日本鰻鱺肝臟表達抗菌肽2基因的克隆與表達

段明珠黃 貝梁 英張芳芳聶 品黃文樹，

（1. 集美大學水產(chǎn)學院， 廈門 361021； 2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心， 廈門 361021； 3. 中國科學院水生生物研究所， 武漢 430072； 4. 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 廈門 361021）

日本鰻鱺肝臟表達抗菌肽2基因的克隆與表達

段明珠1，2黃 貝1，2*梁 英1，2張芳芳1，2聶 品3黃文樹1，2，4

（1. 集美大學水產(chǎn)學院， 廈門 361021； 2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心， 廈門 361021； 3. 中國科學院水生生物研究所， 武漢 430072； 4. 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 廈門 361021）

為探討魚類抗菌肽基因的生物學功能， 研究應用RACE方法克隆獲得了日本鰻鱺 （Anguilla japonica） 肝臟表達抗菌肽2基因 （Liver-Expressed Antimicrobial Peptide 2， LEAP-2）， 即AJLEAP-2的cDNA序列， 全長為450 bp， 開放閱讀框編碼89個氨基酸。其成熟肽含有LEAP-2保守基序“C-X5-C-X4-C-X4-C”。AJLEAP-2基因組結構與其他脊椎動物LEAP-2相同， 都包含有三個外顯子。利用熒光定量PCR檢測了AJLEAP-2在日本鰻鱺不同組織/器官中的表達， 發(fā)現(xiàn)其轉錄子在肝臟中表達量最高， 是內參基因 （β-actin） 的6倍； 其次是腸道， 但其表達量僅為肝臟的1/130。此外， 還檢測了AJLEAP-2在日本鰻鱺玻璃鰻（Glass eel）階段的轉錄表達水平， 結果顯示， 玻璃鰻中AJLEAP-2的轉錄表達量僅低于黑仔期的肝臟， 為黑仔鰻腸道表達量的2倍。LPS和遲緩愛德華菌 （Edwardsiella tarda） 刺激能顯著上調鰻鱺血液中AJLEAP-2的轉錄表達， 刺激16h后上調倍數(shù)最高， 分別為對照組的86倍和12倍。此外， LPS刺激72h和E. tarda 刺激8h后， 腸道中AJLEAP-2顯著上調表達（P＜0.05）， 為對照組的8倍。Poly I:C刺激24h后， 血液中AJLEAP-2轉錄表達顯著下調。結果表明， AJLEAP-2在日本鰻鱺抗細菌感染過程中起重要的作用。

抗菌肽； LEAP-2； 日本鰻鱺； 遲緩愛德華氏菌

抗菌肽 （Antimicrobial peptides） 是一類廣譜抗微生物多肽， 可抑制或殺死細菌、真菌、寄生蟲和病毒等。同時， 它也是生物體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分， 也稱宿主防御肽， 廣泛存在于動、植物和細菌等生物體［1］。其主要殺菌機理是通過破壞細菌細胞膜的完整性， 使細菌內容物泄漏， 進而殺死細菌［2］。與傳統(tǒng)抗生素相比， 抗菌肽具有不易產(chǎn)生耐藥性和無環(huán)境污染的特性， 被視為現(xiàn)有抗生素的潛在替代品， 近年來已成為研究與開發(fā)的熱點［3］。

肝臟表達抗菌肽2 （ Liver-Expressed Antimicrobial Peptide-2， LEAP-2 ） 是2003年Krause等［4］從人類血液中分離的一種新抗菌肽， 在中性pH時， 帶 +4電荷， pI9.2。其羧基端有4個半胱氨酸殘基，C1與C3、C2與C4各自形成二硫鍵， 因其是第二個在肝臟中發(fā)現(xiàn)的大量轉錄表達的抗菌肽， 故命名為LEAP-2。人類LEAP-2的cDNA全長為512 bp， 包含3個外顯子， 2個內含子， 基因編碼77個氨基酸， 包含信號肽， Prodomain域和成熟肽三部分。在血液中，LEAP-2被加工成幾種不同長度的多肽， 參與抗菌活動［4，5］。抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)， 巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）等對重組表達和化學合成的LEAP-2都具有敏感性， 其抗菌活性與膜的親和性相關［6］。

