一株耐低溫原油降解菌的分離鑒定及降解特性

楊蕊琪，薛林貴，*，常思靜，章高森，陳 拓，劉光琇

(1.蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室，中國科學(xué)院 寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所 沙漠與沙漠化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

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一株耐低溫原油降解菌的分離鑒定及降解特性

楊蕊琪1，薛林貴1，*，常思靜2，章高森2，陳 拓2，劉光琇2

(1.蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室，中國科學(xué)院 寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所 沙漠與沙漠化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

從青藏高原祁連山地區(qū)的土壤中分離篩選出一株高效耐低溫原油降解菌YF28-1(8)，其降解率為(57.90±3.86)%，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化及16S rRNA同源性分析進(jìn)行初步鑒定，確定該菌株為紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)。通過氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、紫外分光光度法和重量法對原油降解菌降解性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明，降解菌YF28-1(8)對原油中的烷烴組分均有不同程度的降解，但對直鏈烷烴具有較強(qiáng)的生物降解作用。該菌株的最適降解條件為：初始pH 7.5、溫度30 ℃、接種量800 μL，培養(yǎng)8 d后生長量及降解率達(dá)到最大值，吐溫80的添加只略微提高了菌株降解率。

低溫；原油降解菌；GC-MS；降解特性

石油作為重要的能源物質(zhì)廣泛應(yīng)用于人類生活和生產(chǎn)的各個方面，隨著開采量的增加，以及有限的技術(shù)和淡薄的環(huán)保意識，使土壤的污染日益嚴(yán)重，破壞了正常的生態(tài)平衡[1]。而近年來，寒區(qū)油氣資源的開發(fā)利用成為熱點，輸油管道的使用出現(xiàn)了不同程度的泄漏事故，對凍土區(qū)的環(huán)境造成了嚴(yán)重的影響[2]。青藏高原作為常年的高寒環(huán)境，凍土層較深，平均氣溫低，影響了烴類污染的生物修復(fù)效率[3]。因此，對該區(qū)土壤石油污染的有效治理顯得非常重要。目前生物降解被認(rèn)為是最安全、環(huán)保、低成本的方法，故急需從自然界中尋找耐低溫微生物以加快凍土區(qū)原油污染的生物修復(fù)。

據(jù)統(tǒng)計，自然界中能夠降解利用石油烴類的微生物約有30多個屬200多種[4]，涵蓋細(xì)菌、真菌以及酵母菌，而細(xì)菌占了主要地位[5]。降解菌主要有：紅球菌屬(Rhodococcussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)、不動桿菌屬(Acinetobactersp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenessp.)、微球菌屬(Mirococcussp.)、諾卡氏菌屬(Nocardiasp.)等[6-8]，其中大多數(shù)降解菌存活于常溫環(huán)境，而寒冷環(huán)境下的微生物存活率較低[9]，故分離篩選出對原油具有高效降解的耐低溫菌種，可為低溫下原油污染土壤的微生物修復(fù)提供基礎(chǔ)。

本試驗從青藏高原祁連山地區(qū)的土壤中富集分離到一株具有低溫高效原油降解能力的菌株，經(jīng)生理生化實驗及16S rRNA同源性分析進(jìn)行初步鑒定，并通過氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、紫外分光光度法和重量法對原油降解菌降解性能進(jìn)行研究，以期為青藏高原等高寒地區(qū)污染土壤的生物修復(fù)提供高效降解菌株。

1 材料與方法

1.1 采樣地點及原油來源

本研究所用土樣為青藏高原祁連山地區(qū)(100°23′02.3″ E，38°02′23.0″ N，海拔3 128 m)，該地區(qū)年平均氣溫在0.7 ℃，最熱月(7月)平均氣溫在10～15 ℃左右[10]，故土壤常年處于冷環(huán)境中。

