鰱神經(jīng)肽Y基因的克隆及其在禁食-恢復(fù)投喂條件下的表達(dá)特征分析

楊鎮(zhèn)宇王 丹，李 忠梁宏偉趙金坤羅相忠鄒桂偉

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 武漢 430070； 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所， 武漢 430223； 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心， 無錫 214081）

鰱神經(jīng)肽Y基因的克隆及其在禁食-恢復(fù)投喂條件下的表達(dá)特征分析

楊鎮(zhèn)宇1，2王 丹2，3李 忠2梁宏偉2趙金坤1，2羅相忠2鄒桂偉2

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 武漢 430070； 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所， 武漢 430223； 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心， 無錫 214081）

為深入研究神經(jīng)肽Y對(duì)鰱攝食活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用， 研究利用同源克隆方法獲得鰱NPY基因cDNA全長(zhǎng)序列，并檢測(cè)在禁食-恢復(fù)投喂條件下， NPY在腦和肝臟中的表達(dá)情況. 結(jié)果表明: 鰱NPY基因cDNA全長(zhǎng)782 bp， 包括5′端非翻譯區(qū)68 bp， 3′端非翻譯區(qū)423 bp， 開放閱讀框291 bp， 編碼96個(gè)氨基酸； 氨基酸相似性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示NPY較為保守； NPY在所檢測(cè)的13個(gè)組織中均有表達(dá)， 并且在腦垂體中表達(dá)量最大； 禁食導(dǎo)致NPY mRNA在腦中的表達(dá)量顯著上升， 恢復(fù)投喂6h后下降到基本水平， 表明NPY對(duì)鰱攝食有促進(jìn)作用； 在肝臟中， 禁食前5天NPY mRNA表達(dá)量顯著上升， 禁食第7天急劇下降， 恢復(fù)投喂4h后下降到基本水平； NPY mRNA在腦和肝臟中的表達(dá)具有組織差異性， 其在肝臟中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究. 研究結(jié)果為探討NPY在鰱中的生物學(xué)功能和在遺傳育種中的作用提供了理論依據(jù)。

鰱； NPY基因； 禁食； 恢復(fù)投喂； 基因表達(dá)

攝食和能量平衡的調(diào)節(jié)對(duì)于動(dòng)物的生長(zhǎng)至關(guān)重要， 不適當(dāng)?shù)臄z食和能量代謝會(huì)抑制動(dòng)物生長(zhǎng)、延緩青春期、降低動(dòng)物對(duì)寄生蟲和疾病的抵抗力［1］。魚類與其他脊椎動(dòng)物一樣， 通過中樞和外周的分泌因子來調(diào)節(jié)攝食和能量代謝［2］。神經(jīng)肽Y，又稱神經(jīng)肽酪氨酸（Neuropeptide Y， NPY）， 是由瑞典科學(xué)家Tatemoto等［3］于1982年從豬腦中分離出來的一種含36個(gè)氨基酸的單鏈多肽， 是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的神經(jīng)肽。NPY被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物中最能有效促進(jìn)食欲的肽之一［4—6］。與哺乳動(dòng)物相似， 魚類NPY在腦中的結(jié)合區(qū)域也主要位于食欲調(diào)節(jié)區(qū)域［7］， NPY對(duì)魚類的攝食和能量代謝也起著至關(guān)重要的作用［8，9］。Lopez-Patino等［10］發(fā)現(xiàn)在金魚（Carassiu sauratus）中， 側(cè)腦室內(nèi)注射NPY可顯著提高其攝食量， 而加入NPY受體拮抗物可降低這種效應(yīng)； 禁食能夠引起NPY表達(dá)量上升。Carpio等［11］通過腹腔注射將重組的NPY蛋白注射到羅非魚（Oreochromis niloticus）體中， 發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)其攝食量和體重的增加。Peterson等［12］發(fā)現(xiàn)， 在斑點(diǎn)叉尾（Ietalurus punetaus）攝食前其腦組織NPY表達(dá)量增加， 并且腦組織中NPY表達(dá)量與饑餓時(shí)間呈正相關(guān)。

鰱（Hypophthalmichthys molitrix）是我國(guó)傳統(tǒng)養(yǎng)殖的“四大家魚”之一， 以浮游生物為食， 分布于我國(guó)各大水系［13］。鰱具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值， 近十年來年產(chǎn)量都居淡水魚類年產(chǎn)量第二［14］，是我國(guó)普通百姓重要的動(dòng)物性蛋白來源之一。NPY作為一種重要的攝食和能量代謝調(diào)控因子， 研究其對(duì)鰱攝食活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用， 有助為鰱新品種的選育提供輔助信息。本研究利用同源克隆方法獲得鰱NPY基因cDNA全長(zhǎng)序列， 并檢測(cè)其在鰱各組織中的表達(dá)情況， 分析在饑餓-再投喂條件下在腦和肝中的表達(dá)特征， 從分子水平探討NPY對(duì)鰱攝食的調(diào)節(jié)作用， 以期為進(jìn)一步研究NPY在鰱中的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