在魚類中， Zhang等［7］首先從虹鱒 （Oncorhynchus mykiss） 克隆獲得兩個LEAP-2， 即LEAP-2A和LEAP-2B，分析發(fā)現(xiàn)LEPA-2存在RXXR切割位點， 酶切后形成成熟肽， 并且LEAP-2A和LEAP-2B在肝臟中均高水平轉錄表達， 經(jīng)細菌刺激后， 腸和皮膚的轉錄表達量增加［7］。迄今， 已有包括斑點叉尾（Ictalurus punctatus）［8］、黃顙魚 （Pelteobagrus fulvidraco）、牙鲆 （Paralichthys olivaceous）［9］、斑馬魚 （Danio rerio）［10］、藍鯰 （Ictalurus furcatus）［8］、草魚 （Ctenopharynodon idellus）［11］、團頭魴 （Megalobrama amblycephala）［12］、鯉 （Cyprinus carpio ）［13］、（Miichthys miiuy）［14］、大西洋鮭 （Salmo salar）、鯽 （Carassius auratus）［15］和大黃魚 （Larimichthys crocea）［16］等13種魚的LEAP-2基因被克隆鑒定。與哺乳動物LEAP-2主要表達于肝臟組織中不同， 魚類LEAP-2的組織表達模式差異較大。例如， 斑點叉尾LEAP-2在肝臟中的轉錄表達量遠低于其他組織/器官［8］，而團頭魴LEAP-2 在中腸中轉錄表達水平最高， 其次是腦垂體［12］。此外， 硬骨魚類LEAP-2受外源刺激物誘導后， 轉錄表達模式具有一定的種屬特異性［12］。如滅活的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）刺激4h后， 草魚肝臟中LEAP-2轉錄表達量上調倍數(shù)最高［11］。而滅活嗜水氣單胞菌刺激72h后，團頭魴肝臟中LEAP-2的轉錄表達才達到高峰。

鰻鱺是中國重要的養(yǎng)殖魚類， 近十年來， 鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定發(fā)展， 2013年， 中國鰻鱺產(chǎn)量達到20.6萬噸， 主要集中在福建、廣東和江西三?。?7］。在鰻鱺養(yǎng)殖所發(fā)生的各種疾病中， 細菌性疾病危害最嚴重［18］。據(jù)調查測算， 2006年福建省養(yǎng)殖鰻鱺發(fā)生的疾病中， 細菌性疾病所占比例最高， 約為43%［19］。自2006年日本實施“肯定列表制度”， 對中國輸日鰻鱺的藥物殘留進行嚴格控制， 給中國養(yǎng)鰻業(yè)造成了巨大壓力。因此， 針對鰻鱺細菌性疾病的抗菌肽的研究開發(fā)顯得尤為迫切。本研究克隆鑒定了日本鰻鱺抗菌肽LEAP-2基因， 并利用熒光定量PCR技術研究了該基因在日本鰻鱺各組織/器官中的表達模式， 及外源刺激后基因表達的變化， 研究結果將有助于深入了解日本鰻鱺的抗菌機制， 豐富魚類先天免疫的理論。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

日本鰻鱺［體質量（203±53） g］ 購于福建省集美大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地， 養(yǎng)殖水溫 （28±2）℃；玻璃鰻［20］［體長（6±2） cm］購于福建省莆田市。對日本鰻鱺（黑仔鰻）采集血液、鰓、心臟、肝臟、腸、胃、脾臟、頭腎、中腎、鰾和皮膚組織/器官， 玻璃鰻采集整條。黑仔鰻樣品采集及處理方法：用肝素鈉預處理的無菌注射器抽取鰻鱺血液2 mL， 800×g離心20min， 去上層溶液， 收集下層細胞， 加入1 mL Trizol?reagent （Invitrogen， 美國） 和6—7顆直徑3 mm玻璃珠， 組織勻漿（3000 r/min， 20s/次， 勻漿3次， Retsch MS100， 日本）； 其他組織取約100 mg，同上加入玻璃珠及1 mL Trizol后， 勻漿。取整條玻璃鰻剪碎后， 同上加入玻璃珠及1 mL Trizol后， 勻漿。上述樣品于-80℃保存， 備用。

