侵襲，其抑制肝癌細(xì)胞的侵襲可能與抑制RhoA、RhoC和ROCK蛋白的表達(dá)有關(guān)。

甲基蓮心堿；人肝癌細(xì)胞HepG2；人肝癌細(xì)胞Bel-7402；增殖；侵襲； RhoA；RhoC；ROCK

甲基蓮心堿(neferine，Nef)是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽中提取出的一種雙芐基異喹啉類生物堿。近年來(lái)研究表明，甲基蓮心堿具有明顯的抗肝纖維化作用，亦對(duì)耐藥肝癌具化療增敏作用[1-3]，但甲基蓮心堿抗肝癌作用及其機(jī)制尚未明確。Rho(rashomologue)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種小分子G蛋白，RhoA、RhoC為Rho蛋白的亞家族成員，而Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase, ROCK)為RhoA下游蛋白[4]。研究發(fā)現(xiàn)，Rho信號(hào)通路與肝纖維化的形成、肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5-6]。本文以人肝癌細(xì)胞株HepG2和Bel-7402為研究對(duì)象，通過(guò)觀察甲基蓮心堿對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞增殖、侵襲的影響以及Rho相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討甲基蓮心堿對(duì)人肝癌細(xì)胞的作用及機(jī)制，為甲基蓮心堿的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞HepG2和Bel-7402均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑 甲基蓮心堿(批號(hào)：052M4732V)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，1 mol·L-1HCl溶解，制成1 mmol·L-1的甲基蓮心堿溶液，4℃避光保存，用時(shí)稀釋成不同濃度的工作液。高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；兔抗人RhoA、RhoC和ROCK單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)；低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf)；酶標(biāo)儀(美國(guó)ThermoFisher Scientific)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；倒置相差顯微鏡(德國(guó)Leica)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2和Bel-7402，在37℃、5% CO2飽和濕度條件下，10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2和Bel-7402，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至4×107·L-1，細(xì)胞懸液移至96孔板，每孔100 μL，預(yù)培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的甲基蓮心堿，設(shè)5個(gè)濃度梯度，分別為0、0.75、1.5、3、6 μmol·L-1，處理0、12、24 h，每孔加入10 μL CCK-8反應(yīng)液，孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各組在450 nm處吸光度值(OD 450)。取最佳用藥時(shí)間和用藥濃度繼續(xù)如下實(shí)驗(yàn)。

Tab 1 Effect of neferine on proliferation of HepG2 and Bel-7402 ±s，n=4)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.3 Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 冰上將融化后的BD Matrigel用冰的高糖DMEM稀釋4倍，混勻，往預(yù)冷的Transwell板上室加稀釋后的Matrigel，每孔50 μL，均勻鋪平，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3～4 h。消化已用無(wú)血清高糖DMEM饑餓的HepG2和Bel-7402細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×108·L-1，離心，棄上清液后，分別用100 μL 0.1% BSA培養(yǎng)液配制的甲基蓮心堿重懸細(xì)胞，加入Matrigel已成膠的Transwell上室中，下室加入600 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中孵育。24 h后取出Transwell板，移去培養(yǎng)液，PBS清洗Transwell小室，4%多聚甲醛固定，無(wú)水甲醛透化，0.1%結(jié)晶紫染色，棉簽輕輕擦拭沒(méi)有侵襲的細(xì)胞及基質(zhì)膠，干燥后，倒置顯微鏡下隨機(jī)視野觀察并拍照。

2.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Rho相關(guān)蛋白的表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，每孔106個(gè)接種于6孔板，最佳濃度的甲基蓮心堿處理12 h后，收集細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞，4℃、10 000 r·min-1離心10 min，獲得蛋白樣品。BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白變性后，30～50 ng蛋白樣品上樣，十二烷基硫酸鈉凝膠電泳2 h，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(1 ∶500)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗 (1 ∶5 000 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL曝光液發(fā)光，凝膠成像儀掃描拍照。

3 結(jié)果

3.1 甲基蓮心堿對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞增殖的影響 采用不同濃度甲基蓮心堿分別于12 h和24 h干預(yù)HepG2和Bel-7402細(xì)胞增殖，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，甲基蓮心堿干預(yù)HepG2細(xì)胞12 h時(shí)，甲基蓮心堿濃度≥ 3 μmol·L-1明顯抑制細(xì)胞的增殖；作用24 h時(shí)，其濃度≥0.75 μmol·L-1明顯抑制細(xì)胞的增殖(Fig 1A、Tab 1)。甲基蓮心堿干預(yù)Bel-7402細(xì)胞12 h時(shí)，其濃度≥1.5 μmol·L-1明顯抑制細(xì)胞的增殖；作用24 h時(shí)，其濃度≥0.75 μmol·L-1明顯抑制細(xì)胞的增殖(Fig 1B、Tab 1)。采用甲基蓮心堿最低有效濃度和最短作用時(shí)間，當(dāng)甲基蓮心堿3 μmol·L-1、作用12 h時(shí)，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性(P<0.01)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用12 h為干預(yù)時(shí)間，3 μmol·L-1為干預(yù)濃度。

Fig 1 Effect of neferine on proliferation

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3.2 甲基蓮心堿對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，甲基蓮心堿干預(yù)HepG2和Bel-7402細(xì)胞后，細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，甲基蓮心堿3 μmol·L-1時(shí)明顯抑制HepG2和Bel-7402細(xì)胞的侵襲(Fig 2)。

Fig 2 Analysis of invasion ability of HepG2 and Bel-7402 cells after neferine treatment

