小球藻細(xì)胞壁缺陷型突變體的篩選及轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立

王亞麗徐澤東蔣思婧黃開(kāi)耀

（1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所， 中國(guó)科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430072； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049； 3. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430062）

小球藻細(xì)胞壁缺陷型突變體的篩選及轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立

王亞麗1，2徐澤東3蔣思婧3黃開(kāi)耀1

（1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所， 中國(guó)科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430072； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049； 3. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430062）

由于高效、穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的缺乏， 小球藻遺傳改良以及油脂代謝機(jī)理的研究等工作難以進(jìn)行。研究旨在通過(guò)篩選獲得小球藻Chlorella vulgaris細(xì)胞壁缺陷型突變體， 在此基礎(chǔ)上建立其轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。首先通過(guò)紫外誘變獲得小球藻Chlorella vulgaris的突變體庫(kù)， 基于細(xì)胞壁缺陷型突變體在1% Triton X-100處理后葉綠素會(huì)釋放到上清中的原理， 利用酶標(biāo)儀高通量地從約4000個(gè)突變體中篩選獲得10株細(xì)胞壁缺陷的小球藻。同時(shí)以小球藻內(nèi)源性β-tubulin的啟動(dòng)子和終止子作為啟動(dòng)子和終止子， 以AphⅧ （Aminoglycoside 3′-Phosphotransferase type Ⅷ）作為報(bào)告基因構(gòu)建了轉(zhuǎn)化載體pHK203。通過(guò)優(yōu)化電轉(zhuǎn)緩沖液組分和電擊參數(shù)， 確定了細(xì)胞壁缺陷型突變體CWD-3的最佳轉(zhuǎn)化條件， 即2 μg pHK203， ddH2O作為電轉(zhuǎn)緩沖液， 1500 V， 525 Ω， 50 μF的電擊條件下， 轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到40個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA。研究為小球藻Chlorella vulgaris的油脂代謝通路和遺傳改良提供了技術(shù)基礎(chǔ)， 同時(shí)由于可降低破壁成本， 篩選獲得的細(xì)胞壁缺陷型突變體適于工業(yè)化生產(chǎn)小球藻藻粉。

小球藻； 轉(zhuǎn)化； 細(xì)胞壁缺陷； 生物柴油

小球藻Chlorella指一類單細(xì)胞無(wú)鞭毛真核綠藻［1］， 長(zhǎng)久以來(lái)被用作研究光合作用機(jī)制和二氧化碳同化機(jī)制的模式生物［2］， 并且是食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)保健品的優(yōu)質(zhì)來(lái)源， 在全球多個(gè)公司實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)［3，4］。近年來(lái)， 微藻生物柴油被認(rèn)為是一種很有潛力的替代能源［5］。篩選高產(chǎn)油小球藻［6］和優(yōu)化小球藻產(chǎn)油條件［7，8］的研究不斷涌現(xiàn)， 推動(dòng)小球藻作為生產(chǎn)生物柴油的生物反應(yīng)器。但是， 穩(wěn)定、高效的轉(zhuǎn)化方法的缺乏， 嚴(yán)重制約了對(duì)小球藻油脂代謝機(jī)理的研究和其遺傳改良。