免疫刺激試驗: 設PBS對照組， LPS刺激組（1 mg/ 100 g魚， Sigma）， Poly I:C刺激組（1 mg/100 g魚，Sigma）， 遲緩愛德華氏菌刺激組（2×107cfu/100 g魚），免疫方法是腹腔注射。分別在注射后8h、16h、24h和72h采樣， 每組每個時間點隨機取鰻鱺8尾， 每尾魚分別采集上述11個組織/器官。

1.2 基因組DNA和總RNA的提取

DNA提取: 取日本鰻鱺肌肉100 mg， 參照 Mini-BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0 （TaKaRa， 日本）試劑盒提取基因組DNA。RNA提取: 取解凍后的組織樣品200 μL， 根據(jù)Trizol?reagent試劑盒說明書提取總RNA， 每尾魚的不同組織/器官作為獨立樣品提取RNA。瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA/DNA的完整性， 利用分光光度計（Thermo， NanoDrop 2000， 美國）檢測RNA或DNA的濃度及純度。

1.3 cDNA第一鏈的合成

基因克隆: 取肝臟總RNA， 經(jīng)RNase-free DNase I （New England Biolabs Inc， 美國） 處理后， 反轉錄（SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit，Clontech， 美國）合成第一鏈， 制備肝臟3′和5′RACE模板。

Real-time PCR擴增模板制備: 取4 μg總RNA用GoScripTMReverse Transcription System （Promega，美國） 反轉錄試劑盒反轉錄， 產(chǎn)物用TE buffer稀釋，于-20℃保存， 備用。

1.4 AJLEAP-2全長cDNA的克隆和序列測定

通過分析日本鰻鱺肝臟和腎臟cDNA文庫， 獲得一條與鯉LEAP-2相似性為65%的EST序列， 根據(jù)EST序列設計引物（Primer Premier 6.0 軟件） （表1），按照SMARTer試劑盒的說明書進行巢式PCR， 獲得5′和3′末端基因片段。利用所獲得的5′和3′末端序列， 設計引物AJLEAP-2_FL_F和AJLEAP-2_FL_R（表 1） 進行PCR擴增和全長cDNA驗證［21］。PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖膠上電泳， 回收 （E.Z.N.A?Gel Extraction Kit， OMEGA， 美國）， 連接到pMD19-T載體（TaKaRa， 日本）， 并熱激轉化至大腸桿菌Escherich coliDH5α中。經(jīng)PCR檢測陽性克隆后測序驗證。

表 1 所用引物序列Tab. 1 Primers used in the present study

1.5 AJLEAP-2基因組序列擴增

用擴增cDNA全長的引物（AJLEAP-2_FL_F和AJLEAP-2_FL_R， 表1）， 以肌肉基因組DNA為模板，進行PCR擴增 （LA試劑盒， TaKaRa， 日本）， 反應體系25 μL: 基因組DNA 1 μL， 上下游引物（10 μmol/L）各1 μL， LA Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 0.25 μL，10×LA PCR Buffer II （Mg2+Plus） （TaKaRa， 日本）2.5 μL， dNTP Mixture （2.5 mmol/L） 4 μL， 反應條件為: 94℃預變性3min； 94℃變性30s， 64℃退火30s，72℃延伸2min， 35個循環(huán)； 72℃ 10min。

