納米氧化鋅對(duì)斑馬魚鰓組織的氧化損傷

劉 林 趙群芬

研究簡(jiǎn)報(bào)

納米氧化鋅對(duì)斑馬魚鰓組織的氧化損傷

劉 林 趙群芬

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院， 寧波 315211）

納米顆粒是指粒徑在1—100 nm， 表面積較大， 具有塊狀顆粒所沒有的特有性質(zhì)。由于納米顆粒具有獨(dú)特的理化性質(zhì)， 近年來合成和生產(chǎn)納米顆粒的產(chǎn)量大大增加［1］。納米氧化物顆粒在科研和工業(yè)產(chǎn)品的應(yīng)用正在逐年增加， 科學(xué)家預(yù)測(cè)依靠納米技術(shù)創(chuàng)造的產(chǎn)品產(chǎn)生的價(jià)值， 到2015年可能達(dá)到1萬億美元［2］。隨著納米顆粒的使用， 它對(duì)人類健康和環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。因此了解納米顆粒的不利影響， 確定對(duì)生物的影響， 確保納米材料的安全使用是十分必要的［3］。

鰓是魚類的呼吸器官， 它直接與水環(huán)境接觸， 是污染物發(fā)揮毒性作用的主要靶器官， 其結(jié)構(gòu)和生理變化可以直接反應(yīng)污染物對(duì)魚的毒害程度［4］。如甲砜霉素能引起松浦鏡鋰（Cyprinus carpio L.）鰓上皮細(xì)胞輕微腫脹， 并隨著給藥劑量的增加， 腫脹現(xiàn)象嚴(yán)重［5］； 重金屬鎘和汞離子能引起鯉鰓組織出現(xiàn)鰓小片頂端充血， 呈球狀或棒狀， 鰓小片彎曲， 上皮腫脹， 甚至出現(xiàn)鰓小片細(xì)胞脫落， 嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)鰓小片解體［6］。納米銅顆粒能引起鰓組織水腫， 鰓絲棒狀化， 鰓絲畸形增長(zhǎng)， 鰓絲溶解等炎癥［7］。

人工合成的納米氧化鋅顆粒（nZnO）應(yīng)用于藥品、牙膏、化妝品、防嗮霜、紡織品和涂料中［8］， 生產(chǎn)和使用時(shí)不可避免的向環(huán)境中釋放， 從而給環(huán)境造成潛在的風(fēng)險(xiǎn)［9］。生物體生活在nZnO污染的環(huán)境中能造成組織的病變， 組織病理能快速和有效檢測(cè)納米顆粒處理對(duì)組織或器官產(chǎn)生的不利影響［10］， 魚體內(nèi)抗氧化酶對(duì)環(huán)境污染物非常敏感， 可作為生物標(biāo)記物評(píng)估水體中污染物的污染程度［11］。水生生物特別是魚類比哺乳動(dòng)物對(duì)納米顆粒的毒害更敏感［10］， 可用于檢測(cè)水體中低濃度的納米顆粒的毒性。鯉暴露于nZnO溶液中21d后， 鰓組織受到不同程度的損傷， 鰓小片上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹， 并伴有變性、脫落， 浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞一起填滿整個(gè)鰓小片間隙， 使鰓絲呈棍狀［12］； 0.5、5和50 mg/L的nZnO處理鯉14d內(nèi)， 使鰓中SOD、GSH-PX活性升高， 并引起鰓組織的氧化損傷［13］。組織的氧化損傷是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， 過多的活性氧可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)多種環(huán)境污染物質(zhì)可以誘導(dǎo)凋亡基因的表達(dá)而對(duì)凋亡產(chǎn)生影響， 如苯并芘能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族的表達(dá)對(duì)Daudi細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響［14］。然而有關(guān)nZnO對(duì)鰓的毒性研究， 大多停留在生理水平檢測(cè)或組織損傷觀察上， 缺少nZnO對(duì)鰓組織毒性機(jī)理的研究。本研究以成年斑馬魚（Danio rerio）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象， 通過nZnO誘導(dǎo)斑馬魚鰓組織損傷、抗氧化酶活性的變化和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的影響， 探討nZnO暴露下對(duì)鰓組織產(chǎn)生氧化脅迫后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響， 對(duì)進(jìn)一步研究納米材料的生態(tài)效應(yīng)和水生態(tài)環(huán)境安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藍(lán)色斑馬魚購(gòu)于寧波市天勝花鳥市場(chǎng)， 魚齡120d左右， 雌雄各半， 平均體重為（0.36±0.1） g， 平均體長(zhǎng)為（3.00±0.6） cm， 馴養(yǎng)用水為自來水曝氣12h， 水溫（26±0.5）℃， 光照/黑暗周期為14h︰10h， 每日投喂2次， 馴養(yǎng)7d后用于急性毒理實(shí)驗(yàn)， 為保證試驗(yàn)期間水質(zhì)， 試驗(yàn)期間停止投喂餌料。

nZnO ［（25±2） nm］: 購(gòu)于杭州大洋納米新材料有限公司。RNAiso Plus試劑、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ （Tli RNaseH Plus）試劑購(gòu)于大連TaKaRa公司。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所。

