一株耐NaHCO3高含油綠藻的篩選鑒定

周 虹高 宏徐旭東孔任秋

（1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所， 淡水生態(tài)和生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430072； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049）

研究簡(jiǎn)報(bào)

一株耐NaHCO3高含油綠藻的篩選鑒定

周 虹1，2高 宏1徐旭東1孔任秋1

（1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所， 淡水生態(tài)和生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430072； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049）

傳統(tǒng)化石能源儲(chǔ)量日益減少， 化石能源燃燒后產(chǎn)生的二氧化碳是全球變暖的主要元兇， 因此， 能夠替代傳統(tǒng)化石燃料、可再生的新型能源受到廣泛的關(guān)注， 生物柴油便是較為理想的新型能源之一［1］。雖然油料作物、廢棄油脂等為生物柴油生產(chǎn)提供了部分原料， 但其成本、規(guī)模及可持續(xù)性受多種因素的制約［2］。目前， 利用光合自養(yǎng)的微藻生產(chǎn)生物柴油的潛在價(jià)值已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可， 微藻生物柴油技術(shù)在減少CO2排放、大規(guī)模培養(yǎng)、產(chǎn)油效率等方面的優(yōu)勢(shì)日益突顯［3］。微藻生物柴油的生產(chǎn)是一個(gè)系統(tǒng)的工程， 獲得產(chǎn)油率高、生長(zhǎng)性能良好的藻株是實(shí)現(xiàn)微藻生物柴油生產(chǎn)的前提［4］。優(yōu)良藻種缺乏以及藻種優(yōu)良性狀不穩(wěn)定均是產(chǎn)油微藻規(guī)?；a(chǎn)的限制因素［5］。

微藻篩選過程中最主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)是藻株的含油量和油脂積累速率［6］， 同時(shí)還響到生物柴油的質(zhì)量和穩(wěn)定性。近年來(lái)， 國(guó)內(nèi)外的研究者們?cè)趯?duì)已有藻種產(chǎn)油性能的評(píng)價(jià)及培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面做了大量的工作［9］。然而，自然界中微藻資源豐富、生境范圍廣， 可用于生物柴油生產(chǎn)的優(yōu)良藻種有待進(jìn)一步的發(fā)掘。從野外分離篩選的產(chǎn)油微藻對(duì)溫度、光照和培養(yǎng)基的鹽度具有較廣的耐受性， 能更好地適應(yīng)環(huán)境條件的變化， 更適用于大規(guī)模培養(yǎng)。席瑋芳等［10］利用沙漠地下水培養(yǎng)產(chǎn)油微藻， 分離到了一些耐高堿、高鹽等極端條件的藻種， 這些藻可以利用沙漠和鹽堿灘涂等非農(nóng)用土地作為的規(guī)?；囵B(yǎng)基地， 且在室外大量培養(yǎng)時(shí)較好地避免其他微生物的侵害。本研究對(duì)一些野外采集分離的含油藻株進(jìn)行了篩選和評(píng)價(jià)， 意在獲得耐受高鹽堿條件且高產(chǎn)油的藻株。

1 材料與方法

1.1 藻種初步篩選

本研究所用藻種是從我國(guó)河北、山西的河流、湖泊、水庫(kù)及污水處理廠等水體中采集水樣， 經(jīng)稀釋涂布平板的方法分離純化， 薄層層析初步篩選［11］出含油的藻種。

1.2 藻種顯微鏡觀察和18S rDNA測(cè)序

取少量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞液， 置于Olympus BX41型光學(xué)顯微鏡下觀察藻細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照。采用CTAB法提取藻株的基因組DNA［12］， 以通用引物18S-1 : 5′-tggttgatcctgccagtagtc-3′/18S-2 : 5′-tgatccttctgcag gttcacc-3′［11，13］進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得相應(yīng) 18S rDNA 片段。通過瓊脂糖凝膠電泳分離并用膠回收試劑盒（Bioflux）回收目的片段， 獲得18S rDNA 基因片段。將回收的片段克隆到 pMD18-T （Takara）載體上， 測(cè)序得到對(duì)應(yīng)藻株的18S rDNA序列， 提交NCBI GenBank比對(duì)分析， 使用ClustalX進(jìn)行對(duì)位排列后用軟件MEGA5.1構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3 柱狀光反應(yīng)器培養(yǎng)