1.6 AJLEAP-2在日本鰻鱺不同組織器官表達量分析

熒光定量PCR采用Lightcycler 480 SYBR Green I 試劑盒 （Roche， 德國） 在Ligthcycler 480 II PCR儀 （Roche， 德國） 上進行。PCR反應體系: cDNA模板4 μL， 正向引物 （qAJLEAP-2F， 跨內含子， 10 μmol/L 0.5 μL），反向引物 （qAJLEAP-2R，10 μmol/L） 0.5 μL， LightCycler 480 SYSR Green I Master （2×） 10 μL， 補充水至20 μL。反應條件：95℃變性20s， 58℃退火20s， 72℃延伸25s， 40個循環(huán)。熒光信號采集溫度為81℃。反應結束后分析擴增產(chǎn)物的溶解曲線， 以判定擴增產(chǎn)物的特異性。以β-actin作為內參比基因。梯度稀釋已知拷貝數(shù)AJLEAP-2和β-actin質粒樣品， 與組織/器官樣品同時進行PCR擴增， 繪制標準曲線， 計算各自基因的擴增效率。

不同組織/器官中AJLEAP-2的轉錄表達譜， 是以不同組織/器官中（AJLEAP-2表達量）/（β-actin表達量）的1000倍來表示。不同免疫源刺激實驗組的AJLEAP-2相對表達量的倍數(shù)變化， 是以相應時間點的相同組織的PBS對照組靶基因表達量為基準計算所得。

1.7 序列生物信息學分析

利用NCBI網(wǎng)站中的Blast （http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi） 進行序列比對； 利用ExPASy的翻譯工具（http://web.expasy.org/translate/） 獲得LEAP-2的氨基酸序列； ExPASy （http://web.expasy. org/compute_pi/）預測分子量和pI值； 用SignalP 4.1 Server程序 （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析信號肽； 用Pfam程序（http://pfam.xfam.org/）分析結構域； SWISS-MODEL程序（http://swissmodel. expasy.org/） 預測LEAP-2基因的三級結構。利用ClustalX-2.1軟件進行氨基酸序列的多重比對； 應用MEAG5.0軟件， 采用鄰位相接法 （NJ法） 構建了系統(tǒng)發(fā)育樹?；蚪M數(shù)據(jù)來源于Ensembl網(wǎng)站（http:// asia.ensembl.org/index.html）。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結果用Excel軟件進行計算， 用單因素變量方差分析法 （ANOVA） 分析免疫原刺激樣品間AJLEAP-2表達量差異， 利用 Dunnettt-Test （2-sided）進行多重比對。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差（SEM） 的方式表示， P＜0.05 表示差異顯著， P＜0.01表示差異極顯著。利用GraphPad.Prism.v5.0軟件進行作圖。

2 結果

2.1 日本鰻鱺AJLEAP-2基因序列分析

通過RACE 和PCR的方法克隆獲得日本鰻鱺LEAP-2 （AJLEAP-2） 的全長cDNA 序列（GenBank登錄號: KP893812）。AJLEAP-2 cDNA全長450 bp，包括5′ UTR 60 bp、開放閱讀框（ORF） 270 bp和3′UTR 120 bp， 其中3′ UTR中有保守的終止信號（AATAAA）。推導的AJLEAP-2前體肽分子量為9.66 kD， pI為9.33。該前體肽包括三個部分： N-端26氨基酸殘基為信號肽部分； 隨后22個氨基酸殘基為原結構域 （Prodomain），該結構域的C-末端含有成熟肽切割位點（RXXR）； C-末端的41個氨基酸殘基為成熟肽 （其分子量為4.78 kD， pI 8.86）， 含有哺乳動物和魚類LEAP2高度保守的4個半胱氨酸殘基，其基序為-C-X5-C-X4-C-X4-C-，其中C65與C76、 C71與C81可能形成二硫鍵。