1.2 方法

選擇健康斑馬魚進(jìn)行毒理實(shí)驗(yàn)， 實(shí)驗(yàn)組nZnO濃度設(shè)為0.05、0.1、5、10、25和50 mg/L， 另設(shè)對(duì)照組， 每組3個(gè)平行， 暴露試驗(yàn)參照GB/T13276—1991， 處理4h、24h和96h后解剖取鰓組織， 部分鰓組織加入RNA保存液（-80℃保存）用于RNA提取。余下鰓組織加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（0.01 mol/L Tris-HCl、0.001 mol/L EDTA-2Na、0.01 mol/L蔗糖， pH 7.4）研磨， 4℃， 2000—4000 r/min離心10min， 取上清用于抗氧化指標(biāo)測(cè)定。另取處理7、15和30d斑馬魚鰓組織， 固定于10%甲醛中， 用于石蠟切片的制作。

斑馬魚鰓組織形態(tài)學(xué)觀察 取固定于甲醛中的鰓組織， 酒精脫水， 浸蠟、石蠟包埋， 切片機(jī)切片、脫蠟、HE染色， 中性樹膠封片， Nikon顯微鏡觀察并拍照。

鰓組織中抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)樣品中上清液的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定； MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性測(cè)定均按試劑盒說明書操作。

MDA以每mg組織蛋白中MDA的nmol數(shù)表示；SOD以每mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）； GSHPX的活力規(guī)定為每毫克蛋白， 每分鐘扣除非酶促反應(yīng)的作用， 使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位。

鰓組織中凋亡基因的檢測(cè) 根據(jù)GenBank中斑馬魚Bcl-2基因序列、p53基因序列、MDM2基因序列和Bax基因序列， 以斑馬魚β-actin基因?yàn)閮?nèi)參， 設(shè)計(jì)Bcl-2、MDM2、p53、Bax和β-actin基因引物（表 1）。引物由上海生工有限公司完成， 選取處理4、24和96h實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的鰓組織， 參考RNAiso Plus （TakaRa）試劑提取總RNA， A260/A280為1.90左右。根據(jù)PrimescriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （TakaRa）試劑盒將各樣品總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系（20 μL）: SYBR Premix Ex TaqTMⅡ （2×） 10 μL、正向及反向引物各0.8 μL、cDNA模板2 μL、超純水6.4 μL。擴(kuò)增條件為: 預(yù)變性95℃ 3min， 40個(gè)循環(huán)（95℃ 20s， 57℃ 30s， 72℃ 25s）， 反應(yīng)結(jié)束后制備溶解曲線。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔， 為排除假陽性結(jié)果， 所有檢測(cè)樣品均包含1個(gè)無模板的陰性對(duì)照。采用2-ΔΔCt法分析熒光定量結(jié)果［15］。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（One Way ANOVA）， 顯著性檢測(cè)采用Tukey’s test多重比較； P＜0.05為顯著性差異， P＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚鰓組織結(jié)構(gòu)的變化

表 1 目的基因及內(nèi)參基因的引物Tab. 1 Primers of target and internal control genes

圖 1 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effect of nZnO on structural change in gill of zebrafish （HE stain×400）

圖 1所示為nZnO處理下斑馬魚鰓組織的結(jié)構(gòu)變化，對(duì)照組鰓絲兩側(cè)排列著鰓小片（a-1、a-2、a-3）， 鰓小片由上皮扁平細(xì)胞和柱狀細(xì)胞構(gòu)成， 上皮細(xì)胞單層扁平細(xì)胞排列在鰓小片表面， 柱狀細(xì)胞在鰓小片內(nèi)側(cè)， 細(xì)胞核呈圓或橢圓形， 對(duì)照組15d時(shí)鰓絲中央靜脈血竇明顯可見（a-2）。與對(duì)照組相比， 最低濃度（0.05 mg/L）組在處理7d出現(xiàn)鰓上皮細(xì)胞脫落（b-1、b-2）， 隨著暴露濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)， 其他實(shí)驗(yàn)組也發(fā)現(xiàn)相似現(xiàn)象（c-2、f-2、f-3、g-3）； 0.1 mg/L組在處理7d就發(fā)現(xiàn)鰓上皮細(xì)胞增生現(xiàn)象（c-1）， 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)較低濃度（0.05 mg/L）組也觀察到相同現(xiàn)象（b-2）； 低濃度（5 mg/L）組在處理15d 時(shí)出現(xiàn)鰓小片邊際通道擴(kuò)張 （d-2）， 隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)， 0.05 mg/ L組也表現(xiàn)為鰓小片邊際通道擴(kuò)張的現(xiàn)象（b-3）； 其他實(shí)驗(yàn)組還觀察到鰓絲血管擴(kuò)張（c-1）， 淋巴細(xì)胞增多（e-1）， 并伴有部分細(xì)胞壞死形成炎癥聚集（e-1、f-2）， 在高濃度（50 mg/L）組還發(fā)現(xiàn)鰓小片基部細(xì)胞有空泡化（g-2）和大量鰓上皮細(xì)胞脫落鰓絲呈棍狀化的現(xiàn)象（g-3）。