將所有藻株接種于20 mL BG11［14］或含0.1 mol/L NaHCO3的BG11（高堿BG11）液體培養(yǎng)基中， 于30℃、30 μE/（m2·s）條件下24h連續(xù)光照靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。再同時(shí)接種至NaNO3濃度分別為1.50和0.15 g/L 的150 mL BG11或高堿BG11培養(yǎng)基的柱狀光生物反應(yīng)器（直徑d=3 cm， 柱高h(yuǎn)=50 cm）， 初始接種光密度OD680約為0.05.柱狀光生物反應(yīng)器雙側(cè)光強(qiáng)均為200 μE/（m2·s）， 培養(yǎng)溫度為30℃， 24h連續(xù)光照， 空氣壓縮泵通入含有CO2的壓縮空氣 （3% CO2）。培養(yǎng)至平臺(tái)期后離心收集藻細(xì)胞， 冷凍真空干燥后提取總脂。

1.4 總脂含量及油脂積累速率分析

總脂的提取及定量參照文獻(xiàn)［15］， 略有改動(dòng)。用分析天平稱取100 mg冷凍干燥的藻粉， 加入一定體積的氯仿: 甲醇 （1︰1） 溶液超聲破碎細(xì)胞并萃取充分， 再加入1/3體積的滅菌超純水分層， 離心收集下層的氯仿層， 轉(zhuǎn)入已稱重的稱量瓶中， 氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)溶劑后， 稱重， 計(jì)算總脂的含量和油脂積累速率?？傊?（C， lipid content，%）和油脂積累速率［PL， lipid productivity， mg/（L·d）］計(jì)算公式［9］:

以上兩式中: m1為提取總脂時(shí)稱取藻粉的質(zhì)量（g）， m2為稱量瓶的質(zhì)量（g）， m3為提取的總脂和稱量瓶的總質(zhì)量（g）， mt為藻株收獲時(shí)單位培養(yǎng)體積的干重（g/L）， Ct為收獲時(shí)總脂含量（%）， t為培養(yǎng)時(shí)間（d）。

1.5 回收甘油三酯

方法參照文獻(xiàn)［16］略改動(dòng)。稱取約20 mg總脂， 溶于500 mL三氯甲烷后， 上樣于硅膠薄層層析板（Silica gel 60， Merk KgaA Darmstadt）， 以0.02 mg甘油三酯（Triolein，Sigma）標(biāo)準(zhǔn)品為參照， 置于以正己烷︰乙醚︰乙酸（體積比為70︰30︰1）為展層劑的體系中分離。切下硅膠板上標(biāo)準(zhǔn)品所在的一小塊， 利用碘蒸氣顯色［17］后拼回原位即可指示出樣品中甘油三酯的位置。用小刀刮取該位置的全部硅膠粉， 溶于4 mL三氯甲烷， 離心后收集有機(jī)相于已稱重的稱量瓶中， 重復(fù)萃取3次， 氮?dú)獯蹈珊蠓Q重， 計(jì)算甘油三酯含量。

1.6 總脂和甘油三酯的脂肪酸組分分析

將柱狀光反應(yīng)器培養(yǎng)藻株所提取的藻細(xì)胞總脂和甘油三酯（各10 mg）進(jìn)行甲酯化［11］， 用正己烷反復(fù)萃取3次后氮?dú)獯蹈桑?溶于100 μL正己烷中， 取1 μL用氣相色譜分析儀（Ultra Trace， Thermo Scientific） 進(jìn)行脂肪酸組成分析， 脂肪酸分析方法參照文獻(xiàn)［18］。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)油藻的初步篩選和鑒定