高等脊椎動物 （哺乳類和鳥類） LEAP-2原前體肽 （Proprepeptide） 為76—77肽， 其中信號肽部分含22個氨基酸殘基， 成熟肽為40肽， pI為9.37； 兩棲類LEAP-2的前體肽為80肽， 信號肽為24肽， 成熟肽為40肽， pI為9.58； 而魚類LEAP-2的前體肽較為多樣，總長度為78—102個氨基酸殘基， 成熟肽包含37—46個氨基酸殘基， 成熟肽的pI 6.79—9.2。根據(jù)信號肽、Prodomain及成熟肽的長度和等電點不同，魚類的LEAP-2可以區(qū)分為三型， 即A、B、C型: 高等脊椎動物和硬骨魚C型LEAP-2成熟肽的長度小于或等于40個氨基酸殘基， 而硬骨魚A、B型的均大于40個氨基酸殘基（表 2）； 高等脊椎動物和硬骨魚的C型LEAP-2的Prodomain區(qū)長度小于18個氨基酸， 而硬骨魚的A和B型的較大， 一般大于22個氨基酸 （表 2）； 哺乳類、鳥類、兩棲類和大多數(shù)的硬骨魚C型的成熟肽pI大于9， 硬骨魚A型的pI為7—9， 而硬骨魚B型的pI （除虹鱒為8.94） 均小于7 （表 2）。

表 2 各物種LEAP-2基因的GenBank登錄號及序列信息Tab. 2 GenBank accession number and sequence information for LEAP-2 genes in vertebrates

利用AJLEAP-2_FL_F和AJLEAP-2_FL_R引物對日本鰻鱺基因組進行LA-PCR擴增， 獲得AJLEAP-2基因組序列， GenBank登錄號為: KR013137。用Spidey軟件對基因組序列與cDNA序列進行比對，結果顯示， AJLEAP-2的開放閱讀框包含三個外顯子 （69、161和40 bp）和兩個內含子（868和110 bp），內含子1屬于0相位， 內含子2屬于2相位， 內含子剪切符合GT-AG規(guī)則。信號肽部分由外顯子1及外顯子2的部分序列共同編碼， 成熟肽部分由外顯子2的部分序列和外顯子3共同編碼。基因組結構比對分析結果顯示， 脊椎動物LEAP-2基因的基因結構保守， 外顯子大小相近。哺乳類和大多數(shù)硬骨魚類的內含子相位相同， 內含子1均是為0相位（除雞為1），內含子2均為2相位（除石首科的大黃魚和鮸為0）（表 3）。脊椎動物LEAP-2的四個保守半胱氨酸的編碼高度保守， 前3個半胱氨酸由外顯子2編碼， 第4個半胱氨酸由外顯子3編碼， 除爪蟾為前2個半胱氨酸由外顯子2編碼， 后2個半胱氨酸由外顯子3編碼。

2.2 LEAP-2的多重比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構建分析

選取哺乳類、鳥類、兩棲類和硬骨魚類等17個代表性物種的21條LEAP-2的全長氨基酸序列進行多重比對。結果顯示， 所有脊椎動物LEAP-2的原前體肽包括信號肽、Prodomain區(qū)和成熟肽三個部分。哺乳類、鳥類、兩棲類和硬骨魚C型LEAP-2氨基酸全長、信號肽、Prodomain區(qū)和成熟肽長度均小于硬骨魚A、B亞型。Prodomain區(qū)內都有保守基序為“RXXR”， 它是成熟肽的切割位點， 硬骨魚類LEAP-2A （包括AJLEAP-2基因） 的蛋白酶水解位點基序均為“RXAR”， LEAP-2B （除虹鱒LEAP-2B為RRTR） 為“RKXR”， LEAP-2C型為“RATKR”序列（表 2）。在成熟肽的N端包含有6個高度保守的氨基酸序列: 高等脊椎動物為“M/ITPFWR”， 硬骨魚類LEAP-2A（包括AJLEAP-2）為“MTPLWR”， LEAP-2B（除虹鱒LEAP-2B為MTPLWR）為“MSPLWR”， 而LEAP-2C少一個氨基酸“M”為“SLLWR”。

相似性分析結果顯示日本鰻鱺AJLEAP-2的氨基酸序列與哺乳動物、鳥類、兩棲類及其他魚類的相似度12%—57.2%，其中與虹鱒的相似度最高為57.2%。

用MEAG 5.0軟件對9個物種的15條LEAP-2成熟肽序列構建進化樹。結果顯示， 哺乳類、鳥類和兩棲類的LEAP-2聚為一支， 硬骨魚聚成另一支。其中硬骨魚LEAP-2的A、B、C型又分別聚在不同的小分支中， 其中本研究的AJLEAP-2與虹鱒、斑馬魚、鯉和大黃魚LEAP-2A亞型聚為一支， 魚類LEAP-2B亞型與LEAP-2A型進化關系接近， 2B先聚為一小支 （虹鱒LEAP-2B與魚類LEAP-2A聚為一支）后與LEAP-2A聚為一支， 魚類LEAP-2C亞型聚為一支， 三種亞型最后聚為一大支后， 而高等脊椎動物LEAP-2聚為另一大支 （圖 1）。