2.2 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織中抗氧化酶活性的影響

nZnO脅迫下斑馬魚鰓中SOD活性的變化 如圖2所示為斑馬魚鰓中SOD活性變化， 處理4h， 實(shí)驗(yàn)組斑馬魚鰓中的SOD活性升高， 且高濃度（25 和50 mg/L）組SOD活性極顯著增加（P＜0.01）， 是對(duì)照組的1.41倍、2.07倍； 處理24h， 低濃度（0.05、0.1和5 mg/L）組， SOD活性高于對(duì)照組， 在其他濃度下， SOD活性均低于對(duì)照組；暴露96h后， 實(shí)驗(yàn)組鰓中SOD活性均低于對(duì)照組。

nZnO脅迫下斑馬魚鰓中MDA含量的變化nZnO暴露下斑馬魚鰓組織中MDA含量變化（圖 3）， 實(shí)驗(yàn)組斑馬魚鰓中MDA含量均高于對(duì)照組， 各個(gè)時(shí)刻下， 處理濃度為10 mg/L組， 鰓中MDA含量達(dá)最大， 分別是對(duì)照組的2.52倍、1.91倍和1.45倍。

圖 2 斑馬魚鰓中SOD活性的變化Fig. 2 Changes of SOD activity in zebrafish gill

圖 3 斑馬魚鰓中MDA含量的變化Fig. 3 Changes of MDA content in zebrafish gill

nZnO脅迫下斑馬魚鰓中GSH-PX活性的影響 從圖 4可見， nZnO脅迫4h后， 鰓中GSH-PX活性被誘導(dǎo)激活，呈上升趨勢(shì)； 在處理24h后， 低濃度（0.05和0.1 mg/ L）組GSH-PX活性升高， 而在其他濃度下， GSH-PX活性均下降； 處理96h， GSH-PX活性下降。

圖 4 斑馬魚鰓中GSH-PX活性的變化Fig. 4 Changes of GSH-PX activity in zebrafish gill

2.3 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織中p53、MDM2、Bax、Bcl-2基因表達(dá)量的影響

nZnO對(duì)斑馬魚鰓中Bcl-2基因的影響 如圖 5所示為在nZnO脅迫下， 斑馬魚鰓組織中Bcl-2基因表達(dá)量的變化， 與對(duì)照組相比， 處理4h， 鰓中Bcl-2基因表達(dá)量均升高， 在濃度為50 mg/L時(shí)Bcl-2基因表達(dá)量最高， 是對(duì)照組的3.95倍； 暴露24h， 低濃度（0.05 和0.1 mg/L）組和高濃度（50 mg/L）組， Bcl-2基因表達(dá)量升高， 而在中濃度（5、10和25 mg/L）組Bcl-2基因表達(dá)量均降低； 處理96h， 除5 mg/ L 組外， 其余各實(shí)驗(yàn)組中Bcl-2基因表達(dá)量均高于對(duì)照組。

圖 5 nZnO對(duì)斑馬魚鰓中Bcl-2基因的影響Fig. 5 Effects of the nZnO of Bcl-2 in zebrafish gill

nZnO對(duì)斑馬魚鰓中Bax基因的影響 由圖 6可見，斑馬魚鰓中Bax基因表達(dá)量的變化， 處理4h， 低濃度組（0.05、0.1和5 mg/L）， Bax基因表達(dá)量升高， 其他濃度組Bax基因表達(dá)量降低； 暴露24h和96h， Bax基因表達(dá)量均升高， 處理24h， 濃度為0.1 mg/L組Bax基因表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）， 是對(duì)照組的2.68倍； 處理96h， 50 mg/L組Bax基因表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）， 是對(duì)照組的3.95倍。