禁食-恢復(fù)投喂實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)魚由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所窯灣試驗(yàn)場(chǎng)提供。選取健康無病、規(guī)格一致的鰱330尾［平均體重（13.93 ± 1.35） g］， 在養(yǎng)殖車間養(yǎng)殖桶（500 L）內(nèi)暫養(yǎng)2周， 每天投喂苗種一號(hào)粉料（武漢正大有限公司）2次（8:00和16:00）， 溫度（29.5±1.2）℃。然后將實(shí)驗(yàn)魚隨機(jī)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)平行組， 分別在3個(gè)養(yǎng)殖桶（500 L）內(nèi)養(yǎng)殖，每組110尾魚， 禁食15d， 隨后再恢復(fù)投喂15d （實(shí)驗(yàn)條件同暫養(yǎng)期間）， 實(shí)驗(yàn)期間均使用曝氣自來水， 每天清理糞便和殘?jiān)?隔天換水1/3， 溶氧保持在7 mg/L以上， 自然光照。分別在禁食0（對(duì)照組）、1d、2d、3d、5d、7d、10d和15d； 在恢復(fù)投喂后1h、2h、4h、6h； 和恢復(fù)投喂后1d、3d、5d、7d、10d、15d取樣， 為保持取樣時(shí)間一致， 在每天中午12:00取樣。在實(shí)驗(yàn)開始前， 15條魚取各個(gè)組織（全腦、腦垂體、心、肝、腎、脾、前腸、中腸、后腸、肌肉、鰓、皮、眼）用于NPY的組織表達(dá)分析；在禁食-恢復(fù)投喂實(shí)驗(yàn)開始后， 每個(gè)采樣點(diǎn)每個(gè)平行組各取5條魚（3個(gè)實(shí)驗(yàn)平行組）分別取全腦和肝臟用于檢測(cè)禁食-恢復(fù)投喂實(shí)驗(yàn)對(duì)NPY mRNA表達(dá)量的影響。所取樣品均保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 總RNA提取試劑Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen 公司； 反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT Reagen Kit with gDNA Eraser和亞克隆載體pMD?18-T Vector system購(gòu)自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）； 瓊脂糖凝膠回收試劑Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit購(gòu)自北京百泰克生物有限公司（Bioteke）； 3′端和5′端的擴(kuò)增試劑SMART RACE cDNAAmplication Kit購(gòu)自美國(guó)Clontech公司； 熒光定量試劑QuantiFastTM SYBR?Green PCR Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司； 大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保種。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

熒光定量PCR儀為Qiagen公司生產(chǎn)的Rotor-Gene 6200 system， 紫外分光光度計(jì)為UNICO公司的UV-3802紫外分光光度計(jì)， 凝膠成像系統(tǒng)為Syngene公司的G: BOX。

引物 根據(jù)GenBank中其他已知物種的NPY基因cDNA序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物NPY1用于擴(kuò)增鰱NPY基因中間片段， 設(shè)計(jì)引物SMA NPY 3和SMA NPY 5用于分別擴(kuò)增NPY基因的3′端和5′端。RT NPY 1為定量表達(dá)的特異性引物； β-actin 1（GenBank登錄號(hào): AF301605）為定量表達(dá)的內(nèi)參引物。以上引物均采用Primer 5.0設(shè)計(jì)， 由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

1.2 方法

總RNA的提取與cDNA合成 稱取上述所取鰱組織約100 mg （腦組織用于擴(kuò)增基因全長(zhǎng)）， 使用Trizol Reagent （Invitrogen）試劑并根據(jù)其使用說明提取總RNA。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，并根據(jù)A260/A280值判斷RNA的質(zhì)量； 凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性； 以總RNA為模板， 使用PrimeScriptTM

RT Reagen Kit with gDNA Eraser （TaKaRa）試劑并按照說明書合成cDNA。

表 1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab. 1 Primers used in the experiment

3′RACE和5′RACE 按照SMART RACE cDNAAmplication Kit （Clontech） 試劑盒操作要求，采用引物SMA NPY 3、SMA NPY 5進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL， 其中10×Buffer 2.5 μL， 上、下游引物 （10 μmol/L） 各1 μL， dNTPs （10 mmol/L）0.5 μL， 高保真Taq酶0.3 μL， 模板1 μL， 以ddH2O補(bǔ)足體積。反應(yīng)程序?yàn)? 94℃ 5min； 94℃ 30s， 58℃30s， 72℃ 45s， 35個(gè)循環(huán)； 72℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)、回收、連接、轉(zhuǎn)化后， 挑單克隆菌落送武漢生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

序列分析 利用ContigExp軟件對(duì)獲得的鰱NPY cDNA序列進(jìn)行片段拼接和序列分析， 用DNAStar software 5.0軟件對(duì)鰱NPY氨基酸序列進(jìn)行排列比對(duì)分析， 用Clustal W 和 MEGA 5.0軟件對(duì)鰱氨基酸序列進(jìn)行多序列比較和聚類分析。