從野外分離純培養(yǎng)的藻株中經(jīng)薄層層析篩得到含油的藻種， 包括淡水藻株和耐高堿（0.1 mol/L NaHCO3）藻株， 進(jìn)一步測(cè)定總脂含量， 篩選到6株總脂含量超過30%的藻株， 其采樣點(diǎn)和培養(yǎng)基類型如表 1所示。

表 1 六株藻的采樣點(diǎn)和培養(yǎng)基類型Tab. 1 Sampling sites and culture media of 6 algal strains

將以上6株綠藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期， 進(jìn)行顯微拍照。其中HSJ280和HSJ354的細(xì)胞較大（圖 1A、B）， HSJ280為4個(gè)橢圓形的細(xì)胞并排生長(zhǎng)在一起， 長(zhǎng)度大于10 μm， 細(xì)胞具1個(gè)蛋白核， 兩端各具1刺狀附屬物。HSJ354細(xì)胞為纖長(zhǎng)的梭形， 長(zhǎng)度約為20 μm， 兩端尖細(xì)， 色素體片狀， 無(wú)蛋白核。HSJ717也是2個(gè)或4個(gè)橢圓形的細(xì)胞并排生長(zhǎng)在一起（圖 1C）， 細(xì)胞的兩端各具1刺狀附屬物， 1個(gè)蛋白核， 長(zhǎng)度5 μm左右。HSJA2和HSJG162（圖 1D、E）細(xì)胞形態(tài)為月牙形， 細(xì)胞較為彎曲， 細(xì)胞兩端略尖， HSJA2細(xì)胞的長(zhǎng)寬比較大， 長(zhǎng)約 5 μm左右。HSJG162細(xì)胞較小， 細(xì)胞長(zhǎng)2—3 μm。HSJG164（圖 1F）細(xì)胞為短粗的紡錘形， 細(xì)胞中部稍凸起。

以6株藻的基因組DNA為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到18S rDNA 片段并進(jìn)行測(cè)序， 提交NCBI GenBank 獲得序列號(hào)， 將其序列與GenBank中一些綠藻的18S rDNA序列一起構(gòu)建系統(tǒng)樹（圖 2）。不同系統(tǒng)分析方法構(gòu)建的18S rDNA系統(tǒng)樹具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。圖2中HSJ280和鏈帶藻 （Desmodesmus communis）聚集在一起， HSJ717雖與柵藻（Scenedesmus armatus）及鏈帶藻（Desmodesmus ommunis）的關(guān)系都較近， 但是HSJ280和HSJ717兩者細(xì)胞兩端均具有刺狀附屬物， An等［19］將廣義的柵藻屬中具刺狀附屬物的種類定義為鏈帶藻， 因此判斷HSJ280和HSJ717為鏈帶藻屬的種類。 HSJ354與單針藻（Monoraphidium sp.）及纖維藻屬（Ankistrodesmus falcatus var. tumidus）同時(shí)聚集在一起， 但其形態(tài)具有典型的纖維屬的特點(diǎn)， 因此將其歸為纖維藻屬的種類。HSJA2、HSJG162和HSJ164分別與不同的單針藻株系聚成一簇， 同時(shí)根據(jù)藻株形態(tài)判斷其屬于單針藻屬。

圖 1 光學(xué)顯微鏡下6株綠藻的顯微照片F(xiàn)ig. 1 Light micrographs of 6 strains of green alga

圖 2 基于18S rDNA系列構(gòu)建的6株綠藻的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of 18S rDNA sequences of green algae