圖 6 nZnO對(duì)斑馬魚鰓中Bax基因的影響Fig. 6 Effects of the nZnO of Bax in zebrafish gill

nZnO對(duì)斑馬魚鰓中p53基因的影響 圖 7所示為nZnO脅迫下斑馬魚鰓中p53基因表達(dá)量的變化， 處理4、24和96h， 鰓中p53基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組， 處理4h，50 mg/L組p53基因的表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）， 是對(duì)照組的3.79倍， 暴露96h時(shí)濃度為0.1 mg/L 組p53基因的表達(dá)量達(dá)最大， 是對(duì)照組的4.77倍。

圖 7 nZnO對(duì)斑馬魚鰓中p53基因的影響Fig. 7 Effects of the nZnO of p53 in zebrafish gill

nZnO對(duì)斑馬魚鰓中MDM2基因的影響 斑馬魚鰓中MDM2基因表達(dá)量的變化（圖 8）， 實(shí)驗(yàn)組斑馬魚鰓中MDM2基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組， 處理4h， 10 mg/L組MDM2基因表達(dá)量達(dá)最大， 是對(duì)照組的6.64倍； 處理24h，濃度為0.1 mg/L組MDM2基因表達(dá)量極顯著升高（P＜ 0.01）， 是對(duì)照組的4.91倍； 暴露96h， 低濃度（0.05 mg/L）組， MDM2基因表達(dá)量最高， 是對(duì)照組的6.98倍。

圖 8 nZnO對(duì)斑馬魚鰓中MDM2基因的影響Fig. 8 Effects of the nZnO of MDM2 in zebrafish gill

3 討論

nZnO能通過皮膚、鰓等組織進(jìn)入到魚體內(nèi)， 從而引起一系列生理生化反應(yīng)， 并且能誘導(dǎo)鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化， 同時(shí)還能引起凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的變化。鰓是魚類的呼吸器官， 也是吸收有毒物質(zhì)的主要場(chǎng)所， 它直接與水環(huán)境接觸， 可以比其他組織更迅速積累污染物， 因此易因水體污染而造成組織損傷。

3.1 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

環(huán)境污染物能造成魚類鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。環(huán)境污染物會(huì)誘導(dǎo)鰓中過多的氧自由基攻擊細(xì)胞膜， 細(xì)胞膜受損， 釋放細(xì)胞內(nèi)含物， 細(xì)胞壞死， 鰓上皮細(xì)胞脫落［16］， 出現(xiàn)鰓小片脫落現(xiàn)象， 甚至鰓絲呈棍狀化［5］。同時(shí)鰓絲血管擴(kuò)張， 物質(zhì)交換能力增加， 從而減輕有毒物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損傷。但物質(zhì)交換能力的變化， 會(huì)造成細(xì)胞中液體滯留而導(dǎo)致上皮細(xì)胞水腫［15，6］， 水體中有害物也能誘使鰓中淋巴細(xì)胞增多， 減輕環(huán)境污染物對(duì)鰓的損傷， 鰓中壞死的細(xì)胞能聚集形成炎癥聚集［17，18］。有研究者將鰓組織細(xì)胞受到外界毒物脅迫時(shí)造成的損傷劃分為兩大類: 一是因防御反應(yīng)而產(chǎn)生的損傷， 包括鰓絲上皮細(xì)胞肥大和增生，鰓小片呼吸上皮水腫等； 二是直接造成的損傷， 包括鰓上皮脫落與壞死等［19］。在本研究中， 低濃度（0.05 mg/L）組首先出鰓絲上皮細(xì)胞增生， 上皮細(xì)胞水腫， 并伴有鰓絲上皮細(xì)胞的脫落， 說明nZnO可以從多個(gè)途徑對(duì)鰓組織細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用， 造成鰓組織的防御反應(yīng)和直接損傷同時(shí)產(chǎn)生； 隨著濃度的增大， 0.1 mg/L組出現(xiàn)血管擴(kuò)張， 說明nZnO能誘導(dǎo)血液流通增大， 物質(zhì)的交換能力增加， 增大物質(zhì)的吸收能力， 來維持生物體正常的機(jī)能； 高濃度組出現(xiàn)細(xì)胞空泡化現(xiàn)象， 淋巴細(xì)胞增多， 大量上皮細(xì)胞壞死，上皮細(xì)胞脫落呈棍狀化， 說明隨著nZnO濃度增大， 能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧引起組織損傷。

