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    Cystatin C對腦缺血再灌注損傷大鼠LC3的影響*

    2016-11-24 08:05:54郭明宇彭詩博陳元操常曉棟
    關(guān)鍵詞:承德腦缺血腦組織

    郭明宇,彭詩博,陳元操,常曉棟,張 茜,陳 萌

    (1.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系本科2014級,河北承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院影像本科2014級;3.指導(dǎo)教師)

    學(xué)生園地

    Cystatin C對腦缺血再灌注損傷大鼠LC3的影響*

    郭明宇1,彭詩博2,陳元操1,常曉棟1,張茜1,陳萌3

    (1.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系本科2014級,河北承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院影像本科2014級;3.指導(dǎo)教師)

    腦缺血;再灌注損傷;自噬;LC3

    中風(fēng)是引起人類死亡和致殘的主要原因之一,其中缺血性中風(fēng)即腦梗死,主要由腦血管閉塞引起。而所有腦血管中,若大腦中動脈閉塞常會導(dǎo)致腦血流量大幅度減少,從而造成谷氨酸興奮、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等一系列神經(jīng)中毒的事件,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡,如細(xì)胞凋亡、壞死和自噬[1-3]。自噬不僅參與神經(jīng)細(xì)胞死亡的過程,還有研究發(fā)現(xiàn)自噬可以起到神經(jīng)保護(hù)的作用[4]。本研究應(yīng)用Cystatin C干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠,觀察自噬相關(guān)蛋白LC3的變化,研究Cys C對缺血再灌注損傷大鼠自噬的影響。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性清潔級Spague-Dawley大鼠24只,體質(zhì)量260-280g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。

    1.2藥物與試劑 Cystatin C(Enzo life Sciences,瑞士);一抗LC3試劑(MBL株式會社醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,日本),β-actin(中杉金橋,北京);二抗分別為辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG(KPL 美國),辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠(中杉金橋,北京)。

    1.3動物模型制備 術(shù)前禁食12h,模型組和Cys C組參照Zea-Longa改良線栓法[5]制備右側(cè)大腦中動脈閉塞2h再灌注24h模型。假手術(shù)組僅分離頸總、頸內(nèi)、頸外動脈,不做插線處理。大鼠蘇醒后模型成功標(biāo)志為:右眼出現(xiàn)Horner征、行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈,提尾時(shí)左前肢屈曲內(nèi)收。

    1.4神經(jīng)功能缺損評分 參照Longa評分標(biāo)準(zhǔn),于再灌注24h對各組大鼠進(jìn)行評分。無神經(jīng)功能缺損癥狀0分;不能完全伸展對側(cè)前爪1分;向外側(cè)轉(zhuǎn)圈2分;向內(nèi)側(cè)傾倒3分;不能自發(fā)行走,意識喪失4分。1-3分留用,0 分、4分者棄去,并及時(shí)補(bǔ)足。

    1.5方法 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、Cys C組,每組8只。Cys C組于術(shù)前60min鼠尾靜脈注射Cys C(5mg/L),假手術(shù)組和模型組注射等量生理鹽水。

    麻醉后將各組大鼠迅速處死,采用Western Blot法檢測損傷腦皮質(zhì)組織中LC3蛋白表達(dá)。模型組和Cys C組取缺血再灌注損傷側(cè)腦皮質(zhì)組織,假手術(shù)組取同側(cè)對應(yīng)部位新鮮腦皮質(zhì)組織,3組均加入裂解液后提取總蛋白,用BCA法進(jìn)行蛋白定量??偟鞍咨蠘樱郾0纺z電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,含5%脫脂奶粉的TBS緩沖液室溫封閉,分別加入一抗兔抗LC3(1:1000)、小鼠抗β-actin(1:500),4℃孵育過夜。洗膜后分別加入二抗(HRP)結(jié)合的羊抗兔(1:5000)和羊抗小鼠(1:2000)孵育;洗膜,超敏發(fā)光液(ECL)顯色劑發(fā)光,膠片曝光顯影。Quantity One 4.62軟件分析條帶的平均灰度值,以目的條帶與對應(yīng)β-actin條帶灰度值之比作為LC3蛋白表達(dá)量的相對水平。