試驗中所用原油為黑色黏稠液體，無刺激氣味，不溶于水，熔(凝固)點為-60 ℃。此原油由甘肅省蘭州石化分公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：硝酸銨3.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，金屬鹽溶液2 mL (硫酸鎂0.4 %，硫酸銅0.1 %，硫酸錳0.1 %，硫酸亞鐵0.1 %，氯化鈣0.1 %)，ddH2O 1 L，pH調(diào)節(jié)至7.5左右[11]。

216L培養(yǎng)基：乙酸鈉1.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物2.0 g，枸櫞酸鈉0.5 g，硝酸銨0.2 g，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(OXOID)0.5 g，ddH2O 1 L，pH調(diào)節(jié)至7.6左右[12]。216L培養(yǎng)基原文獻(xiàn)中的海水在本研究中替換為ddH2O。

MM培養(yǎng)基(無碳源)：氯化鎂3.5 g，硝酸銨1.0 g，氯化鉀0.35 g，氯化鈣0.05 g，溴化鉀0.08 g，氯化鐵0.01 g，金屬鹽溶液1 mL(硫酸鋅0.01%，氯化鍶2.4%)，磷酸鹽溶液10 mL(磷酸氫二鉀10%，磷酸二氫鉀10%)，ddH2O 989 mL，pH調(diào)節(jié)至7.5左右[13]。

1.3 原油降解菌的富集與分離

將10 g土樣加入含有滅菌原油的60 mm培養(yǎng)皿中，混合均勻于20 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，取2 g污染后的土樣于生理鹽水中振蕩30 min。將200 μL土壤懸液接入5 mL含原油的無機(jī)鹽培養(yǎng)基試管中(添加的原油作為唯一碳源，添加量2%，m/V)，20 ℃ 150 r·min-1振蕩富集培養(yǎng)7 d，取富集液梯度稀釋，涂布于216L培養(yǎng)基上，20 ℃下倒置培養(yǎng)。通過劃線法分離純化后，取單菌落接種培養(yǎng)得到菌液，加入20%滅菌甘油于-80 ℃冰箱保存[14]。

1.4 原油降解菌的鑒定

對所得菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，同時進(jìn)行分子生物學(xué)(16S rDNA擴(kuò)增)鑒定。通用引物：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[15]。擴(kuò)增體系：10×Taq緩沖液2.5 μL，25 mmol·L-1MgCl23 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL，5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.2 μL，1 μL的引物(27F和1492R，10 μmol·L-1)，DNA模板1～2 μL，最后加ddH2O 補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性1 min，56 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1.5 min(30個循環(huán))；最后72 ℃延伸20 min。PCR產(chǎn)物送由上海美吉生物工程有限公司完成測序，并通過軟件MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 原油降解率的測定

將分離純化所得單菌接種到216 L液體培養(yǎng)基中，取生長在對數(shù)期的菌液離心，棄掉上清后用無菌生理鹽水洗滌并調(diào)整菌液濃度至D600=0.7，接種菌液到以原油(2%，m/V)為唯一碳源的MM培養(yǎng)基中，20 ℃振蕩培養(yǎng)7 d。單菌生長情況通過D600表征[16]，同時用重量法對原油降解率進(jìn)行測定，以未接種菌的原油培養(yǎng)基作為對照，每株菌設(shè)3個平行。

重量法[17]：向振蕩7 d的MM液體培養(yǎng)基中加入10 mL石油醚，晃勻萃取，并將培養(yǎng)液以5 000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)至分液漏斗，振蕩多次，靜置分層后，收集上層液，用石油醚洗滌后合并上層液，在65 ℃烘箱中烘干稱量。計算降解率，計算公式如下：

1.6 原油降解特性研究

同上述1.5節(jié)的方法，將正己烷洗滌的菌液全部倒入60 mL的分液漏斗中，充分振蕩使其中剩余原油充分萃取到有機(jī)溶劑相中，靜置分層后用無水Na2SO4脫水，用 0.22 μm 耐有機(jī)溶劑濾膜過濾，將過濾后的溶液進(jìn)行GC-MS分析。試驗所用色譜柱為 VARIAN(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細(xì)管柱；檢測器溫度為280 ℃；升溫程序：60 ℃恒溫2 min，以升溫速率為8 ℃·min-1升溫到280 ℃，然后再恒溫5 min；載氣(N2)流量為1 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度為270 ℃；進(jìn)樣量為2 μL；分流比為1∶1 (V/V)[18-19]。