鰱NPY mRNA表達(dá)的半定量PCR檢測(cè) 利用引物RT NPY 1和內(nèi)參引物 β-actin 1檢測(cè)NPY基因在腦、腦垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、眼睛、皮膚、鰓、前腸、中腸、后腸和肌肉等各組織中的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)體系為15 μL， 包括10×Buffer 1.5 μL， 上、下游引物 （10 μmol/L） 各0.5 μL， dNTPs （10 mmol/L） 0.3 μL， Taq酶0.2μL， 模板0.8 μL， 以ddH2O補(bǔ)足體積。反應(yīng)程序: 94℃5min； 94℃ 30s， 58℃ 30s， 72℃ 30s， 27（ β-actin）和29（NPY）個(gè)循環(huán)； 72℃ 10min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳， 并拍照保存。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 利用引物RT NPY 1和內(nèi)參引物 β-actin 1檢測(cè)NPY基因在各組織、以及在饑餓處理?xiàng)l件下的腦和肝臟中的表達(dá)情況。反應(yīng)體系為20 μL: 2×SYBR RealtimePCR Rremixture （Qiagen， Germany）10 μL， 上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL， cDNA模板1 μL， 加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 10min； 95℃ 15s， 58℃ 15s， 72℃ 20s， 40個(gè)循環(huán)。使用Rotor-Gene 6200 system儀自帶軟件建立NPY和內(nèi)參 β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線， NPY和 β-actin的擴(kuò)增效率分別為1.00和0.98， 研究表明在魚類禁食-恢復(fù)投喂條件下 β-actin的表達(dá)量是穩(wěn)定的［15—17］。應(yīng)用2-ΔΔCt分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 具體方法參考文獻(xiàn)［18］， 計(jì)算公式如下:

Formula=2-ΔΔCtF=2-［（待測(cè)組目的基因平均Ct值）-（待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值）-（對(duì)照組目的基因平均Ct值）-（對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值）］

2 結(jié)果

2.1 鰱NPY基因序列分析

鰱NPY基因cDNA全長(zhǎng)782 bp （GenBank 登錄號(hào): KJ933391）， 包括68 bp的5′端非翻譯區(qū)、291 bp的最大開放閱讀框和423 bp 的3′端非翻譯區(qū)。該cDNA序列編碼96個(gè)氨基酸， 在3′端非翻譯區(qū)有真核細(xì)胞加尾信號(hào)（AATAAA）和Poly（A）尾巴。

2.2 鰱NPY基因的同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

選取GenBank中已知的一些物種的NPY氨基酸序列: 人（Homo sapiens， NP_000896.1）、原雞（Gallus gallus， AAA48991.1）、牛（Bos Taurus，AAR37328.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevis， AAA499-17.1）、小鼠（Musmus culus， EDK98613.1）、斑馬魚（Danio rerio， AAI62071.1）、草魚（Ctenopharyngodon idella， AGI44276.1）、中華倒刺鲃（Spinibarbus sinensis， ABE73783.1）、江黃顙魚（Pelteobagrus vachellii， AEM75018.1）、鰻鱺（Anguilla japonica， AFN84517.1）、黃鱔（Monopterus albus，AEX97162.1）、歐洲鱸（Dicentrarchus labrax，CAB64932.1）、齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti，AGF80335.1）、大西洋鮭（Salmo salar， BAH241-01.1）。使用DNAMan softwar軟件將這些物種和鰱的NPY氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明NPY氨基酸序列在分子進(jìn)化過程中較保守， 與各物種NPY有較高的同源一致性， 其中， 與草魚、中華倒刺鲃、齊口裂腹魚相似度最高， 分別為100%、97.9%和97.9%， 與鳥類和哺乳動(dòng)物的相似度也高達(dá)60%以上。

通過鄰接法（NJ法）構(gòu)建的基于鰱NPY氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 1）進(jìn)一步可以看出， 鰱NPY與草魚NPY的親緣關(guān)系最近， 然后與鯉形目和鯰形目魚的NPY聚在一起； 鰻鱺、大西洋鮭、黃鱔和歐洲鱸的NPY聚為一支； 人、牛、家鼠、原雞和非洲爪蟾聚為一支。脊椎動(dòng)物的NPY氨基酸序列相似性比較結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果基本一致。

2.3 鰱NPY基因組織表達(dá)譜

分別用半定量和實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種方法檢測(cè)NPY基因在鰱腦、腦垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、眼睛、皮膚、鰓、前腸、中腸、后腸和肌肉等組織中的表達(dá)情況（圖 2、圖 3）。兩種方法檢測(cè)的結(jié)果基本一致， NPY在腦垂體、心臟、脾臟、腎臟、鰓和肝臟中大量表達(dá)， 在腸道中表達(dá)量較低， 在腦、眼睛和皮膚中僅有輕微表達(dá)， 在肌肉中幾乎不表達(dá)。兩種方法檢測(cè)的結(jié)果存在一定的差異性， 推測(cè)是由于二者檢測(cè)的靈敏度不一樣造成。