3.2 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織中抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是清除超氧陰離子（O2-·）的專一性酶， 在生物體內(nèi)最先與O2-·結(jié)合， 將其分解為H2O2和O2， 是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一［20］。大量研究表明， 當(dāng)水生生物受到外來污染物脅迫時(shí)， 機(jī)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的SOD清除組織中過多的超氧陰離子， 保護(hù)機(jī)體免受損傷［21］； 然而當(dāng)環(huán)境污染物濃度過高或生物體長(zhǎng)期生活在污染環(huán)境中時(shí)， 生物體的抗氧化系統(tǒng)造成損傷， 甚至?xí)鸾M織中SOD活性的下降［22］。研究者發(fā)現(xiàn)納米鎳能引起羅非魚鰓組織中SOD活力呈先升高后下降的趨勢(shì)［23］；在本研究中實(shí)驗(yàn)組在暴露的起始階段， 斑馬魚鰓組織中SOD活性升高， 清除活性氧自由基， 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加， 鰓組織抗氧化酶系統(tǒng)紊亂， SOD活性下降， 說明隨著nZnO濃度增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)， 鰓組織氧化受到損傷。

MDA是細(xì)胞膜系統(tǒng)受損傷的指標(biāo)之一， 是脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物， 在一定程度上， 根據(jù)MDA含量能評(píng)估組織的受損情況［24］。研究者發(fā)現(xiàn)， nZnO能誘使過多的氧自由基攻擊細(xì)胞膜， 使椎實(shí)螺（Lymnaea luteola L.）［25］和鯉［26］體內(nèi)的MDA含量升高。鰓組織在受到nZnO誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生過多的自由基， 攻擊細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸， 使細(xì)胞膜破壞， 造成過多的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）， 本研究結(jié)果顯示， 處理24h內(nèi)， 鰓中MDA含量先升高后下降， 高濃度（25和50 mg/L）組MDA含量低于中濃度（10 mg/L）組， 可能是高濃度組中nZnO沉積造成其毒性下降， 一定濃度范圍內(nèi)的nZnO處理， 使組織中MDA含量逐漸增加， 說明隨著處理濃度的增加鰓組織受損程度加重， 而高濃度組nZnO沉積使得魚類不能通過鰓呼吸進(jìn)入到生物體內(nèi)因而造成其毒性下降。

GSH-PX能分解有機(jī)和無機(jī)形式的過氧化物， 可以催化有機(jī)過氧化物（ROOH）轉(zhuǎn)變?yōu)镽OH， 可以在過氧化氫酶（CAT）含量低或者組織中H2O2產(chǎn)量低的組織中代替CAT清除H2O2， 進(jìn)而防止機(jī)體造成損傷［27］。研究者發(fā)現(xiàn)，沙蠶（Nereis succinea）暴露于2.5 μg/g的納米銀中1d后體內(nèi)的GSH-PX活性升高， 在較高濃度（5和10 μg/g）組GSHPX活性下降， 處理4d后， 沙蠶體內(nèi)的GSH-PX活性均顯著下降（P＜0.05）［28］； 研究者在重金屬鎘（Cd2+）對(duì)尖紫蛤（Sanguinolaria acuta）的鰓毒性中發(fā)現(xiàn)， Cd2+能導(dǎo)致鰓中GSHPX活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)［29］； 生物體能通過適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)體的相關(guān)生理機(jī)能活動(dòng)， 從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)清除活性氧自由基的能力。本研究中也發(fā)現(xiàn): nZnO處理短時(shí)間內(nèi)（4h）， 使鰓組織中GSH-PX活性升高，是生物體內(nèi)的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)能， 而隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)鰓中GSH-PX活性的降低， 可能是過多的氧自由基造成斑馬魚抗氧化系統(tǒng)功能損傷， 影響機(jī)體內(nèi)自由基的代謝平衡， 引起魚體的其他生理功能下降。

3.3 nZnO對(duì)斑馬魚鰓組織中p53、MDM2、Bax、Bcl-2基因表達(dá)量的影響

Bcl-2蛋白家族通過調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡通路， 在凋亡信號(hào)引起的細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用， 其中Bcl-2和Bax分別屬于Bcl-2家族中的抗凋亡和前凋亡基因［30］， Bcl-2和Bax的比值決定了細(xì)胞凋亡的敏感性［31，32］。研究報(bào)道， 羥基磷灰石納米粒子使組織中Bax/Bcl-2的比值升高， 并推測(cè)Bax/Bcl-2比值的升高可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［33］。也有研究者發(fā)現(xiàn)環(huán)境污染物能改變斑馬魚組織中Bax/Bcl-2的比值， 進(jìn)而介導(dǎo)線粒體細(xì)胞色素c的釋放， 從而引起細(xì)胞凋亡［34］。在本研究中發(fā)現(xiàn)， 處理4h后鰓中Bax/Bcl-2的比值減小， 而在暴露24h、96h后Bax/Bcl-2的比值增大， 說明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，nZnO能誘導(dǎo)鰓組織細(xì)胞發(fā)生凋亡。