構(gòu)建小球藻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的努力一直沒(méi)有停止。小球藻堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞壁是轉(zhuǎn)化成功的重要障礙。一種方法是通過(guò)酶解法弱化細(xì)胞壁或者制備原生質(zhì)體來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)化成功， Jarvis等［9］通過(guò)原生質(zhì)體法在Chlorella ellipsoidea中首次實(shí)現(xiàn)了外源基因螢火蟲(chóng)熒光蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。Maruyama等［10］通過(guò)電轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的方式實(shí)現(xiàn)了GUS （β-葡萄糖醛酸酶）基因在Chlorella saccharophila中的瞬時(shí)表達(dá)。而后Liu等［11］報(bào)道了通過(guò)原生質(zhì)體法實(shí)現(xiàn)了GUS基因在Chlorella ellipsoidea中的穩(wěn)定表達(dá)。在細(xì)胞壁完整的小球藻中利用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入外源基因也有陸續(xù)報(bào)道， 如Chow等［12］和Wang等［13］先后在Chlorella vulgaris和Chlorella sp.中實(shí)現(xiàn)了GUS （β-葡萄糖醛酸酶）的瞬時(shí)表達(dá)， 而Chen等［14］和Bai等［15］報(bào)道了在Chlorella ellipsoidea中NP-1（兔噬中性肽-1）基因的穩(wěn)定表達(dá)， 但是其采用的電轉(zhuǎn)化電壓高達(dá)6—9 kV， 而這可能會(huì)提高藻細(xì)胞的死亡率。其他轉(zhuǎn)化方法， 如基因槍法成功將硝酸還原酶基因轉(zhuǎn)化入Chlorella saccharophila硝酸還原酶缺陷型突變體中， 實(shí)現(xiàn)了其回復(fù)突變［16］， 但是這種方法需要昂貴且復(fù)雜的設(shè)備， 并且不易掌握。

通過(guò)酶解法弱化細(xì)胞壁存來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)化的方法存在轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定的缺陷， 因而未見(jiàn)后續(xù)報(bào)道。另外， 上述研究都采用外源性的CaMV35S （Cauli-flower Mosaic Virus 35S）啟動(dòng)子［10，12—14］或Ubi-Ω（Ubiquitin-Ω）啟動(dòng)子［11，14，15］來(lái)控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，然而有研究表明， 內(nèi)源性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的效率要高于外源性啟動(dòng)子［17］。β-tubulin是一種保守的微管蛋白， 其啟動(dòng)子的高驅(qū)動(dòng)效率在Marssonina brunnea［18］、Physcomitrella patens［19］、Volvox［20］中都被證實(shí)。本研究針對(duì)以上兩點(diǎn)， 希望篩選獲得小球藻細(xì)胞壁缺陷型突變體， 同時(shí)利用小球藻內(nèi)源性β-tubulin的啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體， 在球藻Chlorella vulgaris中建立高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 藻株和培養(yǎng)條件

小球藻Chlorella vulgaris UTEX 265來(lái)自美國(guó)德克薩斯州立大學(xué)藻種庫(kù)， 在本研究中作為野生型藻株。培養(yǎng)基是在Bristol solution［21］的基礎(chǔ)上添加1%的Tryptone （Oxoid， 英國(guó)）， 稱為Bristol-T培養(yǎng)基，配方見(jiàn)表 1。固體培養(yǎng)基在液體Bristol-T基礎(chǔ)上添加1.5%瓊脂粉（Bio-sharp， 日本）。篩選培養(yǎng)基在固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加10 μg/mL巴龍霉素（Sigma，USA）。培養(yǎng)條件為22℃， 50 μE/（m2·s）連續(xù)光照，120 r/min震蕩培養(yǎng)。

1.2 生長(zhǎng)曲線繪制

以不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞濃度數(shù)據(jù)來(lái)繪制生長(zhǎng)曲線。設(shè)置初始接種濃度為5×105個(gè)/mL。每天定時(shí)取藻液， 使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。做三次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 紫外誘變獲得突變體庫(kù)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液， 將其濃度調(diào)整為4×106個(gè)/ mL， 終體積為4 mL， 使用自制紫外誘變儀（兩支15 W紫外燈管， 輻射距離9 cm）， 在不同的輻射時(shí)長(zhǎng)下進(jìn)行紫外誘變， 輻射時(shí)長(zhǎng)設(shè)定為0、60s、75s、90s、105s和120s， 輻射完畢后， 將培養(yǎng)皿中的藻液混勻，各取100 μL涂布于Bristol-T固體平板上。在單克隆長(zhǎng)出之后， 計(jì)數(shù)各個(gè)輻射時(shí)長(zhǎng)的平板上長(zhǎng)出的單克隆數(shù)目。以0時(shí)的存活率為100%， 將60s、75s、90s、105s和120s這5個(gè)輻射時(shí)長(zhǎng)下的平板上的單克隆數(shù)目除以0的平板上的單克隆數(shù)目， 計(jì)算得到各個(gè)輻射時(shí)長(zhǎng)下的致死率。進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)致死率繪制紫外誘變致死曲線。找到致死率為90%—95%的最佳輻射時(shí)間。按照最佳輻射時(shí)間進(jìn)行紫外誘變獲得突變體庫(kù)。