2.3 日本鰻鱺LEAP-2三級結構預測

表 3 日本鰻鱺LEAP-2與其他脊椎動物LEAP-2基因組結構比較Tab. 3 Comparison of the genomic organization of AJLEAP-2 gene with its counterparts from other vertebrates

通過最佳模型的搜索發(fā)現(xiàn)，AJLEAP-2蛋白序列最匹配的模板是人類LEAP-2 （PDB 2l1q.1.A）， 用SWISS-MODEL預測日本鰻鱺LEAP-2蛋白的三級結構（圖 2）。結果顯示， 日本鰻鱺LEAP-2與人類LEAP-2蛋白結構相似， 包括由兩對二硫鍵組成的緊密中心和無序的N端、C端組成一個穩(wěn)定的結構。

圖 1 脊椎動物AJLEAP-2基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of AJLEAP-2 mature peptide amino acid sequences from vertebrate

2.4 AJLEAP-2基因的組織特異性表達

利用Real-time PCR檢測日本鰻鱺（黑仔鰻）的肝臟、腸、皮膚、心臟、血液、胃、頭腎、中腎、鰾、脾臟、鰓等11個組織/ 器官AJLEAP-2的轉錄表達水平， 結果顯示， AJLEAP-2在所檢測的不同組織/器官中均有轉錄表達； 其中肝臟中的表達量最高，其平均表達量是β-actin的6倍； 其次是腸， 但其表達量僅為肝臟的1/130， 在血液， 皮膚等中表達量也相對較高。此外， 我們還檢測了玻璃鰻的AJLEAP-2基因的轉錄表達水平。結果顯示， AJLEAP-2在玻璃鰻中的表達量雖然不及黑仔鰻期的肝臟表達量，但比黑仔鰻期的其他組織/器官表達量都高， 約為腸道表達量的2倍 （圖 3）。

2.5 免疫刺激后AJLEAP-2的基因表達變化

與對照組相比， LPS刺激后16h， 血液中AJLEAP-2轉錄表達量上調了86倍 （P＜0.05）， 在腸中， 刺激后72h顯著性上調8倍 （P＜0.05）， 而肝臟則在24h顯著性下調 （P＜0.05）（圖 4A）。Poly I:C刺激后， 血液中AJLEAP-2基因早期無顯著變化， 到24h和72h顯著性下調 （P＜0.05）， 而腸和肝臟中的AJLEAP-2無顯著性差異 （P＞0.05）（圖 4B）。遲緩愛德華氏菌刺激后，血液中的AJLEAP-2在16h顯著性上調12倍 （P＜0.05）， 而在24h和72h均顯著下調 （P＜0.05）。腸中的AJLEAP-2在被檢測的時間點均上調， 在8h具有顯著性差異 （P＜0.05）， 上調8倍。肝臟中的AJLEAP-2在被檢測的時間點均無顯著性差異（P＞0.05）（圖4C）。

3 討論

LEAP-2是一種富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，首次從人類血液的超濾液中純化獲得， 后被發(fā)現(xiàn)在肝臟中大量表達［4］，在脊椎動物抗細菌免疫應答的過程中起十分重要的作用［11，19，23］。本研究克隆了日本鰻鱺的LEAP-2基因全長cDNA序列， 在解析其基因結構的基礎上， 對其表達模式進行了研究。

圖 2 日本鰻鱺LEAP-2蛋白三級結構預測Fig. 2 Predicted tertiary structure of Anguilla japonica LEAP-2

