野黃芩苷對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞Fas和FasL表達(dá)的影響

李　戈，李俊玫，葛志華，楊　寧， 楊佳寧

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000）

野黃芩苷對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞Fas和FasL表達(dá)的影響

李戈，李俊玫△，葛志華，楊寧， 楊佳寧

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000）

目的：觀察野黃芩苷對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞Fas和FasL表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞分為對(duì)照組、不同濃度野黃芩苷藥物組，野黃芩苷組分別用80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml的野黃芩苷作用人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞48h。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察野黃芩苷對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞Fas和FasL表達(dá)的影響。結(jié)果：用藥組Tca8113細(xì)胞Fas和FasL的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；并且隨著野黃芩苷藥物濃度的增加，F(xiàn)as和FasL的表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.05）。結(jié)論：野黃芩苷可能通過促進(jìn)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞Fas蛋白和FasL蛋白的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

野黃芩苷；人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞；Fas；FasL

舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是口腔癌中最常見的惡性腫瘤，惡性程度較高、生長(zhǎng)快、浸潤(rùn)性較強(qiáng)，易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移率較高。由于其位置的特殊性，以及放療、化療副作用較大，術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率均較高，5年存活率在50%-60%左右［1-2］。目前，TSCC的臨床治療主要采用手術(shù)為主、放化療為輔的綜合治療方法。中藥野黃芩苷又名燈盞花乙素，是從黃芩莖葉及燈盞細(xì)辛等藥物中分離得到的黃酮類化合物，在抗炎、抗微生物、抗變態(tài)反應(yīng)、抗腫瘤等多方面都有一定的藥理作用［3］。楊鶴松［4］的研究顯示，野黃芩苷在一定濃度下對(duì)LA795瘤株的體內(nèi)增殖具有明顯的抑制作用；另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［5］，野黃芩苷可通過激活caspase-6、致敏5-氟尿嘧啶等藥物誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。本研究通過觀察野黃芩苷對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞Fas、FasL蛋白表達(dá)的影響，探討野黃芩苷對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞是否具有凋亡誘導(dǎo)作用，以期為野黃芩苷應(yīng)用于臨床治療舌癌提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器 人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞株（南京凱基生物科技有限公司），野黃芩苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所），胎牛血清（FBS，中美合資蘭州民海生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），CO2培養(yǎng)箱（SANYO，日本），倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus，日本）。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞分為對(duì)照組、不同濃度野黃芩苷藥物組。對(duì)照組Tca8113細(xì)胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；不同濃度野黃芩苷藥物組細(xì)胞分別用含野黃芩苷終濃度為80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液處理細(xì)胞。

1.3人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞的培養(yǎng) 將人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞株用含100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素、10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，隔2-3天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞消化液為0.25%的胰蛋白酶。

1.4免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Fas、FasL的表達(dá) 三個(gè)野黃芩苷藥物組在野黃芩苷處理細(xì)胞48h后甲醇固定細(xì)胞爬片，小牛血清封閉，一抗（1：50）4℃孵育過夜，DAB顯色，光鏡下觀察Fas、FasL的表達(dá)情況。

1.5結(jié)果判定 以細(xì)胞漿和（或）胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，強(qiáng)度大于背景非特異性染色判定為陽(yáng)性產(chǎn)物。每個(gè)標(biāo)本選擇5個(gè)具有代表性的視野（×200倍），計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率：-，陽(yáng)性細(xì)胞＜25%；+，陽(yáng)性細(xì)胞25%-50%；++，陽(yáng)性細(xì)胞51%-75%；+++，陽(yáng)性細(xì)胞76%-100%。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：Fas和FasL陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿和胞膜呈棕黃色，對(duì)照組細(xì)胞胞漿著色很淺，野黃芩苷藥物組細(xì)胞隨藥物濃度的增加胞漿棕黃色逐漸增強(qiáng)。各組細(xì)胞Fas和FasL的表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著野黃芩苷藥物濃度的增加，F(xiàn)as和FasL的表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.05）。見附表：

附表 人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞Fas、FasL蛋白的表達(dá)情況

3　討論

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡過程被抑制、細(xì)胞增殖與凋亡間的平衡被破壞有關(guān)。Fas/FasL是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最主要的系統(tǒng)［6］。Fas是一種分子量為45kDa的膜蛋白，屬Ⅰ型跨膜糖蛋白，是腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員，分子結(jié)構(gòu)包括3個(gè)部分：膜外的N末端區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿的C末端區(qū)。其N端有3個(gè)富含半胱氨酸、長(zhǎng)度約40個(gè)氨基酸的死亡結(jié)構(gòu)域（DD），是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能區(qū)。正常生理情況下，F(xiàn)as在很多細(xì)胞中均有表達(dá)。FasL是一種分子量約為40kDa的Ⅱ型跨膜糖蛋白，為Fas的天然配體，僅有活化的T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和免疫赦免區(qū)域內(nèi)的體細(xì)胞等特定的細(xì)胞表達(dá)FasL。Fas與配體結(jié)合后發(fā)生三聚化，DD區(qū)與接頭蛋白FADD（Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白）的DD區(qū)結(jié)合，F(xiàn)ADD的N端通過死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與caspase-8前體蛋白和CAP3結(jié)合，激活caspase-8，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7］。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞普遍存在低表達(dá)或不表達(dá)Fas的現(xiàn)象，癌細(xì)胞Fas表達(dá)下調(diào)以抵抗FasL表達(dá)導(dǎo)致的TIL（腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞）、CTL（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）的免疫攻擊，因此有利于癌細(xì)胞生長(zhǎng)。王建廣等［8］探討Fas基因與人口腔鱗癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，結(jié)果顯示口腔鱗癌組織Fas蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率有不同程度的下降。Muraki［9］等研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗狀上皮癌Fas的表達(dá)與化療反應(yīng)、生存時(shí)間、腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)，F(xiàn)as表達(dá)陰性組對(duì)化療反應(yīng)弱，后果不佳；而Fas陽(yáng)性組對(duì)化療反應(yīng)良好，后果佳。

本研究分別用濃度為80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml的野黃芩苷作用人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞48h后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法染色檢測(cè)Fas、FasL蛋白表達(dá)的情況，結(jié)果顯示，用藥組Tca8113細(xì)胞Fas和FasL的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，并且隨著野黃芩苷藥物濃度的增加，F(xiàn)as和FasL的表達(dá)水平逐漸升高。因此提示，野黃芩苷可能通過增加Fas和FasL的表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。但要將野黃芩苷應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療，還需進(jìn)一步深入探討其促腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

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EFFECTS OF SCUTELLARIN ON EXPRESSION OF FAS AND FASL IN HUMAN TONGUE SQUAMOUS CARCINOMA TCA 8113 CELLS

LI Ge， LI Jun-mei， GE Zhi-hua， et al
(The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To observe the effects of scutellarin on expression of Fas and FasL in human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells. Methods: Human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells were cultured in vitro and divided into control group and 3 scutellarin groups with different concentrations （80μg/ml，120μg/ml， 160μg/ml）. Immunocytochemical stain was used to detect the expression of Fas and FasL in human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells. Results: The Fas and FasL expression level in Tca8113 cells of scutellarin groups was obviously higher than that of control group （P＜0.05）； Moreover， with increasing of scutellarin concentrations， the Fas and FasL expression increased gradually （P＜0.05）. Conclusions: Scutellarin may promote tumour cells apoptosis by upregulating the expression of Fas and FasL in human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells.

Scutellarin； Human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells； Fas； FasL

R739.86

【文章編號(hào)】1004-6879（2016）01-007-03

2015-05-26）