1.7 影響原油降解因素試驗

以原油(2%，m/V)為唯一碳源的MM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別設(shè)定不同pH、溫度、接種量、處理時間及吐溫80濃度等因素，在20 ℃，150 r·min-1的搖床上振蕩培養(yǎng)7 d測其降解率，以不加菌的體系作對照，每組設(shè)3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離到的菌株

以原油為唯一碳源篩出9株細(xì)菌，通過原油降解試驗發(fā)現(xiàn)一株能夠在低溫下高效降解原油的菌株，編號為YF28-1(8)。

在MM原油培養(yǎng)基的搖瓶中，經(jīng)20 ℃ 150 r·min-1培養(yǎng)7 d后，從圖1可以看出，對照組的培養(yǎng)液透明澄清，液體表面及瓶壁覆蓋有一層油膜；而添加菌體的培養(yǎng)液則相對混濁，原油呈球狀分散，表面及瓶壁油膜減少。經(jīng)計算菌株YF28-1(8)降解率為(57.90±3.86)%。

2.2 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)特征：在216L固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌株YF28-1(8)的菌落呈圓豆?fàn)?，乳白色，表面光滑凸起，邊緣整齊，呈短桿狀，革蘭氏陽性菌(圖2)，淀粉水解、葡萄糖產(chǎn)酸、葡萄糖產(chǎn)氣、吲哚實驗、V.P.實驗和M.R.實驗均呈陰性，檸檬酸鹽反應(yīng)呈陽性。

a，對照；b，處理后a， Control group；b， Experimental group圖1 菌株YF28-1(8)的降解效果Fig.1 Degradation effect of YF28-1(8) strain

A，革蘭氏染色；B，菌落形態(tài)A， Gram staining；B， The morphological of bacterial colony圖2 菌株YF28-1(8)的形態(tài)Fig.2 The morphological characteristics of the YF28-1(8) strain

分子生態(tài)學(xué)特征：根據(jù)菌株YF28-1(8)的16S rDNA基因序列分析表明：該菌與紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)極為相似，同源性為100%，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

2.3 菌株YF28-1(8)的降解特性

將菌株YF28-1(8)搖床培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行GC-MS分析(圖4)，與陰性對照相比，原油中的烷烴組分均被不同程度地降解，其中菌株對直鏈的飽和烷烴具有較強(qiáng)的生物降解作用，且無論是偶碳數(shù)還是奇碳數(shù)飽和烷烴都具有較強(qiáng)的降解能力。

圖5為通過計算峰值面積而得到的各組分降解率。降解率計算公式：η=(1-n1/n0)×100%，其中，n1為降解后峰值面積，n0為降解前峰值面積[20]。從圖5可知，菌株對短直鏈烷烴的降解率最高，可達(dá)88%左右，而對中鏈烷烴和長鏈烷烴的降解率則較低，對芳烴和環(huán)芳烴的降解能力均不及飽和烴，且大部分難以降解。

2.4 降解菌YF28-1(8)的單因素實驗

2.4.1 pH值對原油降解率的影響

將MM原油培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0，接種D600=0.7的菌懸液200 μL搖床培養(yǎng)，觀察pH值對菌株原油降解率的影響。由圖6可知，菌株的最適生長pH值在7.5左右，此時對原油的降解率也達(dá)到最大值，達(dá)到51%左右。當(dāng)pH值調(diào)節(jié)為8.0時，其降解率略低于pH 6.0而高于pH 5.0，這可能是由于pH 6.0～8.0時使得菌株能夠很好地利用P，使得微生物的生長代謝加快，從而促進(jìn)了對原油的降解率[21]。由此可見，中性環(huán)境中，菌株的降解率最好，環(huán)境若偏酸或偏堿，均會影響菌株的生長量以及對原油的降解效果。有研究表明，重量法所測結(jié)果更為全面和精確[22]，然而操作過程復(fù)雜且要求較高。故本試驗采用重量法測定原油降解率，但部分?jǐn)?shù)據(jù)誤差較大，其原因可能是在接種及搖瓶過程中操作不當(dāng)所導(dǎo)致，而此因素對實驗整體結(jié)果影響并不大。