圖 1 NPY的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 The phylogenetic tree of vertebrate NPYs

圖 2 NPY在不同組織中的表達(dá)（RT-PCR檢測(cè)）Fig. 2 The expression of NPY mRNA in different tissues of the silver carp （with RT-PCR）

2.4 禁食-恢復(fù)投喂對(duì)鰱腦和肝臟中NPY表達(dá)的影響

由圖 4可以看出， 禁食1—5d對(duì)腦中NPY mRNA的表達(dá)沒有影響； 禁食第7天， NPY表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）， 直到禁食第15天上升到最大（P＜0.05）； 恢復(fù)投喂2h后開始， NPY急劇地下降（P＜0.05）， 直到6h后下降到基本水平。在肝臟中（圖 5）， 禁食前5d，NPY mRNA表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）； 禁食第7天，NPY表達(dá)量急劇下降（P＜0.05）， 隨后下降趨勢(shì)變緩（P＜0.05）； 在恢復(fù)投喂后， NPY表達(dá)量繼續(xù)下降（P＜0.05）， 直到恢復(fù)投喂4h后恢復(fù)到基本水平。

3 討論

3.1 鰱NPY基因cDNA序列分析

NPY被證明是脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中最保守的神經(jīng)肽之一［11，19，20］。在本研究中， 氨基酸序列相似性比較顯示鰱NPY基因與各物種NPY基因的同源一致性高達(dá)60%以上， 與草魚NPY的同源一致性更是高達(dá)100%， 表明NPY基因在長(zhǎng)期的分子進(jìn)化過程中高度保守， 由此可猜測(cè)NPY基因在各物種中的功能應(yīng)該比較保守， 在魚類中也應(yīng)具有調(diào)節(jié)攝食和能量代謝的功能。與氨基酸序列相似性比較結(jié)果一致，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示鰱NPY與草魚NPY親緣關(guān)系最近， 系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與用傳統(tǒng)方法所進(jìn)行的物種親緣關(guān)系分類結(jié)果一致。

圖 3 NPY在不同組織中的表達(dá)（熒光定量PCR檢測(cè)）Fig. 3 The expression of NPY mRNA in different tissues of the silver carp （with real-time quantitative PCR）

圖 4 禁食-恢復(fù)投喂條件下， NPY在腦中的表達(dá)Fig. 4 The effect of fasting-refeeding on the level of NPY mRNA in the brain of the silver carp

圖 5 在禁食-恢復(fù)投喂條件下NPY在肝臟中的表達(dá)Fig. 5 ffect of fasting-refeeding on NPY mRNA levels in liver of silver carp

3.2 鰱NPY基因組織表達(dá)分析

NPY是一種內(nèi)源性的下丘腦調(diào)節(jié)肽， 產(chǎn)生于下丘腦的弓狀核和腦干中的離散細(xì)胞群， 主要在腦中發(fā)揮作用， 但是大量研究表明NPY不僅分布在神經(jīng)系統(tǒng)中， 在非神經(jīng)組織中同樣大量存在［20—23］。在本研究中， NPY在腦垂體、心臟、脾臟、腎臟、鰓和肝臟中大量表達(dá)， 在腸道、腦、眼睛、皮膚和肌肉中少量表達(dá)， 這與已有文獻(xiàn)報(bào)道魚類NPY可以通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮中樞調(diào)節(jié)作用， 還可能以旁分泌或自分泌的方式參與魚類外周組織功能調(diào)控［24］的觀點(diǎn)一致。研究表明， NPY在南方鲇（Silurus meridionalis）［25］、大西洋鮭［26］、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）［24］、黃顙魚［27］、大西洋鱈（Gadus morhua）［28］的腦中大量表達(dá)， 而在本研究中， NPY在腦垂體中表達(dá)量最大， 在腦中只有少量表達(dá)。推測(cè)其原因可能為: （1）上述研究者在采樣過程中沒有將全腦與腦垂體分成兩個(gè)組織分別取樣， 而是將二者一起作為腦組織處理， 而本實(shí)驗(yàn)采樣時(shí)則將鰱的全腦和腦垂體作為兩個(gè)組織分別取樣； （2）魚類的腦垂體分為神經(jīng)垂體和腺垂體兩部分， 神經(jīng)垂體主要由下丘腦神經(jīng)分泌細(xì)胞的軸突纖維組成， 起著倉(cāng)庫(kù)的作用， 貯存由神經(jīng)纖維傳送的下丘腦分泌的部分激素， 例如抗利尿激素和催產(chǎn)素， 當(dāng)身體需要時(shí)才將這些激素釋放到血液中［29］。NPY產(chǎn)生于下丘腦， 推測(cè)它是這類激素之一， 由下丘腦分泌但是貯存在神經(jīng)垂體中， NPY在腦垂體中積累就導(dǎo)致NPY在腦垂體中的表達(dá)量比在腦中高。