    1.6統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1神經(jīng)功能缺損評分 假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損癥狀,模型組神經(jīng)功能缺損評分為2.43±0.51;Cys C組神經(jīng)功能缺損評分1.80±0.52,較模型組評分明顯降低(P<0.05)。

    2.2腦組織大體標(biāo)本觀察 假手術(shù)組無明顯變化,模型組腦組織大體標(biāo)本可見右側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯水腫,體積增大;與模型組相比,Cys C組腦組織水腫有所改善。

    2.3Western Blot結(jié)果 假手術(shù)組腦組織LC3蛋白表達(dá)為0.609±0.077,模型組損傷側(cè)腦組織LC3蛋白表達(dá)水平為0.811±0.035,較假手術(shù)組有所增高;而Cys C組LC3表達(dá)1.01±0.378,較模型組和假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)。見附圖:

    附圖 各組大鼠腦組織中LC3蛋白的表達(dá)水平

    3 討論

    缺血性腦血管病在治療過程中容易發(fā)生缺血再灌注損傷,損傷后細(xì)胞程序性死亡會出現(xiàn)細(xì)胞凋亡及自噬等細(xì)胞死亡形式。自噬是通過自身形成的自噬囊泡,吞噬胞漿內(nèi)變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞器,通過微管相關(guān)蛋白,以動力依賴性的方式轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解的過程[6]。它有別于壞死,也不同于凋亡。適度激活自噬可能在受損細(xì)胞中幫助清除受損的細(xì)胞器和異常蛋白、防止蛋白聚集,對細(xì)胞損傷起保護(hù)作用[7]。

    LC3系統(tǒng)主要參與自噬泡的修飾,LC3蛋白的表達(dá)水平是自噬檢測的敏感指標(biāo)[8]。正常情況下LC3-Ⅰ主要存在于胞漿中,在自噬發(fā)生過程中,微管相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合,形成LC3-II,參與自噬體的形成。LC3-II是自噬體的標(biāo)志分子,其含量多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比。因此,通過檢測LC3-II可反映自噬活性[9]。

    Cystatin C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑,具有刺激細(xì)胞生長的功能,與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有非常重要的關(guān)系。Cys C具有抗淀粉樣蛋白生成作用,有研究表明遲發(fā)性阿爾茨海默?。ˋD)與Cys C的基因連鎖相關(guān)。Tizon[11]等[10]研究表明神經(jīng)元在營養(yǎng)匱乏、秋水仙素、氧化應(yīng)激等細(xì)胞毒性環(huán)境中Cystatin C對其具有保護(hù)作用。這種保護(hù)作用不是Cys C抑制組織蛋白酶B實(shí)現(xiàn),而是Cys C通過mTOR途徑誘導(dǎo)功能性自噬實(shí)現(xiàn)的;如果抑制自噬,Cys C的神經(jīng)保護(hù)作用就會被阻止。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),Cystatin C可作為一種新的自噬誘導(dǎo)劑,通過誘導(dǎo)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦皮層的自噬可能對早期腦損傷起到保護(hù)作用[12]。此外,外源性的Cys C能夠保護(hù)神經(jīng)元避免β淀粉樣蛋白(Aβ)毒性誘導(dǎo)的死亡[13]。因此通過調(diào)節(jié)Cys C的表達(dá)有望成為治療中風(fēng)、AD和其它神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:x與假手術(shù)組相比,模型組LC3蛋白表達(dá)增多,Cystatin C干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠后,腦皮質(zhì)中LC3表達(dá)持續(xù)增高,自噬作用增強(qiáng)。但對于Cystatin C在缺血再灌注損傷中是否具有神經(jīng)保護(hù)作用尚不清楚,其在自噬與缺血再灌注損傷中的確切機(jī)制和涉及的調(diào)控因子,還需更多的實(shí)驗(yàn)研究來闡明。

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    (學(xué)生園地欄目編輯:張 健)

    R332

    A

    1004-6879(2016)01-079-02

    2015-10-10)

    * 河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H2015406046)

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