圖3 菌株YF28-1(8)的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic dendrogram based on a comparison of the 16S rDNA sequence of YF28-1(8)

圖4 菌株YF28-1(8)對原油降解前(A)后(B)氣相圖譜Fig.4 Gas chromatogram of crude oil extracted at 7 d from the control (A) and experimental (B) flask in biodegradation study with strain YF28-1(8)

圖5 菌株YF28-1(8)對原油中各不同鏈長烷烴的降解率Fig.5 Percentage of n-alkane degradation in crude oil by the strain YF28-1(8)

圖6 pH值對原油降解率的影響Fig.6 Effect of pH value on biodegradation rates of crude oil

2.4.2 菌株培養(yǎng)時間對原油降解率的影響

培養(yǎng)時間的長短，在一定程度上反映了菌株利用原油作為唯一碳源生長的情況。將D600=0.7的菌懸液接種于pH 7.5的MM原油培養(yǎng)基中，20 ℃搖床上分別培養(yǎng)2、4、6、8、10 d，測其D值和原油降解率。由圖7可知：菌株YF28-1(8)的生長量及原油降解率均隨時間的延長而增加，菌株進(jìn)入生長對數(shù)期，8 d后生長量及降解率達(dá)到最大值。到后期，菌體開始衰亡，整個反應(yīng)體系降解活性減弱，以及剩余原油組分越來越難降解等原因，使得菌株對原油的降解速率逐漸下降[23]。可見菌株的生長很大程度上影響了原油的降解。

圖7 培養(yǎng)時間對原油降解率的影響Fig.7 Effect of culture time on biodegradation rates of crude oil

2.4.3 溫度對原油降解率的影響

將濃度D600=0.7的菌懸液接種200 μL于含原油的MM培養(yǎng)基中，pH調(diào)至7.5，分別在4、10、20、30、40 ℃的搖床上150 r·min-1培養(yǎng)7 d，測其D值和原油降解率，結(jié)果見圖8。從圖8可以看出，溫度對菌株的生長和降解率影響較大，這可能與溫度對石油物理狀態(tài)、化學(xué)組成以及生物酶活性的影響有關(guān)[24]，當(dāng)溫度處于20～30 ℃范圍內(nèi)培養(yǎng)液渾濁，油膜減少且菌株生長代謝良好，能夠較好地降解原油；當(dāng)溫度高于40 ℃時，培養(yǎng)液澄清透明，菌株YF28-1(8)的生長量及降解率呈現(xiàn)急劇下降的趨勢；處于4～10 ℃的溫度范圍時，培養(yǎng)液澄清透明，但隨著溫度增高，菌株生長量及降解率均呈上升趨勢，可見該菌株對低溫環(huán)境有一定的適應(yīng)性。因微生物對原油的降解是通過氧化酶系的催化作用來完成，溫度的過高或過低，均會抑制微生物的生長代謝活性[25]。故常年處于冷環(huán)境的土壤中，耐低溫菌種對原油的降解具有很大貢獻(xiàn)。

2.4.4 接種量對原油降解率的影響

將濃度D600=0.7的菌懸液分別以100、200、400、600、800 μL的接種量接種于含原油的MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，D值和原油降解率的變化情況見圖9。從圖9中可看出，隨著接種量的增加，菌株的生長量及原油降解率均呈逐漸升高的趨勢，當(dāng)接種量處于600～800 μL時，菌株生長量雖處于升高趨勢但降解率達(dá)到最大值且趨于平穩(wěn)狀態(tài)，可見，過多的接種量會使菌體在有限的空間內(nèi)大量繁殖，種內(nèi)競爭加劇，營養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，最終影響了微生物對原油的降解吸收效率[26]。故在實際應(yīng)用中，為了獲得較高的降解率，對接種量的把握非常重要。