p53能通過激活它的下游途徑調(diào)控凋亡， 它能誘導(dǎo)應(yīng)激信號(hào)引起凋亡［35］， 當(dāng)生物受到外界脅迫時(shí)p53的表達(dá)水平則明顯增加。MDM2能負(fù)向調(diào)節(jié)p53誘導(dǎo)凋亡的能力，MDM2還可以降解p53， MDM2可能是p53最重要的抑制因子。有研究報(bào)道， 納米二氧化硅包被氧化錳能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞、L929細(xì)胞中p53基因表達(dá)量升高， 能激活蛋白酶活性從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生［36］。本研究也發(fā)現(xiàn)， 實(shí)驗(yàn)組鰓中p53基因和MDM2基因表達(dá)量升高， 說明nZnO能激活氧化應(yīng)激信號(hào)， 使鰓中p53基因和MDM2基因表達(dá)量的升高， 進(jìn)一步驗(yàn)證了nZnO能誘導(dǎo)鰓組織中細(xì)胞發(fā)生凋亡。

p53參與多種生物學(xué)過程， 包括DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等過程［37］， 當(dāng)組織中活性氧自由基含量過高時(shí)， p53誘導(dǎo)能引起的Bax和PUMA等基因的表達(dá)， 同時(shí)抑制抗氧化酶基因的表達(dá)， 使機(jī)體處于高強(qiáng)度的氧化應(yīng)激狀態(tài)， 最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［38］。p53、Bcl-2、Bax基因的表達(dá)量能作為細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志物， 這種標(biāo)志物在環(huán)境毒理學(xué)中將發(fā)揮重要作用， 不僅能反應(yīng)環(huán)境污染物早起作用并能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)生物可能的有害影響，而且還能研究污染物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響并揭示污染物致病機(jī)理提供重要的參考價(jià)值［39］。本研究發(fā)現(xiàn)在nZnO脅迫下， 斑馬魚除了鰓組織受到損傷， 抗氧化酶活性發(fā)生變化外， 鰓中p53和MDM2基因的表達(dá)量升高， Bax/Bcl-2比值也發(fā)生變化， 這在以往研究納米材料對(duì)生物的毒性文獻(xiàn)中未見報(bào)道， 說明nZnO不僅僅是誘發(fā)斑馬魚鰓組織發(fā)生氧化損傷， 還會(huì)進(jìn)一步引起鰓組織中細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

［1］Nel A， Xia T， M?dler L， et al. Toxic potential of materials at the nanolevel ［J］. Science， 2006， 311（5761）: 622—627

［2］Kumar V， Kumari A， Guleria P， et al. Evaluating the Toxicity of Selected Types of Nanochemicals ［M］. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. Springer New York. 2012， 39—121

［3］Hristozovd R， Gottardos， Critto A， et al. Risk assessment of engineered nanomaterials: a review of available data and approaches from a regulatory perspective ［J］. Nanotoxicology， 2012， 6（8）: 880—898

［4］Alazemi B M， Lewis J W， Andrews E B. Gill damage in the freshwater fish Gnathonemus petersii （Family: Mormyridae） exposed to selected pollutants: an ultrastructural study ［J］. Environmental Technology， 1996，17（3）: 225—238

在一定濃度nZnO脅迫下， 斑馬魚鰓上皮細(xì)胞增生，鰓絲脫落， 部分細(xì)胞空泡化， 鰓絲棍狀化等。nZnO能引起鰓中MDA含量的增加， SOD、GSH-PX活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)， 抗氧化酶活性的變化能調(diào)節(jié)機(jī)體生理平衡， 使其免受氧化脅迫的損傷。nZnO暴露能引起鰓中Bax/Bcl-2的mRNA的表達(dá)量比值升高； p53、MDM2的mRNA表達(dá)量升高， 說明nZnO可以誘導(dǎo)鰓組織細(xì)胞凋亡。

［5］Yang H B， Wang D， Lu T Y. The tissue damage to songpu mirror carp （Cyprinus carpio L.） using thiamphenicol by oral administration ［J］. China Fishery Quality and Standards， 2014， （3）: 54—59 ［楊洪波， 王荻， 盧彤巖. 口灌甲砜霉素對(duì)松浦鏡鯉組織的損傷. 中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)， 2014， （3）: 54—59］

［6］Guan H H， Lin Y H. Constitution and the tolerance of several heavy metal on the gill tissue of carp ［J］. Chinese Journal of Fisheries， 2004， 17（1）: 68—71 ［關(guān)海紅， 藺玉華. 鯉魚鰓組織結(jié)構(gòu)及鰓對(duì)重金屬離子的耐受性. 水產(chǎn)學(xué)雜志， 2004， 17（1）: 68—71］