NPY在非神經(jīng)組織中的表達(dá)存在種間差異: 本研究結(jié)果顯示， NPY在所檢測(cè)的13種組織中都有表達(dá)； Macdonald等［30，31］發(fā)現(xiàn)NPY在美洲擬鰈（Pseudopleuronectes americanus）、冬鰩（Raja ocellata）的腦、腸道、肝臟、腎臟、肌肉、心臟和胃中都有表達(dá)； 而李振華［32］在大鰭鳠（Mystus macropterus）的心臟、胃、肌肉中均未檢測(cè)到NPY表達(dá)； Cerdá-Reverter等［33］在海鱸（Dicentrarchus labrax）的肝臟、心臟、腎臟、腸中也未檢測(cè)到NPY表達(dá)。

NPY在鰱腸道中表達(dá)， 說明與哺乳動(dòng)物和一些魚類一樣， NPY可能影響鰱胃腸道的收縮和排空作用。Dumont等［34］認(rèn)為NPY在哺乳動(dòng)物中扮演腦腸肽的角色； Shahbazi等［35］發(fā)現(xiàn)NPY能導(dǎo)致大西洋鱈的血管舒張和腸道收縮； Bjenning等［36，37］發(fā)現(xiàn)NPY有抑制軟骨魚類胃收縮和胃排空的作用。

3.3 禁食-恢復(fù)投喂對(duì)鰱NPY表達(dá)的影響

下丘腦弓狀核NPY神經(jīng)元是一個(gè)關(guān)鍵的攝食中樞， 主要的外周和中樞中關(guān)于能量平衡的信號(hào)在這里感應(yīng)和集成， NPY神經(jīng)元誘導(dǎo)攝食來響應(yīng)外周代謝狀態(tài)［38］。在哺乳動(dòng)物中， NPY可改變攝食行為，并與脂肪調(diào)節(jié)密切相關(guān)， 在調(diào)節(jié)能量平衡方面發(fā)揮著重要作用［39］。在本研究中， 在禁食-恢復(fù)投喂條件下， NPY mRNA的表達(dá)量在腦和肝臟中都存在劇烈變化， 表明與哺乳動(dòng)物一樣， NPY對(duì)鰱的攝食和能量代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。在腦中， 禁食導(dǎo)致NPY mRNA表達(dá)量上升， 重新投喂之后下降， 表明NPY起著促進(jìn)鰱攝食的作用。值得注意的是，Narnaware等［40］發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)過72h禁食后， 金魚腦NPY mRNA表達(dá)量顯著上升， 隨后恢復(fù)投餌3h， NPY表達(dá)量快速下降到正常水平； 曹磊等［27］研究黃顙魚NPY發(fā)現(xiàn)， 禁食96h后， 黃顙魚腦NPY mRNA表達(dá)量顯著增加， 重新投喂后3h NPY的表達(dá)量即下降到正常水平； 在本研究中， 禁食前5d， NPY mRNA 的表達(dá)量一直無明顯變化， 禁食第7天， NPY的表達(dá)量開始顯著上升， 恢復(fù)投喂6h后即下降到正常水平； Kehoe等［28］在大西洋鱈中發(fā)現(xiàn)， 禁食7d其NPY mRNA表達(dá)量都沒有明顯變化。上述研究表明， NPY系統(tǒng)沒有在禁食一開始就呈現(xiàn)出明顯的調(diào)節(jié)作用， 并且在不同種類的魚中NPY出現(xiàn)調(diào)節(jié)作用的禁食時(shí)間不一致， 推測(cè)這可能與各種魚的耐饑餓能力有關(guān)，只有饑餓達(dá)到一定程度才能引起NPY系統(tǒng)的響應(yīng)。

與腦中一樣， 在禁食-再投喂條件下， 肝臟中的NPY mRNA水平也發(fā)生了劇烈變化， 禁食前5天NPY mRNA表達(dá)量顯著上升， 隨后急劇下降直到重新投喂4h后恢復(fù)到基本水平， 表明肝臟中的NPY系統(tǒng)對(duì)禁食-再投喂條件產(chǎn)生了響應(yīng)， 也參與鰱攝食和能量代謝的調(diào)節(jié)。但是， 肝臟中NPY mRNA的表達(dá)情況與腦中的明顯不一致， Sucajtys-Szulc等［41］研究慢性限食對(duì)大鼠腦和肝臟NPY mRNA的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)， 長(zhǎng)期限食使大鼠腦NPY mRNA的表達(dá)量上升， 而肝臟NPY mRNA的表達(dá)量卻下降。因此猜測(cè)腦和肝臟中的NPY參與動(dòng)物攝食和能量代謝的方式可能不同， 但關(guān)于動(dòng)物肝臟中的NPY的研究報(bào)道較少， NPY在動(dòng)物肝臟中的具體作用并不十分清楚，NPY在鰱肝臟中的作用機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。