雖然氨基酸序列相似性分析結果顯示AJLEAP-2與高等脊椎動物LEAP-2基因的相似性較低（12%—23%）， 但是， 其與其他硬骨魚類LEAP-2基因的相似性較高 （54.6%—57.2%）。此外， 基因結構分析結果顯示， 日本鰻鱺LEAP-2基因結構與已報道脊椎動物LEAP-2的結構類似， 由3個外顯子和2個內含子組成， 且硬骨魚類LEAP-2基因的外顯子大小相近， 表明其在魚類的進化中保持較高的保守性。

圖 3 AJLEAP-2基因在健康黑仔鰻期不同組織/器官和玻璃鰻中相對表達量Fig. 3 Tissue expression of AJLEAP-2 in glass eels and different tissues/organs from Japanese eel elver

Li等［16］通過系統(tǒng)進化分析， 將魚類LEAP-2分為三個亞型， 即LEAP-2A、LEAP-2B和LEAP-2C。本研究對A、B、C三型進行分析， 結果發(fā)現(xiàn)三種類型在基因長度， 特征序列， 成熟肽等電點等方面具有差別， 其中A型和B型除成熟肽等電點外， 其他特征較為接近， 而C型基因長度， 特征序列， 成熟肽等電點等都與高等脊椎動物的LEAP-2特征相近， 進化系統(tǒng)進化分析結果顯示A型和B型同源關系較近， C型與兩者關系較遠。因此， 結合系統(tǒng)進化分析、氨基酸序列比對及等電點分析， 我們認為本研究所克隆獲得的AJLEAP-2為A型， Zhang等［7］所報道的虹鱒LEAP-2B成熟肽的特征序列和等電點等特征更接近于其他硬骨魚類的LEAP-2A。

圖 4 LPS（A）、PolyI:C（B）和愛德華氏菌（C）刺激后AJLEAP-2表達量變化分析Fig. 4 Differential expression of AJLEAP-2 in Anguilla japonica after being intraperitoneal injected with LPS（A）， Poly I:C （B） or Edwardsiella tarda （C）

脊椎動物的LEAP-2基因在各組織/器官中廣泛表達， 且主要表達于肝臟中［16］。人類LEAP-2在肝、腎、十二指腸、空腸等組織/器官中表達［4］。豬LEAP-2主要表達于肝臟， 在腎和腸也有表達［24］。雞LEAP-2表達于肝、小腸、肺、和腎臟［22］。多數(shù)硬骨魚LEAP-2也是在肝臟中表達量最高［7，11，13，14］。但也有例外， 如斑點叉尾LEAP-2A在肝臟中的表達量遠遠低于其他組織/器官［8］， 鯉LEAP-2A在脾臟中表達量最高［13］， 大黃魚LEAP-2A和LEAP-2C亞型均在腸中表達量最高， 其次才為肝臟［16］。在本研究中，AJLEAP-2主要表達于肝臟， 其次在腸、心臟、皮膚、血液、胃、頭腎、中腎、鰾、脾臟和鰓。這些結果表明魚類LEAP-2基因的表達模式具有種屬特異性［12］。有研究表明， LEAP-2參與了魚類早期發(fā)育過程中的免疫應答。如草魚LEAP-2在16細胞期和團頭魴LEAP-2受精卵發(fā)育開始高表達， 隨后表達量開始降低， 孵化后LEAP-2又重新高表達［11，12］。本研究發(fā)現(xiàn)在日本鰻鱺玻璃鰻時期， AJLEAP-2高表達， 說明LEAP-2參與了日本鰻鱺幼體時期的先天免疫反應。