表 1 Bristol-T培養(yǎng)基配方Tab. 1 Composition of Bristol-T medium

1.4 細(xì)胞壁缺陷型突變體篩選

將紫外誘變后獲得的突變體接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（NEST， 中國(guó)）中， 置于光下120 r/min震蕩培養(yǎng)2d。用排槍將藻液充分混勻， 取50 μL加入到96孔黑色酶標(biāo)板（Greiner Bio-One， 德國(guó)）中， 在多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices， 美國(guó)）中設(shè)置激發(fā)光為430 nm， 發(fā)射光為670 nm， 測(cè)定藻液的熒光值， 記作A1。向藻液中加入等體積的1%TritonX-100， 于室溫反應(yīng)1h。3000×g， 5min離心后， 小心吸取50 μL上清至新的96孔黑色酶標(biāo)板中， 在同樣設(shè)置下測(cè)熒光值， 記作A2。計(jì)算A2/A1。根據(jù)突變體與野生型A2/A1的值的大小來(lái)篩選細(xì)胞壁缺陷型突變體。

1.5 巴龍霉素耐受性測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液， 將其濃度調(diào)整為5×106個(gè)/mL或者2×106個(gè)/mL， 吹打混勻后， 分別吸取10 μL垂直滴在含有不同濃度巴龍霉素的Bristol-T固體平板上。待其吹干后， 將平板置于藻房暗光處放置2h， 然后取出置于光下培養(yǎng)。7d后觀察平板上藻斑的生長(zhǎng)情況。

1.6 載體構(gòu)建

pHK203是在本實(shí)驗(yàn)室載體pKS-AphⅧ-Lox的基礎(chǔ)上將它的啟動(dòng)子和終止子分別換成小球藻Chlorella vulgaris的β-tubulin的啟動(dòng)子和終止子構(gòu)建而來(lái)。β-tubulin的啟動(dòng)子和終止子都是通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得， 引物分別為β-tubulin-pF、β-tubulinpR和β-tubulin-uF、β-tubulin-uR， 引物序列見(jiàn)表 2。將載體用XhoⅠ和SacⅠ酶切， 借助片段與載體的同源序列， 通過(guò)雙片段無(wú)酶克隆的方式［22］將啟動(dòng)子片段連接到載體上； 再將重組載體用BamHⅠ和KpnⅠ酶切， 通過(guò)雙片段無(wú)酶克隆的方式將終止子片段連接到重組載體上。

1.7 電轉(zhuǎn)化方法

3000×g， 5min離心收集3×107個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。將細(xì)胞用新鮮Bristol-T培養(yǎng)基洗滌一次后，用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸， 加入2 μg pHK203， 混勻， 于冰上前處理15min。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至電極杯中， 在電轉(zhuǎn)儀（BTX， ECM 630， 美國(guó)）中進(jìn)行電擊， 電擊后置于冰上后處理15min。吸出細(xì)胞懸液， 轉(zhuǎn)移到裝有20 mL含有60 mmol/L山梨醇（Biosharp， 日本）的Bristol-T培養(yǎng)基的50 mL離心管中， 恢復(fù)過(guò)夜。3000×g， 5min離心收集細(xì)胞， 用500 μL新鮮的Bristol-T重懸后， 涂布到含有10 μg/mL巴龍霉素的Bristol-T平板上。暗光放置2h后， 取出置于光下培養(yǎng)。

表 2 本研究中所用的引物Tab. 2 Primers used in the current study

1.8 PCR驗(yàn)證重組子

將電轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出來(lái)的單克隆劃線于Bristol-T固體培養(yǎng)基上， 3d后挑取適量藻落于24孔板中， 置于光下培養(yǎng)2d， 用于提取基因組?；蚪M提取方法參照［16］， 優(yōu)化部分包括將CTAB緩沖液用量減少到200 μL，以及加入玻璃珠（Sigma， USA）利于細(xì)胞裂解。