［1］Matteri R L. Overview of central targets for appetite regulation ［J］. Animal Science， 2001， 79: E148—E158

［2］Xie X J， Deng L， Zhang B， et al. Advances and studies on ecophysiological effects of starvation on fish ［J］. Acta Hydrobiologica Sinica， 1998， 22（2）: 181—188 ［謝小軍， 鄧?yán)?張波， 等. 饑餓對(duì)魚類生理生態(tài)學(xué)影響的研究進(jìn)展.水生生物學(xué)報(bào)， 1998， 22（2）: 181—188］

［3］Tatemoto K， Carlquist M， Mutt V. Neuropeptide Y-a novel brain peptide with structural similarities to peptide YY and pancreatic polypeptide ［J］. Nature， 1982， 296（5858）: 659—660

［4］Stanley B G， Kyrkouli S E， Lampert S， et al. Neuropeptide Y chronically injected into the hypothalamus: a powerful neurochemical inducer of hyperphagia and obesity ［J］. Peptides， 1986， 7（6）: 1189—1192

［5］Woods S C， Figlewicz D P， Madden L， et al. NPY and food intake: discrepancies in the model ［J］. Regulatory Peptides， 1998， （75—76）: 403—408

［6］Gehlert D R. Role of hypothalamic neuropeptide Y in feeding and obesity ［J］. Neuropeptides， 1999， 33（5）: 329—338

［7］Liao W Q， Liang X F， Fang L. Research of NPY gene and its appetite regulation mechanism ［J］. Water Conservancy Related Fisheries， 2005， 25（4）: 35—37 ［廖婉琴，梁旭方， 方玲. 魚類神經(jīng)肽Y基因及其食欲調(diào)控機(jī)理研究. 水利漁業(yè)， 2005， 25（4）: 35—37］

［8］Silverstein J T， Plisetskaya E M. The effects of NPY and insulin on food intake regulation in fish ［J］. Integrative and Comparative Biology， 2000， 40（2）: 296—308

［9］Wang Q， Tan X G， Sun W， et al. Expression of recombinant flounder NPY protein in vitro and detection of endogenous NPY in flounder ［J］. Marine Sciences， 2014，38（4）: 15—19 ［王倩， 譚訓(xùn)剛， 孫威， 等. 牙鲆NPY的體外表達(dá)及體內(nèi)檢測(cè). 海洋科學(xué)， 2014， 38（4）: 15—19］

［10］López-Pati?o M A， Guijarro A I， Isorna E， et al. Neuropeptide Y has a stimulatory action on feeding behavior in goldfish （Carassius auratus） ［J］. European Journal of Pharmacology， 1999， 377（2—3）: 147—153

［11］Carpio Y， Acosta J， Morales A， et al. Cloning， expression and growth promoting action of Red tilapia （Oreochromis sp.） neuropeptide Y ［J］. Peptides， 2006， 27（4）: 710—718

［12］Peterson B C， Waldbieser G C， Riley L G， et al. Pre-and postprandial changes in orexigenic and anorexigenic factors in channel catfish （Ictalurus punctatus） ［J］. General and Comparative Endocrinology， 2012， 176（2）: 231—239

［13］Zhang S M， Deng H， Wang D Q， et al. Population structure and genetic diversity of silver carp and grass carp from populations of Yangtze River system revealed by RAPD ［J］. Acta Hydrobiologica Sinica， 2001， 25（4）: 324—330 ［張四明， 鄧懷， 汪登強(qiáng)， 等. 長(zhǎng)江水系鰱和草魚遺傳結(jié)構(gòu)及變異性的RAPD研究. 水生生物學(xué)報(bào)，2001， 25（4）: 324—330］

［14］China Fishery Statistical Yearbook ［M］. Beijing: Chinese Agriculture Press. 2004—2014 ［中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社. 2004—2014］

［15］Huising M O， Geven E J W， Kruiswijk C P， et al. Increased leptin expression in common carp （Cyprinus carpio） after food intake but not after fasting or feeding to satiation ［J］. Endocrinology， 2006， 147（12）: 5786—5797

［16］Lindblom J， Haitina T， Fredriksson R， et al. Differential regulation of nuclear receptors， neuropeptides and peptide hormones in the hypothalamus and pituitary of food restricted rats ［J］. Molecular Brain Research， 2005，133（1）: 37—46

［17］Tanic N， Perovic M， Mladenovic A， et al. Effects of aging， dietary restriction and glucocorticoid treatment on housekeeping gene expression in rat cortex and hippocampus — evaluation by real time RT-PCR ［J］. Journal of Molecular Neuroscience， 2007， 32（1）: 38—46

［18］Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod ［J］. Methods， 2001， 25（4）: 402—408

［19］Mattews J E， Jansen M， Lyerly D， et al. Pharmacological characterization and selectivity of the NPY antagonist GR231118 （1229U91） for different NPY receptors ［J］. Regulatory Peptides， 1997， 72（2—3）: 113—119