2.2 基于總脂含量和油脂積累速率的藻種篩選

在NaNO3濃度分別為1.50和0.15 g/L的BG11培養(yǎng)基中， 利用柱狀反應(yīng)器培養(yǎng)這6株綠藻至第8天， 提取總脂，計(jì)算總脂含量和油脂積累速率（圖 3）。藻株HSJG162在NaNO3濃度為1.50 g/L培養(yǎng)時(shí)的總脂達(dá)到細(xì)胞干重的45.4%， 其他藻株的總脂含量均在33%左右。其中HSJ280和HSJG164在兩種條件下的總脂含量基本一致；HSJ717和HSJA2在高氮條件下的總脂含量均低于低氮條件下； 但對(duì)于HSJ354和HSJG162， 降低培養(yǎng)基中的NaNO3濃度， 藻株的總脂含量卻有所下降。

圖 3 兩種氮濃度條件下培養(yǎng)6株綠藻的總脂含量和油脂積累速率Fig. 3 Total lipid content and lipid productivity of 6 strains of green algae grown at different NaNO3concentrations

在不同的氮濃度條件下， 藻株的油脂積累速率差異很大。在培養(yǎng)基中NaNO3濃度為1.50 g/L時(shí)， 藻株的油脂積累均高于100 mg/（L·d）。這6株藻中油脂積累速率最高的藻株為HSJ717， 可達(dá)到190.6 mg/（L·d）， 油脂積累速率最低的藻株HSJ354， 也達(dá)到了116.5 mg/（L·d）。當(dāng)NaNO3濃度為0.15 g/L時(shí)， 6藻株的油脂積累速率均不足100 mg/（L·d）， 最高為88.9 mg/（L·d）（HSJ280）， 最低為23.4 mg/（L·d）（HSJ354）， 約為氮充足條件下的1/5。

綜合上述結(jié)果， 發(fā)現(xiàn)單針藻HSJG162既有最高的總脂含量， 又有較高的油脂積累速率， 而且能夠以含0.1 mol/L NaHCO3的BG11進(jìn)行培養(yǎng)， 是一株較為優(yōu)質(zhì)的藻種。

2.3 單針藻HSJG162產(chǎn)油性狀的進(jìn)一步分析

在柱狀光反應(yīng)器中對(duì)該單針藻HSJG162進(jìn)行通氣培養(yǎng)， 設(shè)3個(gè)平行， 至平臺(tái)期收集藻細(xì)胞， 提取其總脂并分離其中的甘油三酯， 以稱重法分別測(cè)定其總脂和甘油三酯的含量。結(jié)果顯示HSJG162的總脂含量為細(xì)胞干重的（46.5±2.3）%； 其甘油三酯為細(xì)胞干重的（31.3±2.1）%， 可占到總脂的67%； 其油脂積累速率可達(dá)到（158.1±9.1） mg/（L·d）。

進(jìn)一步將該藻株總脂和甘油三酯進(jìn)行甲酯化處理，通過氣相色譜分析其脂肪酸組分及相對(duì)含量。表 2顯示，

表 2 單針藻HSJG162總脂和甘油三酯的脂肪酸組成Tab. 2 Fatty acid composition （mol%） of total lipids and triacylglycerol of Monoraphidium sp. HSJG162

［1］Bozbas K. Biodiesel as an alternative motor fuel: Production and policies in the European Union ［J］. Renewable and Sustainable Energy Reviews， 2008， 12（2）: 542—552 HSJG162的總脂和甘油三酯中的脂肪酸組成相似， 含量最高的組分是C18:1（油酸）， 其次為C16:0（軟脂酸）， 二者總含量均超過總脂的75%， 超過甘油三酯的80%； 飽和脂肪酸含量約為25%， 單一不飽和脂肪酸總量占總脂的57%， 占甘油三酯的61%左右； C16和C18系列的脂肪酸含量可達(dá)到99%?？傊透视腿ブ卸嗖伙柡椭舅嵋驭?亞麻酸和18碳4烯酸為主， 僅含有少量的20碳5烯酸。