PCR擴(kuò)增AphⅧ片段以驗(yàn)證重組子。所用的正向和反向引物分別是AphⅧ-F和AphⅧ-R （表 2）。PCR程序?yàn)? 1， 94℃， 5min； 2， 94℃， 30s； 3， 62℃，45s； 4， 72℃， 1min； 5， 72℃， 10min， 步驟2—4重復(fù)30次。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)曲線

微藻的生長(zhǎng)狀態(tài)和生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化成功存在影響［23］， 為了確定Chlorella vulgaris UTEX 265的生長(zhǎng)特性， 確定其生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期， 本研究首先測(cè)定了其生長(zhǎng)曲線。從測(cè)定獲得的生長(zhǎng)曲線中看出， 在開(kāi)始培養(yǎng)之后， Chlorella vulgaris迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 在培養(yǎng)7d之后細(xì)胞增殖速度開(kāi)始下降。所以本實(shí)驗(yàn)選擇以培養(yǎng)4—6d的藻細(xì)胞來(lái)進(jìn)行紫外誘變和電轉(zhuǎn)化。

2.2 對(duì)巴龍霉素敏感性的測(cè)定

AphⅧ 編碼Ⅷ型氨基糖苷類3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶， 使藻株對(duì)氨基糖苷類抗生素如巴龍霉素等具有抗性，是一個(gè)高效的重組子報(bào)告基因［24，25］。本研究采用AphⅧ 作為報(bào)告基因， 首先需要確定小球藻Chlorella vulgaris UTEX 265對(duì)巴龍霉素的耐受性。如圖 1所示， 在藻斑形成實(shí)驗(yàn)中， 在沒(méi)有巴龍霉素篩選壓力時(shí)， 10 μL 5×106個(gè)/mL （C1）或者2.5×106個(gè)/mL（C2）的藻液在7d后即形成深綠色的邊緣稍凸起的藻斑。而當(dāng)施加巴龍霉素篩選壓力之后， 從巴龍霉素濃度為2.5 μg/mL起C1和C2組即開(kāi)始不能形成藻斑， 但C1組在藻斑邊緣處有綠色痕跡， 推測(cè)是由于邊緣處細(xì)胞的堆積造成， 濃度較低的C2組從5 μg/mL起即完全沒(méi)有藻落長(zhǎng)出。以上實(shí)驗(yàn)表明，巴龍霉素對(duì)于小球藻Chlorella vulgaris 是一種有效的篩選壓力， 同時(shí)， 細(xì)胞的堆疊會(huì)造成上層細(xì)胞的“幸存”。本研究為了確保篩選的陽(yáng)性率， 選擇10 μg/mL巴龍霉素作為篩選壓力。

2.3 細(xì)胞壁缺陷突變體的篩選

圖 1 小球藻Chlorella vulgaris對(duì)巴龍霉素的耐受性測(cè)定Fig. 1 Sensitivity of Chlorella vulgaris to paromomycin

普通小球藻具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁， 主要由堅(jiān)硬的多聚糖組成［1］， 是電轉(zhuǎn)化成功的一個(gè)重要阻礙因素［26］。因此我們希望獲得小球藻無(wú)細(xì)胞壁突變體，在其中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的探索。首先通過(guò)紫外誘變獲得突變體庫(kù)， 利用自制紫外誘變儀對(duì)小球藻Chlorella vulgaris UTEX 265進(jìn)行紫外誘變， 在距離紫外光源垂直距離為9 cm， 細(xì)胞濃度為4×106個(gè)/ mL時(shí)， 測(cè)定紫外誘變致死曲線。紫外誘變的致死率在輻射時(shí)長(zhǎng)為60—90s劇烈升高， 在輻射時(shí)長(zhǎng)為90s時(shí)達(dá)到90%的致死率， 而后隨著輻射時(shí)長(zhǎng)的延長(zhǎng)， 致死率趨于100%。我們選擇90s作為制備突變體庫(kù)時(shí)的輻射時(shí)長(zhǎng)。通過(guò)紫外誘變獲得了近4000株突變體。