圖8 溫度對原油降解率的影響Fig.8 Effect of temperature on biodegradation rate ofcrude oil

圖9 初始菌濃度對原油降解率的影響Fig.9 Effect of initial strain concentration on biodegradation rate of crude oil

2.4.5 吐溫80對原油降解率的影響

在石油烴降解過程中，表面活性劑可促進(jìn)水中原油的溶解度并且使微生物快速降解烴類物質(zhì)[27]。從圖10可以看出，隨著表面活性劑量的增加，菌株YF28-1(8)的降解率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，可見吐溫80的添加可使菌株原油降解率增高，然而增高程度并不顯著。張麗芳等[28]在研究中發(fā)現(xiàn)，添加低濃度的月桂酸鈉和吐溫80對提高除油率作用不明顯，這與本研究結(jié)果一致。也有大量學(xué)者發(fā)現(xiàn)，生物表面活性劑能夠提高微生物的除油效果[29-30]，故在實際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)實際情況選擇適宜的表面活性劑。

圖10 吐溫80濃度對原油降解率的影響Fig.10 Effect of Tween 80 concentration on biodegradation rate of crude oil

3 結(jié)論

(1)本研究從青藏高原祁連山地區(qū)的土壤中分離篩選出一株高效低溫原油降解菌YF28-1(8)，降解率為(57.90±3.86)%。通過生理生化及16S rDNA同源性分析初步鑒定菌株YF28-1(8)為紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)，此株菌可以以原油作為唯一碳源進(jìn)行生長代謝。

(2)采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)對原油降解性能進(jìn)行測定，并對原油組分的降解情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)菌株YF28-1(8) 對原油中的烷烴組分均有不同程度的降解，對直鏈的飽和烷烴具有較強(qiáng)的生物降解作用，對短直鏈烷烴的降解率最高，可達(dá)88%左右；對中鏈烷烴和長鏈烷烴的降解率則較低，對芳烴和環(huán)芳烴的降解能力均不及飽和烴，且大部分難以降解。

(3)通過單因素實驗，確定了YF28-1(8) 菌株最佳的原油降解條件：pH 7.5，溫度30 ℃，接種量800 μL，培養(yǎng)8 d時生長量及降解率達(dá)到最大值，其中吐溫80的添加僅略微促進(jìn)了菌株降解率，作用不顯著。雖然該菌株的最佳生長及降解溫度是30 ℃，然而在4～10 ℃的冷環(huán)境中該菌株仍能生長，可見該菌株為耐冷微生物。

(4)由于大量青藏工程的建設(shè)及運營(青藏鐵路、公路、輸油管線等)，使這個長期處于高寒地區(qū)的生態(tài)環(huán)境已受到較大的烴類污染[31]，而溫度是影響生物修復(fù)的最大制約條件，所以本試驗篩選的YF28-1(8) 菌株可在低溫下保持生長繁殖，當(dāng)受到原油刺激時也可保持較高降解率，這對微生物資源的補(bǔ)充和青藏高原高寒地區(qū)石油污染的生物修復(fù)具有重要意義。

[1] HEAD I M, JONES D M, R?LING W F M. Marine microorganisms make a meal of oil[J].NatureReviewsMicrobiology, 2006, 4(3): 173-182.

[2] 金會軍，喻文兵，陳友昌，等. 多年凍土區(qū)輸油管道工程中的(差異性)融沉和凍脹問題[J]. 冰川凍土, 2005, 27(4): 454-464.