［20］Yu Y， Liang X F， Li S Y， et al. Molecular cloning and evolutional analysis of NPY， UCP2， LPL and HL gene of Largemouth Bass （Micropterus salmoides） ［J］. Acta Hydrobiologica Sinica， 2008， 32（6）: 900—907 ［于燕， 梁旭方， 李詩(shī)盈， 等. 大口黑鱸脂代謝相關(guān)基因NPY， UCP2，LPL， HL克隆與分子進(jìn)化分析. 水生生物學(xué)報(bào)， 2008，32（6）: 900—907］

［21］Aboumder R， Elhusseiny A， Cohen Z， et al. Expression of neuropeptide Y receptors mRNA and protein in human brain vessels and cerebromicrovascular cells in culture［J］. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism，1999， 19（2）: 155—163

［22］Heilig M， Widerl?v E. Neuropeptide Y: an overview of central distribution， functional aspects， and possible involvement in neuropsychiatric illnesses ［J］. Acta Psychiatrica Scandinavica， 1990， 82（2）: 95—114

［23］Doyon C， Gilmour K M， Trudeau V L， et al. Corticotropin-releasing factor and neuropeptide Y mRNA levels are elevated in the preoptic area of socially subordinate rainbow trout ［J］. General and Comparative Endocrinology，2003， 133（2）: 260—271

［24］Chen R. Cloning， prokaryotic expression and functions of NPY in orange-spotted grouper （Epinephelus coioides）［D］. Thesis for master of Science. Sun Yat-Sen University， Guangzhou. 2006 ［陳蓉. 斜帶石斑魚神經(jīng)肽Y基因的克隆、原核表達(dá)與功能研究. 碩士學(xué)位論文， 中山大學(xué)， 廣州. 2006］

［25］Yang Y， Peng H W， Li Y L， et al. Molecular cloning and tissue expression analysis of the NPY gene in Silurus meridionalis ［J］. Journal of Henan University （Natural Science）， 2013， 43（3）: 295—300 ［楊雁， 彭煥文， 李艷利， 等.南方鲇 （Silurus meridionalis） 神經(jīng)肽Y基因cDNA克隆及組織表達(dá)分析. 河南大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版）， 2013，43（3）: 295—300］

［26］Murashita K， Kurokawa T， Ebbesson L O E， et al. Characterization， tissue distribution， and regulation of agoutirelated protein （AgRP）， cocaine-and amphetamine-regulated transcript （CART） and neuropeptide Y （NPY） in Atlantic salmon （Salmo salar） ［J］. General and Comparative Endocrinology， 2009， 162（2）: 160—171

［27］Cao L， Liang H W， Li Z， et al. Cloning and expression analysis of NPY gene in yellow catfish （Pelteobagrus fulvidraco） ［J］. Journal of Northwest A and F University（Natural Science Edition）， 2013， 41（7）: 1—7 ［曹磊， 梁宏偉， 李忠， 等. 黃顙魚神經(jīng)肽Y基因 （NPY） cDNA全序列的克隆及其表達(dá)特征分析. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版）， 2013， 41（7）: 1—7］

［28］Kehoe A S， Volkoff H. Cloning and characterization of neuropeptide Y （NPY） and cocaine and amphetamine regulated transcript （CART） in Atlantic cod （Gadus morhua） ［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular and Integrative Physiology， 2007，146（3）: 451—461

［29］Liu Z F. The progress of checking methods on pituitary disease ［J］. Introduction of Japanese Medical Science，1995， 16（2）: 88—89 ［劉志凡. 垂體疾病檢查方法的進(jìn)展. 日本醫(yī)學(xué)介紹， 1995， 16（2）: 88—89］

［30］Macdonald E， Volkoff H. Cloning， distribution and effects of season and nutritional status on the expression of neuropeptide Y （NPY）， cocaine and amphetamine regulated transcript （CART） and cholecystokinin （CCK） in winter flounder （Pseudopleuronectes americanus） ［J］. Hormones and Behavior， 2009， 56（1）: 58—65

［31］Macdonald E， Volkoff H. Neuropeptide Y （NPY）， cocaine and amphetamine-regulated transcript （CART） and cholecystokinin （CCK） in winter skate （Raja ocellata）: cDNA cloning， tissue distribution and mRNA expression responses to fasting ［J］. General and Comparative Endocrinology， 2009， 161（2）: 252—261

［32］Li Z H. The cDNA cloning and characterization analysis of NPY gene in Mystus macropterus Bleeker ［D］. Thesis for master of Science. School of Life Science Southwest University， Chongqing. 2011 ［李振華. 大鰭鳠NPY基因cDNA克隆及特征分析. 碩士學(xué)位論文， 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 重慶. 2011］

［33］Cerdá-Reverter J M， Mart??nez-Rodr??guez G， Zanuy S， et al. Cloning the neuropeptide Y exon 2 from sea bass（Dicentrarchus labrax） ［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology， 1999， 123（2）: 181—186