3.3 甲基蓮心堿對(duì)RhoA、RhoC和ROCK蛋白表達(dá)的影響 3 μmol·L-1甲基蓮心堿作用HepG2和Bel-7402細(xì)胞12 h后，蛋白印跡結(jié)果表明，3 μmol·L-1甲基蓮心堿即能明顯抑制HepG2和Bel-7402細(xì)胞RhoA、RhoC和ROCK蛋白的表達(dá)水平(Fig 3)。

Fig 3 Protein expression of RhoA, RhoC and ROCK after treatment HepG2 and Bel-7402 cells with neferine

4 討論

肝細(xì)胞癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是全世界癌癥死亡的第三大原因，對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及相關(guān)人群的生活質(zhì)量造成了極大的負(fù)面影響[7]。肝癌極高的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率是提高患者生存率的主要障礙，腫瘤的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是肝癌病人死亡的主要原因[8]。因此，尋找能抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物具有重要的臨床意義。

以往研究表明，甲基蓮心堿具有擴(kuò)血管、降壓、抗心律失常、抗血小板聚集、抗血栓形成、抗氧化、抗有機(jī)磷農(nóng)藥中毒、抗瘢痕形成、抑制肝纖維化的形成以及化療、增敏等藥理作用，近年來(lái)，甲基蓮心堿對(duì)腫瘤的抑制作用引起研究學(xué)者的關(guān)注[9]。本研究利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲基蓮心堿明顯抑制人肝癌細(xì)胞HepG2和Bel-7402的增殖，且呈濃度依耐性。Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)利用Matrigel包被的小室來(lái)模擬人體內(nèi)基質(zhì)環(huán)境，研究腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[10]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3 μmol·L-1甲基蓮心堿明顯抑制HepG2和Bel-7402細(xì)胞的侵襲。

Rho通路中的細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白、細(xì)胞定位相關(guān)蛋白與腫瘤侵襲密不可分[11]。RhoA作為調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架的關(guān)鍵分子，通過(guò)引發(fā)下游信號(hào)ROCK的激活，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白收縮、影響肝星狀細(xì)胞遷移、基質(zhì)代謝及細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，從而參與肝纖維化和肝癌的形成，促腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移。RhoC不參與腫瘤的形成，但可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架、誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白、整合素及相關(guān)蛋白聚集等途徑，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。RhoA和 RhoC還可通過(guò) ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤血管生成，同時(shí)協(xié)助腫瘤細(xì)胞穿越脈管內(nèi)皮向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果表明，3 μmol·L-1甲基蓮心堿明顯抑制HepG2和Bel-7402細(xì)胞RhoA、RhoC和ROCK蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，甲基蓮心堿抑制肝癌細(xì)胞侵襲的作用可能是通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞Rho/ROCK信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)。甲基蓮心堿通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞的增殖活化，抑制肝纖維化[1]，而肝纖維化可發(fā)展成肝硬化乃至肝癌[12]。結(jié)合甲基蓮心堿抑制人肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞增殖和侵襲的研究結(jié)果，說(shuō)明甲基蓮心堿具抗肝癌的作用。在今后的研究中，我們將進(jìn)一步選用不同惡性程度的多種肝癌細(xì)胞株，比較并研究甲基蓮心堿對(duì)其他肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及黏附能力的影響及作用機(jī)制，并通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，為肝癌的治療提供新的思路。

(致謝：本文全部實(shí)驗(yàn)均在深圳市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝！)

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Effect of neferine on proliferation and invasion of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and Bel-7402

ZHOU Ya-jun1,2，SHI Jing2，TIAN Geng2，ZHOU Han-xin2，GAO Guo-quan1

(1.ZhongShanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510000，China；2.theSecondPeople’sHospitalofShenzhen,ShenzhenGuangdong518000，China)

Aim To investigate the effect of neferine on proliferation and invasion of human hepatocellular carcinoma.Methods HepG2 and Bel-7402 cells were culturedinvitrowith different concentrations of neferine, then cell proliferation was observed by CCK-8 assay; cell invasion was observed by transwell invasion assay; the protein expression of RhoA, RhoC and ROCK was detected by Western blot.Results CCK-8 results showed that neferine could significantly inhibit cell proliferation in a dose-dependent manner compared with the control group. Transwell invasion assay showed that cell invasion was significantly decreased with neferine 3 μmol·L-1．Western blot results showed that RhoA, RhoC and ROCK protein expression was decreased when neferine was co-incubated with hepatocellular carcinoma cells.Conclusion Neferine can inhibit proliferation and invasion of HepG2 and Bel-7402 cells，which is mediated mainly by the inhibition of RhoA, RhoC and ROCK protein expression.

neferine; human hepatocellular carcinoma cell HepG2; human hepatocellular carcinoma cell Bel-7402; proliferation; invasion; RhoA; RhoC; ROCK

2016-07-12,

2016-08-13

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No JCYJ20140414170821259)；深圳細(xì)胞生物技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(No ZDSY20130531165409949)

周雅君(1984-)，女，博士，研究方向：生化藥理學(xué)，E-mail:aquazhou@foxmail.com

高國(guó)全(1965-)，男，博士，教授，研究方向：腫瘤等病理性血管新生的發(fā)生機(jī)制和生物治療，通訊作者，Tel：020-87330634，E-mail: gaogq1@foxmail.com

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.024.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.012

A

1001-1978(2016)11-1539-04

R284.1；R329.24；R735.702.2；R977.6