JIN H J, YU W B, CHEN Y C, et al. (Differential)frost heave and thaw settlement in the engineering design and construction of oil pipelines in permafrost regions: A review[J].JournalofGlaciologyandGeocryology, 2005, 27(3): 454-464. (in Chinese with English abstract)

[3] 李潞濱，劉振靜，楊凱，等. 青藏鐵路沿線唐古拉山口土壤微生物的ARDRA分析[J]. 生態(tài)學(xué)報, 2008, 28(11): 5482-5487.

LI L B, LIU Z J, YANG K, et al. Soil microbial ARDRA analysis of Tanggula Mountain pass along the Qinghai-Tibet railway[J].ActaEcologicaSinica, 2008, 28(11): 5482-5487. (in Chinese with English abstract)

[4] 徐馮楠，馮貴穎，馬雯，等. 高效石油降解菌的篩選及其降解性能研究[J]. 生物技術(shù)通報, 2010, (7): 221-226.

XU F N, FENG G Y, MA W, et al. Study on the screening and degradation characteristics of highly efficient petroleum degrading bacteria[J].BiotechnologyBulletin, 2010, (7): 221-226. (in Chinese with English abstract)

[5] ESMAEIL A L S, DROBIOVA H, OBUEKWE C. Predominant culturable crude oil-degrading bacteria in the coast of Kuwait[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 2008, 63(4): 400-406.

[6] JURELEVICIUS D, ALVAREZ V M, PEIXOTO R, et al. The use of a combination of alkB primers to better characterize the distribution of alkane-degrading bacteria[J].PloSOne, 2013, 8(6): e66565.

[7] GUIBERT L M, LOVISO C L, MARCOS M S, et al. Alkane biodegradation genes from chronically polluted subantarctic coastal sediments and their shifts in response to oil exposure[J].MicrobialEcology, 2012, 64(3): 605-616.

[8] JURELEVICIUS D, COTTA S R, PEIXOTO R, et al. Distribution of alkane-degrading bacterial communities in soils from King George Island, Maritime Antarctic[J].EuropeanJournalofSoilBiology, 2012, 51: 37-44.

[9] 王紅旗，郝旭光，孫寓姣，等. 土壤中耐低溫石油降解菌的優(yōu)選、鑒定及降解性能分析[J]. 北京師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2009, 45(5/6): 509-514.

WANG H Q, HAO X G, SUN Y J, et al. Selection, identification and degradation characteristics of cold-resistant petroleum-degrading strains in soil[J].JournalofBeijingNormalUniversity(NaturalScience), 2009, 45(5/6): 509-514. (in Chinese with English abstract)

[10] 金銘，車宗璽，敬文茂，等. 祁連山水源涵養(yǎng)林區(qū)降水及溫度時空變化研究[J]. 中國沙漠, 2012, 32(4): 1071-1076.

JIN M, CHE Z X, JING W M, et al. Spatiotemporal changes of precipitation and temperature at water resources conservation mountains, China[J].JournalofDesertResearch, 2012, 32(4): 1071-1076. (in Chinese with English abstract)

[11] 賈燕，尹華，彭輝，等. 石油降解菌株的篩選、初步鑒定及其特性[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2007, 28(3): 296-301.

JIA Y, YIN H, PENG H, et al. Isolation, Identification and characteristics of crude oil-degrading microorganism[J].JournalofJinanUniversity(NaturalScience), 2007, 28(3): 296-301. (in Chinese with English abstract)

[12] WANG W P, WANG L P, SHAO Z Z. Diversity and abundance of oil-degrading bacteria and alkane hydroxylase (alkB) genes in the subtropical seawater of Xiamen Island[J].MicrobialEcology, 2010, 60(2): 429-439.

[13] WANG B J, LAI Q L, CUI Z S, et al. A pyrene-degrading consortium from deep-sea sediment of the West Pacific and its key memberCycloclasticussp. P1[J].EnvironmentalMicrobiology, 2008, 10(8): 1948-1963.

[14] DUNBAR J, TAKALA S, BARNS S M, et al. Levels of bacterial community diversity in four arid soils compared by cultivation and 16S rRNA gene cloning[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology, 1999, 65(4): 1662-1669.