已有的研究表明， 細菌或其成分（如LPS）刺激能夠顯著誘導LEAP-2的表達。滅活嗜水氣單胞菌刺激可顯著上調草魚肝臟、脾臟、腦和鰓組織中LEAP-2基因的表達［11］。腹腔注射鰻弧菌6h后， 鯉肝臟、脾臟、頭腎、皮膚、鰓和前腸組織中LEAP-2基因顯著上調表達［13］。大黃魚感染溶藻弧菌后，其肝臟組織中LEAP-2A基因快速上調表達［16］。本研究發(fā)現(xiàn)， LPS和遲緩愛德華菌刺激能顯著上調日本鰻鱺血液中AJLEAP-2基因的表達， 刺激16h上調倍數(shù)最高， 分別為對照組的86倍和12倍。此外LPS刺激72h和E. tarda 刺激8h后， 腸AJLEAP-2顯著上調表達， 為對照組的5—8倍。而Poly I:C刺激后，AJLEAP-2在肝臟和腸中表達無顯著變化， 且在刺激24h后血液中AJLEAP-2表達量顯著下調， 表明AJLEAP-2基因主要參與魚類抗細菌免疫應答。

綜上所述， 本研究克隆獲得了日本鰻鱺LEAP-2基因。結合其基因結構、分子特性和系統(tǒng)進化分析， 推斷該分子為硬骨魚類LEAP-2A亞型。此外，本研究檢測了LPS、遲緩愛德華菌和Poly I:C刺激后， 日本鰻鱺LEAP-2基因的表達模式， 結果進一步證實了該基因主要參與魚類的抗細菌免疫應答。

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF A LIVER
EXPRESSED ANTIMICROBIAL PEPTIDE-2 IN JAPANESE EEL， ANGUILLA JAPONICA

DUAN Ming-Zhu1，2， HUANG Bei1，2， LIANG Ying1，2， ZHANG Fang-Fang1，2， NIE Pin3and HUANG Wen-Shu1，2，4
（1. Fishery College， Jimei University， Xiamen 361021， China； 2. Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry， Ministry of Education PRC， Xiamen 361021， China； 3. Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China； 4. Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources，Xiamen 361021， China）

Liver Expressed Antimicrobial Peptide 2 （LEAP-2）， a cysteine-rich cationic antimicrobial peptide， plays a vital role in the host innate immune system. In the present study， the AJLEAP-2 gene was cloned from Japanese eel （Anguilla japonica） by RACE. The length of AJLEAP-2 cDNA was 450 bp including a 270 bp ORF that encodes a putative 89-peptide. The peptide contained the conserved motif MTPFWR and the characteristic motif C-X5-C-X4-C-X4-C of LEAP-2. AJLEAP-2 has three exons similar to the counterpart from other vertebrates. The expression of AJLEAP-2 from tissue/organs of Japanese eel elver indicated the highest expression in liver that was five times higher than that of β-actin， and then in intestine that was only 1/130 the amount in liver. Additionally， AJLEAP-2 was highly expressed in glass eel， which was almost twice the amount in elver intestine. LPS and Edwardsiella tarda increased the expression of AJLEAP-2 in blood and reached the peak level at 16h post challenge increasing 86 folds and 12 folds， respectively. Both LPS and E. tarda significantly up-regulated the expression of AJLEAP-2 in intestine. Meanwhile， the transcript level of AJLEAP-2 in blood was significantly down-regulated at 24h challenged with Poly I:C. These results suggest that AJLEAP-2 may play an important role in innate immunity of Japanese eel against bacterial infection.

Anguilla japonica； LEAP-2； Antimicrobial peptide； Edwardsiella tarda

10.7541/2016.35

Q344+.1

A

1000-3207（2016）02-0252-09

2015-06-07；

2015-08-18

國家自然科學基金（31172438和U1205123）； 福建省自然科學基金（2012J06008， 201311180002和2014J05042）； 教育部留學回國人員科研啟動金資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 31172438 and U1205123）， the Natural Science Foundation of Fujian Province （Nos. 2012J06008， 201311180002 and 2014J05042） and the Projects-sponsored by SRF，for ROCS， SEM］

段明珠（1989-）， 女， 湖北黃岡人； 碩士； 主要研究方向為魚類免疫學。E-mail: dmzstiver@sina.cn； 黃貝（1982—）， 男， 江西萍鄉(xiāng)人； 博士； 主要研究方向為魚類免疫學。E-mail: huangbei@jmu.edu.cn *共同第一作者

黃文樹， 男， 博士； E-mail: wshuang@jmu.edu.cn