Triton X-100是一種離子型去垢劑， 細(xì)胞壁薄弱的藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)1% Triton X-100處理后會(huì)發(fā)生裂解， 釋放出葉綠素［27］， 此時(shí)離心后測(cè)得的上清液的熒光值（A2）與處理前細(xì)胞懸液的熒光值（A1）應(yīng)該相當(dāng)?；谶@個(gè)原理， 我們制定了小球藻無(wú)細(xì)胞壁突變體的篩選流程（圖 2）， 根據(jù)A2/A1的值來(lái)篩選細(xì)胞壁缺陷型突變體。

從近4000株突變體中， 篩選獲得10株A2/A1值顯著高于野生型的突變體， 分別命名為CWD-1至CWD-10。如圖 3所示， 野生型的A2/A1值在0.08左右， 而10株突變體的A2/A1值在1左右， 證明細(xì)胞壁相對(duì)于野生型發(fā)生了弱化， 經(jīng)過(guò)1% Triton X-100處理后發(fā)生了裂解釋放出了葉綠素。

在10個(gè)細(xì)胞壁缺陷型突變體中， CWD-3的A2/A1值最高， 顯示其細(xì)胞壁缺陷程度可能最高。為了排除其細(xì)胞壁缺陷的同時(shí)發(fā)生生長(zhǎng)障礙， 因此本研究對(duì)其生長(zhǎng)速度進(jìn)行了測(cè)定。如圖 4所示，CWD-3的生長(zhǎng)趨勢(shì)與野生型類似， 同時(shí)生長(zhǎng)速度相較于野生型反而有所提高。所以CWD-3不存在生長(zhǎng)問(wèn)題， 方便用于后續(xù)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立， 同時(shí)表明其可能具有工業(yè)化生產(chǎn)藻粉， 減少破壁等成本的潛力。

圖 2 Chlorella vulgaris無(wú)細(xì)胞壁突變體的篩選流程Fig. 2 The screening procedure for cell wall-less mutants in Chlorella vulgaris

圖 3 小球藻Chlorella vulgaris細(xì)胞壁缺陷型突變體Fig. 3 Cell wall-defective mutants of Chlorella vulgaris

圖 4 小球藻Chlorella vulgaris細(xì)胞壁缺陷型突變體CWD-3生長(zhǎng)速度與野生型對(duì)比Fig. 4 The growth curve of cell wall-defective mutant CWD-3 and WT

2.4 電轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立

轉(zhuǎn)化載體pHK203的示意圖和酶切驗(yàn)證圖（圖5）。pHK203總長(zhǎng)度為6941 bp， β-tubulin啟動(dòng)子長(zhǎng)度為2077 bp， 3′-UTR長(zhǎng)度為1083 bp， AphⅧ長(zhǎng)度為885 bp， 在β-tubulin啟動(dòng)子距離5′端777 bp處存在一個(gè)SacⅠ酶切位點(diǎn)。酶切驗(yàn)證的結(jié)果符合預(yù)期。這說(shuō)明我們成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)化載體。

為了研究脈沖時(shí)間和電轉(zhuǎn)緩沖液的成分的關(guān)系， 獲得合適的脈沖時(shí)間， 我們?cè)O(shè)計(jì)了不同的電轉(zhuǎn)緩沖液（表 3）， 按照電轉(zhuǎn)化方法， 在電轉(zhuǎn)儀參數(shù)設(shè)定為1500 V， 525 Ω， 50 μF條件下， 測(cè)定其脈沖時(shí)間。

從圖 6可以看出， 緩沖液的組分對(duì)于脈沖時(shí)間有很大影響。由Buffer 1到Buffer 4， 在其他成分保持一致的情況下， 隨著電轉(zhuǎn)緩沖液中NaCl濃度降低， 脈沖時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。脈沖時(shí)間在電轉(zhuǎn)緩沖液中沒(méi)有離子成分， 僅存在ddH2O或者山梨醇和HEPES等非離子物質(zhì)時(shí)， 穩(wěn)定在22ms左右。