[15] LANE D J. 16S/23S rRNA sequencing[C]//STACKEBRANDT E,GOODFELLOW M. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Chichester: Wiley, 1991: 125-175.

[16] SUN J, XU L, TANG Y, et al. Simultaneous degradation of phenol and n-hexadecane by Acinetobacter strains[J].BioresourceTechnology, 2012, 123: 664-668.

[17] 王博. 土壤石油降解菌的篩選與微生物生態(tài)修復(fù)研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

WANG B. Studies on isolation of oil-degrading bacteria and microbial remediation of oil contaminated soil[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012. (in Chinese with English abstract)

[18] WANG X, CHI C, NIE Y, et al. Degradation of petroleum hydrocarbons (C6-C40) and crude oil by a novel Dietzia strain[J].BioresourceTechnology, 2011, 102(17): 7755-7761.

[19] 陸健，黃瀟，伍賢明，等. 高效烷烴降解菌xcz的分離鑒定及降解特性[J]. 土壤, 2008, 40(3): 460-464.

LU J, HUANG X, WU X M, et al. Isolation, identification and characterization of a high-efficiency alkane-degrading bacterium xcz[J].Soils, 2008, 40(3): 460-464. (in Chinese with English abstract)

[20] 張魯進(jìn)，楊謙，陳中祥，等. 兩株石油降解菌的降解性能研究[J]. 南京理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010, 34(6): 849-854.

ZHANG L J, YANG Q, CHEN Z X, et al. Degreding characteristics of two petrolecm-degrading strains[J].JournalofNanjingUniversityofScienceandTechnology(NaturalScience), 2010, 34(6): 849-854. (in Chinese with English abstract)

[21] 齊永強(qiáng)，王紅旗，劉敬奇. 土壤中石油污染物微生物降解過程中各石油烴組分的演變規(guī)律[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2003, 23(6): 834-836.

QI Y Q, WANG H Q, LIU J Q. Component changes of hydrocarbon during the precess of bioremediation of hydrocarbon-contaminated soil[J].ActaScientiaeCircumstantiae, 2003, 23(6): 834-836. (in Chinese with English abstract)

[22] 徐恒剛，姚秀清，李倩，等. 兩種高效原油降解菌降解率測定方法的對比研究[J]. 化學(xué)與生物工程, 2006, 23(9): 43-44.

XU H G, YAO X Q, LI Q, et al. The contrast study on two methods for degradation rate of crude oil by high efficient degradation bacteria[J].Chemistry&Bioengineering, 2006, 23(9): 43-44. (in Chinese with English abstract)

[23] 何麗媛，黨志，唐霞，等. 混合菌對原油的降解及其降解性能的研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2010, 30(6): 1220-1227.

HE L Y, DANG Z, TANG X, et al. Biodegradation characteristics of crude oil by mixed bacterial strains[J].ActaScientiaeCircumstantiae, 2010, 30(6): 1220-1227. (in Chinese with English abstract)

[24] MARGESIN R. SCHINNER F. Effect of temperature on oil degradation by a psychrotrophic yeast in liquid culture and in oil[J].FEMSMicrobiologyEcology, 1997, 24(3): 243-249.

[25] 謝鯤鵬，周集體，曲媛媛，等. 一株耐鹽原油降解菌的分離鑒定及其降解特性研究[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2009, 28(6): 680-683.

XIE K P, ZHOU J T, QU Y Y, et al. Studies on isolation, identification of halophil crude oil degrading bacteria and their degradation capability[J].MarineEnvironmentalScience, 2009, 28(6): 680-683. (in Chinese with English abstract)

[26] 白潔，崔愛玲，呂艷華. 石油降解菌對石油烴的降解能力及影響因素研究[J]. 海洋湖沼通報, 2007(3): 41-48.