［34］Dumont Y， Martel J C， Fournier A， et al. Neuropeptide Y and neuropeptide Y receptor subtypes in brain and peripheral tissues ［J］. Progress in Neurobiology， 1992， 38（2）: 125—167

［35］Shahbazi F， Holmgren S， Larhammar D， et al. Neuropeptide Y effects on vasorelaxation and intestinal contraction in the Atlantic cod Gadus morhua ［J］. American Journal of Physiology， 2002， 282（5）: 1414—1421

［36］Bjenning C， Hazon N， Balasubramaniam A， et al. Distribution and activity of dogfish NPY and Peptide YY in the cardiovascular system of the common dogfish ［J］. American Journal of Physiology， 1993， 264（6）: 1119—1124

［37］Bjenning C， Holmgren S， Farrell A P. Neuropeptide Y potentiates contractile response to norepinephrine in skate coronary artery ［J］. American Journal of Physiology，1993， 265（2）: 661—665

［38］Kohno D， Yada T. Arcuate NPY neurons sense and integrate peripheral metabolic signals to control feeding ［J］. Neruopeptides， 2012， 46（6）: 315—319

［39］Wang J， Wang Y J. Influence of different diet on NPY expression in arcuate nucleus of rats hypothalamus ［J］. Journal of Chengde Medical College， 2012， 29（3）: 241—243 ［王晶， 王英杰. 不同膳食對(duì)大鼠下丘腦弓狀核NPY表達(dá)的影響. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2012， 29（3）: 241—243］

［40］Narnaware Y K， Peter R E. Effects of food deprivation and refeeding on neuropeptide Y （NPY） mRNA levels in goldfish ［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology， 2001，129（2—3）: 633—637

［41］Sucajtys-Szulc E， Goykea E， Korczynska J， et al. Chronic food restriction differentially affects NPY mRNA level in neurons of the hypothalamus and in neurons that innervate liver ［J］. Neuroscience Letters， 2008， 433（3）: 174—177

CLONING AND EXPRESSION OF NPY IN THE SILVER CARP（HYPOPHTHALMICHTHYS MOLITRIX） DURING FASTING AND REFEEDING

YANG Zhen-Yu1，2， WANG Dan2，3， LI Zhong2， LIANG Hong-Wei2， ZHAO Jin-Kun1，2，LUO Xiang-Zhong2and ZOU Gui-Wei2
（1. College of Fisheries， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China； 2. Yangtze River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fisheries Sciences， Wuhan 430223， China； 3. Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuxi 214081， China）

NPY plays a significant role in regulating food intake and energy metabolism in teleosts. To understand the biological role of NPY in the silver carp （Hypophthalmichthys molitrix）， in this study we determined the full-length cDNA sequence of NPY and investigated the effect of fasting and refeeding on the level of NPY mRNA in the brain and the liver. The full cDNA sequence of NPY consisted of 782 bp， including a 291 bp open reading frame that potentially encodes 96 amino acids， a 68 bp 5′-untranslated region and a 423 bp 3′-untranslated region. Our study on the similarity of the amino acid sequence and the phylogenetic analysis of NPY demonstrated that the NPY gene was relatively conservative during the molecular evolution. The mRNA of NPY was ubiquitously expressed in all the tested tissues and especially abundant in the pituitary. In the brain， the expression of NPY mRNA increased significantly during fasting，and then decreased to the basal level at 6h after refeeding， which indicated that NPY could boost the food intake of the silver carp. In the liver， the expression of NPY mRNA increased significantly until 5d after fasting， then decreased sharply on the 7thday， and finally

to the basal level at 4h after refeeding. NPY was expressed in a tissue-specific pattern in both the brain and the liver. However， the function of NPY in the liver needs further study. Our study provided insights into the biological roles of NPY in the silver carp.

Silver carp； NPY gene； Fasting； Refeeding； Gene expression analysis

10.7541/2016.33

Q344+.1

A

1000-3207（2016）02-0235-08

2015-02-05；

2015-05-20

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-46-01）； “十二五”科技支撐計(jì)劃（2012BAD26B02）； 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2015JBFM39）； 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題； 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金資助（2013SC14）資助 ［Supported by the earmarked fund for China Agriculture Research System （No. CARS-46-01）； National Science and Technology Support Program （No. 2012BAD26B02）； National Nonprofit Institute Research Grant of Freshwater Fisheries Research Center （No. 2015JBFM39）； Key Laboratory of Tropical& Subtropical Fishery Resource Application and Cultivation， Ministry of Agriculture； Fundamental Research Funds for the Central Universities of China （No. 2013SC14）］

楊鎮(zhèn)宇（1989—）， 女， 四川宜賓人； 碩士研究生； 主要從事魚類遺傳育種研究。E-mail: yzhygood@163.com

鄒桂偉， E-mail: zougw@yfi.ac.cn