［7］Al—Bairuty G A， Shaw B J， Handy R D， et al. Histopathological effects of waterborne copper nanoparticles and copper sulphate on the organs of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss） ［J］. Aquatic Toxicology， 2013， 126: 104—115

［8］Ma H， Williams P L， Diamond S A. Ecotoxicity of manufactured ZnO nanoparticles-a review ［J］. Environmental Pollution， 2013， 172: 76—85

［9］Farré M， Gajda—Schrantz K， Kantiani L， et al. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment ［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2009，393（1）: 81—95

［10］Delistraty D， Taylor B， Anderson R. Comparisons of acute toxicity of selected chemicals to rainbow trout and rats ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 1998，39（3）: 195—200

［11］Oliveira M， Pacheco M， Santos M A. Organ specific antioxidant responses in golden grey mullet （Liza aurata） following a short-term exposure to phenanthrene ［J］. Science of the Total Environment， 2008， 396（1）: 70—78

［12］Cao J L， Chen J J， Wang J D. Effects of nano-ZnO on microstructure and ultrastructure of the gill of carp （Cyprinus carpio） ［J］. Journal of Chinese Electron Microscopysociety， 2012， 30（6）: 561—566 ［曹謹(jǐn)玲， 陳劍杰， 王俊東. 納米氧化鋅對(duì)鯉魚鰓顯微和超微結(jié)構(gòu)的影響. 電子顯微學(xué)報(bào)， 2012， 30（6）: 561—566］

［13］Hao L， Chen L. Oxidative stress responses in different organs of carp （Cyprinus carpio） with exposure to ZnO nanoparticles ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety，2012， 80: 103—110

［14］Salas V M， Burchiel S W. Apoptsis in Dauli Human B cells in response to benzo［a］ pyrene and benzo［a］ pyrene-7， 8-dihydrodid ［J］. Toxicology and Applied Pharmacology， 1998， 151（2）: 367—376

［15］Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔctmethod ［J］. Methods， 2001， 25（4）: 402—408

［16］Al—Bairuty G A， Shaw B J， Handy R D， et al. Histopathological effects of waterborne copper nanoparticles and copper sulphate on the organs of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss） ［J］. Aquatic Toxicology， 2013， 126: 104—115

［17］de Souza Filho J， Matsubara E Y， Franchi L P， et al. Evaluation of carbon nanotubes network toxicity in zebrafish（Danio rerio） model ［J］. Environmental Research， 2014，134: 9—16

［18］da Cruz A L， Prado T M，dasilva Maciel L A， et al. Environmental effects on the gills and blood of Oreochromis niloticus exposed to rivers of Bahia， Brazil ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2015， 111: 23—31

［19］PoleksiéV， Karan V. Effects of trifluralin on carp: biochemical and histological evaluation ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 1999， 43（2）: 213—221

［20］Xiong D W， Fang T， Chen X D， et al. Oxidative stress effects and damage of nanoscale TiO2and ZnO on zebrafish ［J］. Environmental Science， 2010， 31（5）: 1320—1327 ［熊道文， 方濤， 陳旭東， 等. 納米材料對(duì)斑馬魚的氧化損傷及應(yīng)急效應(yīng)研究. 環(huán)境科學(xué)， 2010，31（5）: 1320—1327］

［21］Kelly K A， Havrilla C M， Brady T C， et al. Oxidative stress in toxicology: established mammalian and emerging piscine model systems ［J］. Environmental Health Perspectives， 1998， 106（7）: 375—384

［22］Wang T， Long X， Cheng Y， et al. The potential toxicity of copper nanoparticles and coppersulphate on juvenile Epinephelus coioides ［J］. Aquatic Toxicology， 2014， 152: 96—104

［23］Chidambaram J， Abdul A R， Rajendiran R， et al. Effect of sub-acute exposure to nickel nanoparticles on oxidative stress and histopathological changes in Mozambique tilapia， Oreochromis mossambicus ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2014， 107: 220—228

［24］Shi Q， Zhu Z， Xu M， et al. Effect of excess manganese on the antioxidant system in Cucumis sativus L. under two light intensities ［J］. Environmental and Experimental Botany， 2006， 58（1）: 197—205

［25］Boyle D， Al-Bairuty G A， Ramsden C S， et al. Subtle alterations in swimming speed distributions of rainbow trout exposed to titanium dioxide nanoparticles are associated with gill rather than brain injury ［J］. Aquatic Toxicology， 2013， 126: 116—127

［26］Hao L， Chen L， Hao J， et al. Bioaccumulation and subacute toxicity of zinc oxide nanoparticles in juvenile carp（Cyprinus carpio）: a comparative study with its bulk counterparts ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety，2013， 91: 52—60