BAI J, CUI A L, LV Y H. The degradation capability of crude oil degrading strains and the impacting factors[J].TransactionsofOceanologyandLimnology, 2007(3): 41-48. (in Chinese with English abstract)

[27] 馬愛青，陳連喜，包木太. 表面活性劑對原油生物降解的強(qiáng)化作用[J]. 油田化學(xué), 2011, 28(2): 224-228.

MA A Q, CHEN L X, BAO M T. Reinforcement effect of surfactants on petroleum biodegradation[J].OilfieldChemistry, 2011, 28(2): 224-228. (in Chinese with English abstract)

[28] 張麗芳，肖紅，魏德洲. 表面活性劑對土壤石油污染物微生物降解的影響[J]. 遼寧化工, 2002, 32(12): 509-513.

ZHANG L F, XIAO H, WEI D Z. Effect of surfactants on biodegradation of petroleum-contaminated soil[J].LiaoningChemicalIndustry, 2002, 32(12): 509-513. (in Chinese with English abstract)

[29] 王冬梅，陳麗華，周立輝，等. 鼠李糖脂對微生物菌劑降解石油的影響[J]. 環(huán)境工程學(xué)報, 2013, 7(10): 4121-4126.

WANG D M, CHEN L H, ZHOU L H, et al. Effects of rhamnolipid on petroleum degradation of compound microbial inoculant[J].ChineseJournalofEnvironmentalEngineering, 2013, 7(10): 4121-4126. (in Chinese with English abstract)

[30] ARONSTEIN B N, CALVILLO Y M, ALEXANDER M. Effect of surfactants at low concentrations on the desorption and biodegradation of sorbed aromatic compounds in soil[J].EnvironmentalScience&Technology, 1991, 25(10): 1728-1731.

(責(zé)任編輯 張 韻)

Studies on isolation， identification of cold-resistant petroleum-degrading strain and its degradation capability

YANG Rui-qi1， XUE Lin-gui1，*， CHANG Si-jing2， ZHANG Gao-sen2， CHEN Tuo2， LIU Guang-xiu2

(1.CollegeofChemicalandBiologyEngineering，LanzhouJiaotongUniversity，KeyLaboratoryofExtremeEnvironmentalMicrobialResourcesandEngineeringofGansuProvince,Lanzhou730070，China; 2.KeyLaboratoryofExtremeEnvironmentalMicrobialResourcesandEngineeringofGansuProvince，KeylaboratoryofDesertandDesertification，ColdandAridRegionsEnvironmentalandEngineeringResearchInstitute，ChineseAcademyofSciences，Lanzhou730000，China)

We obtained a low-temperature resistant crude oil degrading strain known as YF28-1(8) from the soil samples in Qinghai-Tibet Plateau， Qilian mountain， whose degradation rate was (57.90±3.86)%. Besides， after a preliminary identification on the basis of investigation on its biochemical and biological characteristics and 16S rRNA homology analysis， we defined this strain asRhodococcuserythropolis. In addition， we drew a conclusion about degradation capability by means of GC-MS， UV-spectrophotometry， gravimetry that YF28-1(8) was able to biodegrade all alkane constituents in different degrees and especially effective to linear saturated alkane. The initial optimum conditions of this strain included: pH value at 7.5， temperature at 30 ℃ and inoculation size of 800 μL and its quantity and degradation rate could reach maximum in only 8 days， meanwhile， surfactant named Tween 80 could only slightly improve its degradation rate.

low-temperature; crude oil degrading bacterial; GC-MS; degradation capability

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.21

2015-12-23

國家國際科技合作專項項目(2014DFA30330)；國家自然科學(xué)基金項目(31260090，31260135)

楊蕊琪(1989—)，女，甘肅平?jīng)鋈耍T士研究生，從事環(huán)境微生物學(xué)方面的研究。E-mail: 514503456@qq.com

*通信作者，薛林貴，E-mail: xuelg@mail.lzjtu.cn

S476.1

A

1004-1524(2016)10-1781-09

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1781-1789

楊蕊琪，薛林貴，常思靜，等. 一株耐低溫原油降解菌的分離鑒定及降解特性[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(10)： 1781-1789.