圖 5 pHK203示意圖和酶切驗(yàn)證圖譜Fig. 5 Diagram of pHK203 and confirmation of restriction enzyme digestion

表 3 本研究所用的電轉(zhuǎn)緩沖液的組分Tab. 3 Component of electroporation buffer used in this study

在本研究中， 主要嘗試從電擊參數(shù)和電轉(zhuǎn)緩沖液組分兩各部分來(lái)優(yōu)化電轉(zhuǎn)化系統(tǒng)， 提高轉(zhuǎn)化效率。從表 4中可以看出， 同樣以Buffer 1 （Bristol，60 mmol/L 山梨醇， 375 mmol/L NaCl）作為電轉(zhuǎn)緩沖液時(shí)， 提高電轉(zhuǎn)儀的電阻和電容設(shè)置， 電轉(zhuǎn)效率有了較大提高。值得注意的是， 當(dāng)提高電阻和電容時(shí)， 脈沖時(shí)間也提高了， 由430 μs左右提高到了620 μs左右， 同時(shí)， 在電擊過(guò)程中出現(xiàn)了電火花， 引起了爆杯。而當(dāng)以Buffer 5 （ddH2O）作為電轉(zhuǎn)緩沖液， 當(dāng)提高電轉(zhuǎn)儀的電阻時(shí)， 脈沖時(shí)間由22 ms左右提高到了29 ms左右， 但是轉(zhuǎn)化效率反而有所下降。當(dāng)以Buffer 7 （100 mmol/L山梨醇， 10 mmol/L HEPES）作為電轉(zhuǎn)緩沖液時(shí)， 轉(zhuǎn)化效率與以Buffer 5 （ddH2O）作為電轉(zhuǎn)緩沖液時(shí)的轉(zhuǎn)化效率基本一致。

在1500 V， 525 Ω， 50 μF條件下， 以500 μL ddH2O作為電轉(zhuǎn)緩沖液， 以pHK203為轉(zhuǎn)化載體電轉(zhuǎn)化CWD-3， 在涂布巴龍霉素平板后約7—10d， 單克隆逐漸長(zhǎng)出。理論上這些克隆具有巴龍霉素抗性， 應(yīng)該成功轉(zhuǎn)入了載體DNA。為了進(jìn)一步確認(rèn)， 我們從平板上挑取1/3區(qū)域范圍內(nèi)的單克隆， 抽提總DNA，然后用PCR擴(kuò)增AphⅧ片段， 并將擴(kuò)增出來(lái)的DNA回收純化， 測(cè)序， 與AphⅧ序列進(jìn)行比對(duì)。如圖 7c所示， 待檢測(cè)的13株藻有6株擴(kuò)增得到833 bp的AphⅧ片段， 并且經(jīng)過(guò)測(cè)序證實(shí)其序列正確。以上結(jié)果表明， 本研究成功建立了小球藻電轉(zhuǎn)化系統(tǒng)， 將外源DNA轉(zhuǎn)入到了小球藻細(xì)胞中。

3 討論

圖 6 脈沖時(shí)間與電轉(zhuǎn)緩沖液組分的關(guān)系Fig. 6 The relationship between pulse duration and components of electroporation buffer

表 4 轉(zhuǎn)化效率與電轉(zhuǎn)化條件的關(guān)系Tab. 4 The relationship between transformation efficiency and electroporation conditions

轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立對(duì)于現(xiàn)代微藻生物技術(shù)的發(fā)展非常重要。由于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的缺乏， 小球藻的淀粉和油脂等代謝通路的研究， 以及通過(guò)基因工程的手段獲得優(yōu)良高產(chǎn)油藻株的研究等， 都進(jìn)展緩慢。本研究率先嘗試篩選小球藻細(xì)胞壁缺陷型突變體用于轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立。建立了細(xì)胞壁缺陷型突變體的篩選方法。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)1% Triton X-100處理前藻液和處理后上清的熒光值的方法， 由于排槍、96孔板和酶標(biāo)儀的使用， 相比于前人用體式顯微鏡觀察克隆形態(tài)［27］， 實(shí)現(xiàn)了高通量的細(xì)胞壁缺陷型突變體的篩選。從約4000株突變體中獲得10株處理前后熒光值比顯著高于野生型的突變體，雖然這10株突變體的克隆形態(tài)與野生型沒(méi)有顯著差異， 同時(shí)， 與相同數(shù)量的萊茵衣藻無(wú)細(xì)胞壁突變體CW 15在1% Triton X-100處理前后熒光值比（9.5±0.5）相比， 這10株突變體的A2/A1值較小。綜合以上結(jié)果， 表明我們獲得了10株細(xì)胞壁存在缺陷的小球藻突變體， 同時(shí)， 這種缺陷沒(méi)有衣藻無(wú)細(xì)胞壁突變體明顯， 但這10株細(xì)胞壁缺陷突變體可以減輕電轉(zhuǎn)化時(shí)的阻礙， 由于生長(zhǎng)速率沒(méi)有降低， 應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)時(shí)， 通過(guò)降低破壁成本， 可以降低總體生產(chǎn)成本。

圖 7 PCR驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子Fig. 7 Confirmation of positive transformants via PCR

本研究率先以小球藻內(nèi)源性β-tubulin啟動(dòng)子和終止子構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體， 率先在小球藻中使用巴龍霉素作為篩選抗生素， 并且用藻斑實(shí)驗(yàn)證實(shí)了小球藻對(duì)于巴龍霉素的敏感性， 確定了10 μg/mL的篩選濃度。本研究通過(guò)對(duì)不同電擊緩沖液組分的摸索，發(fā)現(xiàn)在相同的電擊參數(shù)， 電轉(zhuǎn)緩沖液中的離子濃度越高， 則脈沖時(shí)間會(huì)越短。以ddH2O或者山梨醇、HEPES作為電轉(zhuǎn)緩沖液時(shí)， 脈沖時(shí)間最高， 達(dá)到22ms左右， 而這個(gè)脈沖時(shí)間被證明足夠外源DNA進(jìn)入到小球藻Chlorella vulgaris中， 實(shí)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)化。Brown等［28］研究發(fā)現(xiàn)， 需要26 ms的脈沖時(shí)間使外源DNA成功進(jìn)入萊茵衣藻無(wú)細(xì)胞壁突變體， 而需要兩個(gè)26 ms的脈沖時(shí)間使外源DNA成功進(jìn)入細(xì)胞壁正常萊茵衣藻。使用非離子型電轉(zhuǎn)緩沖液時(shí)，通過(guò)提高電阻來(lái)提高脈沖時(shí)間， 有助于轉(zhuǎn)化效率的提高， 但是， 在電轉(zhuǎn)緩沖液離子強(qiáng)度較大條件下， 提高脈沖時(shí)間反而會(huì)造成轉(zhuǎn)化效率的下降， 有可能是因?yàn)樘岣吡穗娹D(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)胞的死亡率［29］。出于操作安全、簡(jiǎn)便和節(jié)約成本的目的， 則可以選擇以ddH2O作為電轉(zhuǎn)緩沖液。通過(guò)對(duì)不同電轉(zhuǎn)化條件的比較， 證明在以ddH2O作為電轉(zhuǎn)緩沖液， 在1500 V， 525 Ω， 50 μF電擊條件下， 5 μg/mL環(huán)狀載體DNA即可以達(dá)到相對(duì)較高的轉(zhuǎn)化效率。相對(duì)于前人的報(bào)道［9—11，13，14，16］， 無(wú)需經(jīng)過(guò)酶解等步驟弱化細(xì)胞壁， 無(wú)需使用極高的電壓， 并且電轉(zhuǎn)緩沖液成分單一， 簡(jiǎn)便易行， 節(jié)約成本。