［27］Elia A C， Anastasi V， D?rr A J M. Hepatic antioxidant enzymes and total glutathione of Cyprinus carpio exposed to three disinfectants， chlorine dioxide， sodium hypochlorite and peracetic acid， for superficial water potabilization ［J］. Chemosphere， 2006， 64（10）: 1633—1641

［28］Cozzari M， Elia A C， Pacini N， et al. Bioaccumulation and oxidative stress responses measured in the estuarine ragworm （Nereis diversicolor） exposed to dissolved，nano-and bulk-sized silver ［J］. Environmental Pollution，2015， 198: 32—40

［29］Deng S P， Zhao Y T， Zhu C H， et al. Effect of cadmium on the antioxidant enzyme activity and lipid peroxidation in sanguinolaria acuta ［J］. Acta Hydrobiologica Sinica，2012， 36（4）: 689—695 ［鄧思平， 趙云濤， 朱春華， 等. 鎘對(duì)尖紫蛤抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化的影響. 水生生物學(xué)報(bào)， 2012， 36（4）: 689—695］

［30］Autret A， Martin S J. Bcl-2 family proteins and mitochondrial fission/fusion dynamics ［J］. Cellular and Molecular Life Sciences， 2010， 67（10）: 1599—1606

［31］Ferrer I， Planas A M í. Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia: life and death struggle in the penumbra ［J］. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology， 2003， 62（4）: 329—339

［32］Pollack M， Phaneuf S， Dirks A， et al. The role of apoptosis in the normal aging brain， skeletal muscle， and heart［J］. Annals of the New York Academy of Sciences， 2002，959（1）: 93—107

［33］Hu W， Feng Z， Levine A J. The regulation of multiple p53 stress responses is mediated through MDM2 ［J］. Genes & Cancer， 2012， 3（3—4）: 199—208

［34］Jiang J， Wu S， Wu C， et al. Embryonic exposure to carbendazim induces the transcription of genes related to apoptosis， immunotoxicity and endocrine disruption in zebrafish （Danio rerio） ［J］. Fish & Shellfish Immunology，2014， 41（2）: 493—500

［35］Trevisan R， Fleschs， Mattos J J， et al. Zinc causes acute impairment of glutathione metabolism followed by coordinated antioxidant defenses amplification in gills of brown mussels Perna perna ［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology， 2014， 159: 22—30

［36］Wang L， Wang L J， Zhang F， et al. Cytotoxicity of ZnO nanoparticles in human lung cancer cell lines A549 ［J］. Journal of the Graduate School of the Chinese Academy of Sciences， 2009， 26（1）: 83—90 ［王琳， 王莉娟， 張芳，等. 納米氧化鋅對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的毒性. 中國(guó)科學(xué)院研究生學(xué)報(bào)， 2009， 26（1）: 83—90］

［37］Li T， Kon N， Jiang L， et al. Tumor suppressions in the absence of p53-mediated cell-cycle arrest， apoptosis， and senescence ［J］. Cell， 2012， 149（6）: 1269—1283

［38］Qi Zh， Liu Y F， Luos W， et al. Molecular cloning， characterization and expression analysis of tumor suppressor protein p53 from orange-spotted grouper， Epinephelus coioides in response to temperature stress ［J］. Fish & Shellfish Immunology， 2013， 35（5）: 1466—1476

［39］Xu L H. Molecular basis of apoptosis-related integrated biomarkers and its significance in environmental toxicology ［J］. Acta Hydrobiologica Sinica， 2005， 29（3）: 329—335 ［徐立紅. 細(xì)胞凋亡相關(guān)的結(jié)合生物標(biāo)志物的分子基礎(chǔ)及其在環(huán)境毒理學(xué)中的意義. 水生生物學(xué)報(bào)，2005， 29（3）: 329—335］

OXIDATIVE DAMAGE RESPONSES ON GILL TISSUES OF ZEBRAFISH WITH EXPOSURE TO ZINC DIOXIDE NANOPARTICLES

LIU Lin and ZHAO Qun-Fen
（School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo 315211， China）

斑馬魚； nZnO； 鰓組織； 氧化損傷

Zebrafish； Zinc dioxide nanoparticles； Gill tissues； Oxidative damage

X171.5

A

1000-3207（2016）02-0395-08

10.7541/2016.52

2015-05-28；

2015-10-10

水產(chǎn)學(xué)浙江省重中之重（一級(jí)）學(xué)科開放基金（xkzsc1415）資助 ［Supported by the Opening Project of Zhejiang Provincial Top Key Discipline of Fisheries （No. xkzsc1415）］

劉林（1987—）， 男， 河南周口人； 碩士研究生； 主要從事納米材料毒理學(xué)研究。E-mail: liuxiaolin6@126.com

趙群芬， E-mail: zhaoqunfen@nbu.edu.cn