3 討論

油脂產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)的藻種對(duì)生物柴油生產(chǎn)至關(guān)重要。本研究利用從野外采樣并分離純化的藻種， 經(jīng)初步篩選得到6株含油量較高的藻株。通過對(duì)這6株藻進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA序列分析， 判斷其中HSJ280和HSJ717為柵藻科鏈帶藻屬（Desmodesmus）的種類， HSJ354屬于纖維藻屬（Ankistrodesmus）， HSJA2、HSJG162和HSJ164屬于單針藻屬 （Monoraphidium）。柵藻科的種類是迄今為止已知的高產(chǎn)油綠藻之一， 在生物柴油、水產(chǎn)養(yǎng)殖和環(huán)境治理方面， 已有較多的研究［20］。纖維藻和單針藻是近年生物柴油藻種篩選過程中常見藻種， 具有較高的油脂含量和較快的生長(zhǎng)速率［21］。在本研究中單針藻HSJG162和HSJ164為耐受NaHCO3的藻株， 由于其培養(yǎng)基離子濃度和pH都較高， 在培養(yǎng)時(shí)可以降低其他微生物的污染。

比較這6株藻在高氮和低氮條件下的產(chǎn)油情況， 發(fā)現(xiàn)HSJ354和HSJG162低氮培養(yǎng)時(shí)總脂含量卻有所下降。這不同于以往低氮培養(yǎng)可以提高油脂積累量的結(jié)論［5］。在不同的氮濃度培養(yǎng)條件下， 藻株的油脂積累速率差異極為顯著: 在培養(yǎng)基中NaNO3濃度為1.50 g/L時(shí)均有較高的油脂積累速率， 是其在NaNO3濃度為0.15 g/L時(shí)的2—6倍。這幾株藻在以后的優(yōu)化培養(yǎng)中， 需要進(jìn)一步研究氮濃度與產(chǎn)油量和產(chǎn)油率的關(guān)系。

單針藻HSJG162在光合自養(yǎng)條件下其總脂含量可達(dá)細(xì)胞干重的（46.5±2.3）%， 同時(shí)具有相對(duì)較高的油脂積累速率（158.1±9.1） mg/（L·d）， 高于多數(shù)已報(bào)道的自養(yǎng)培養(yǎng)條件下的產(chǎn)油微藻［5，21］。與多數(shù)藻種相比， 它還能夠在高NaHCO3條件下生長(zhǎng)； 而與本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的耐NaHCO3藻株相比， 它又具有更高的油脂產(chǎn)率。優(yōu)良的生物柴油對(duì)脂肪酸鏈的長(zhǎng)度和不飽和度有一定要求， 應(yīng)有較高的C16和C18含量， 尤其是C16:0（軟脂酸）和C18:1（油酸）， 這樣有利于提高生物柴油的抗氧化性能，便于長(zhǎng)久保存［22］。HSJG162的總脂和甘油三酯的脂肪酸組成相似， 都以C16和C18為主， 且大多為飽和與單一不飽和脂肪酸， 多不飽和脂肪酸含量較低。從產(chǎn)油性能、耐受NaHCO3能力和脂肪酸組成等方面考慮， HSJG162是一株較具生產(chǎn)潛力的藻種。

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SELECTION AND IDENTIFICATION OF A NaHCO3-TOLERANT HIGH-OIL-CONTENT GREEN ALGAE

ZHOU Hong1，2， GAO Hong1， XU Xu-Dong1and KONG Ren-Qiu1
（1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology， Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China； 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

生物柴油； 產(chǎn)油綠藻； 篩選； 脂肪酸組成

Biodiesel； Oleaginous green algae； Strain screening； Fatty acid composition

10.7541/2016.54

Q949.21

A

1000-3207（2016）02-0408-06

2015-04-08；

2015-08-16

科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)課題: 中國(guó)產(chǎn)油微藻調(diào)查（2012FY112900-04）資助 ［Supported by Special Project of Science and Technology Foundational Work: Survey of Oleaginous Microalgae in China］

周虹（1989—）， 女， 陜西咸陽(yáng)人； 碩士研究生； 研究方向藻類生物技術(shù)。E-mail: zhou1989hong@163.com

孔任秋， E-mail: kongr@ihb.ac.cn