Shimogawarra等［30］研究發(fā)現(xiàn)， 在電轉(zhuǎn)化體系中添加鮭精子DNA作為運(yùn)載DNA可以提高萊茵衣藻的電轉(zhuǎn)化效率， 但Yamano等［31］證實(shí)不加鮭精子DNA能達(dá)到同樣的轉(zhuǎn)化效率。王等［23］發(fā)現(xiàn)載體線性化可以提高GUS活性。Shimogawara等［30］證實(shí)電擊恢復(fù)后涂布平板時(shí)， 以玉米淀粉、海藻酸鈉、礦物油等包埋藻細(xì)胞， 為細(xì)胞提供一個(gè)保濕的環(huán)境，可以提高轉(zhuǎn)化子的存活率。我們猜測(cè)可以通過(guò)添加鮭精子DNA作為運(yùn)載DNA， 線性化載體， 在涂平板時(shí)添加包埋材料等方式可以繼續(xù)提高小球藻Chlorella vulgaris的轉(zhuǎn)化效率。另外， 我們考慮在轉(zhuǎn)化載體pHK203的AphⅧ片段后加上GFP等標(biāo)記，以方便采用western blot的方式對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

綜上所述， 本研究通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定1% Triton X-100處理前藻液和處理后上清熒光值的方法， 高通量地篩選獲得了10株細(xì)胞壁缺陷的小球藻突變體。以其中的CWD-3藻株， 通過(guò)對(duì)電轉(zhuǎn)緩沖液組分和電擊參數(shù)的摸索， 以2 μg pHK203， 以ddH2O為電轉(zhuǎn)緩沖液， 在1500 V， 525 Ω， 50 μF電擊條件下， 可以得到40個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA。該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便、快速。該系統(tǒng)的建立， 為研究小球藻Chlorella

vulgaris的油脂代謝通路， 遺傳改良等提供了遺傳操作手段。

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SCREENING OF CELL WALL-DEFECTIVE MUTANTS AND CONSTRUCTION OF TRANSFORMATION SYSTEM IN CHLORELLA VULGARIS

WANG Ya-Li1，2， XU Ze-Dong3， JIANG Si-Jing3and HUANG Kai-Yao1
（1. Key Laboratory of Algal Biology， Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China； 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China； 3. Hubei University， Wuhan 430062， China）

Chlorella vulgaris has been widely recognized as a safe food ingredient due to its richness in proteins， vitamins， minerals and short chain poly-unsaturated fatty acid. Recently， Chlorella vulgaris was chosen as one of the feedstock for biodiesel because of its high growth rate and high lipid content， but lacking of stable and efficient transformation system has seriously hindered the understanding of lipid metabolism and the development of the genetic engineering. Our aim was to obtain cell wall-defective mutants of Chlorella vulgaris and use them to construct an electro-transformation system. Based on the release ability of chlorophyll after treatment of 1% Triton X-100， we set up a high throughput screening method of cell wall-defective mutants and obtained 10 cell wall-defective mutants. In addition， we constructed a transformation vector pHK203 by using endogenous promoter and 3′-UTR of β-tubulin gene and by using AphⅧ as selective marker. We successfully obtained 40 transformants per μg DNA using plasmid pHK203 and ddH2O as electroporation buffer with the best electroporation condition of 1500 V， 525 Ω， 50 μF. Our study will benefit the study of lipid metabolism pathway and genetic engineering of Chlorella vulgaris.

Chlorella vulgaris； Transformation； Cell wall-defective； Biodiesel

10.7541/2016.49

Q813.5

A

1000-3207（2016）02-0370-08

2015-04-27；

2015-09-14

國(guó)家開(kāi)發(fā)投資公司資助項(xiàng)目 ［Supported by State Development & Investment Corporation （SDIC）］

王亞麗（1990—）， 女， 湖北襄陽(yáng)人； 碩士； 主要從事微藻生物技術(shù)研究。E-mail: wangyali199011@163.com

黃開(kāi)耀， E-mail: huangky@ihb.ac.cn； 蔣思婧， E-mail: jiangsijing@hubu.edu.cn