‘荷斯坦奶?！a(chǎn)后期乳汁差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

劉姍姍，陶金忠，趙國(guó)順，趙興緒，楊永新

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3.天水市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 天水 741000；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；5.安徽農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

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‘荷斯坦奶?！a(chǎn)后期乳汁差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

劉姍姍1，陶金忠2，趙國(guó)順3，趙興緒4，楊永新5

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3.天水市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 天水 741000；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；5.安徽農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

【目的】 為了比較‘荷斯坦奶?！a(chǎn)后期乳汁中蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異.【方法】 應(yīng)用雙向電泳(2-DE)技術(shù)構(gòu)建荷斯坦奶牛分娩當(dāng)天，分娩后7 d，分娩后15 d，分娩后28 d和分娩后35 d乳汁二維凝膠電泳圖譜，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，以3倍以上的表達(dá)變化用PDQuest 8.0分析.【結(jié)果】 在這5個(gè)不同的時(shí)期共發(fā)現(xiàn)了8種差異蛋白，經(jīng)MADIL-TOF-TOF串聯(lián)質(zhì)譜法分析發(fā)現(xiàn)這8種蛋白分別是：α-S2酪蛋白前體、β-酪蛋白、κ-酪蛋白前體、免疫球蛋白重鏈前體、白蛋白、血清白蛋白前體、cGMP磷酸二酯酶的α亞基、角蛋白I型細(xì)胞骨架10.【結(jié)論】 根據(jù)這幾種蛋白質(zhì)的已有文獻(xiàn)研究和蛋白含量在不同時(shí)期的變化趨勢(shì)，表明這些蛋白可能與初乳的被動(dòng)免疫、物質(zhì)運(yùn)輸和泌乳有關(guān).

荷斯坦奶牛；產(chǎn)后期；乳汁；蛋白質(zhì)組

奶牛生產(chǎn)后的能量需求會(huì)隨著泌乳的變化而出現(xiàn)相應(yīng)的變化，以適應(yīng)泌乳的需求[1].隨著犢牛的生長(zhǎng)，所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，牛奶中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也會(huì)發(fā)生改變.蛋白質(zhì)是牛奶中最主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).通過(guò)比較犢牛生長(zhǎng)初期，牛奶中蛋白的變化不僅對(duì)于了解母牛的生理變化有幫助，而且還可以幫助我們了解犢牛的營(yíng)養(yǎng)需求.蛋白質(zhì)組學(xué)不僅能夠呈現(xiàn)完整的蛋白質(zhì)圖譜還能夠發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期中差異表達(dá)的蛋白質(zhì).Senda等[2]利用雙向電泳技術(shù)研究了荷斯坦奶牛分娩后10 d內(nèi)乳清蛋白質(zhì)組的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳清蛋白、酪蛋白和免疫球蛋白在產(chǎn)后期乳汁中的含量發(fā)生較大的變化，且大多數(shù)含量較小的乳清蛋白在牛初乳中與新生犢牛的被動(dòng)免疫有關(guān)，其中一些蛋白對(duì)牛犢的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充很重要.Zhang等[3]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)分娩后9 d內(nèi)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的乳樣蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有三分之一的蛋白質(zhì)的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，免疫球蛋白甚至達(dá)到40倍.楊永新等[4]也做了牛初乳和常乳差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了一些差異蛋白，但是目前還沒(méi)有關(guān)于產(chǎn)后期較長(zhǎng)時(shí)間，多時(shí)間點(diǎn)的乳汁蛋白質(zhì)組的研究，因此，本研究擬通過(guò)比較奶牛產(chǎn)后期乳汁蛋白質(zhì)差異變化，以期為奶牛產(chǎn)后生理變化和犢牛的飼養(yǎng)管理的研究奠定一定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

17 cm線性固相化梯度膠條(PH4-7)Bio-Rad公司產(chǎn)品；尿素、四甲基乙二胺(TEMED)、過(guò)硫酸胺(Ap)、碘乙酰胺、考馬斯亮藍(lán) G-250、二硫蘇糖醇(DTT)和溴酚藍(lán)為Sigma公司產(chǎn)品；CHAPS、礦物油、十二烷基硫酸鈉(SDS)和低熔點(diǎn)瓊脂糖為Amresco公司產(chǎn)品；三(羥甲基)氨基甲烷(Tris base)和甘氨酸為NOVON公司產(chǎn)品；30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液(29∶1)和Tris-HCl(pH 8.8)為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；其余藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

PROTEAN IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)、PROTEAN Ⅱ xi凝膠電泳系統(tǒng)、PDQUest 8.0圖像分析軟件系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品，5417R高速低溫離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品，U2800紫外可見分光光度計(jì)為HITACHI公司產(chǎn)品，掃描儀為臺(tái)灣UMAX公司產(chǎn)品.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 在寧夏銀川某奶牛場(chǎng)分別于分娩當(dāng)天，分娩后7 d，分娩后15 d，分娩后28 d，分娩后35 d采集奶牛的乳樣.對(duì)每管樣品編號(hào)分組，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室后-80 ℃保存.

1.2.2 蛋白預(yù)處理 奶牛分娩后不同時(shí)期的乳樣按分娩后天數(shù)不同分為5組，每組分別隨機(jī)抽取4管.同一組的乳樣冰上溶解后每管分別吸取4 mL混合.然后3 000×g，離心15 min，棄去上層脂肪.用乙酸調(diào)pH至4.6沉淀酪蛋白[5]，11 400×g，離心30 min取上清.100 μL每管分裝，按組別標(biāo)記，將分娩當(dāng)天，分娩后7 d，分娩后15 d，分娩后28 d，分娩后35 d的血漿分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，-80 ℃保存.Bradford法定量.

1.2.3 雙向電泳 每組樣品蛋白上樣量為300 μg，與上樣緩沖液混合后，4 ℃ 10 000×g/min，離心10 min，吸上清進(jìn)行等電聚焦，設(shè)置等電聚焦程序：50 V，15 h(主動(dòng)水化)；250 V(線性)，1 h；1 000 V(線性)，1 h；10 000 V(線性)，6 h；10 000 V(線性)，8 h； 500 V(快速)，任意時(shí)間.分別用5 mL的膠條平衡緩沖A液和5 mL的膠條平衡緩沖B液平衡14 min.然后用12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，設(shè)置電泳程序：50 V，30 min；然后調(diào)至200 V，待溴酚藍(lán)至玻璃板底部停止電泳.

1.2.4 染色與圖像分析 凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色后，用去離子水脫色至背景干凈，用掃描儀掃描.用PDQuest 8.0軟件以蛋白表達(dá)譜上的蛋白點(diǎn)表達(dá)量3倍以上的變化為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異分析，檢測(cè)差異蛋白點(diǎn)，并根據(jù)差異蛋白點(diǎn)3次重復(fù)的平均值繪制不同時(shí)期差異蛋白點(diǎn)的變化趨勢(shì).

1.2.5 質(zhì)譜檢測(cè) 切取差異蛋白點(diǎn)，由上海中科新生命生物科技有限公司完成差異蛋白點(diǎn)的測(cè)序.步驟如下：將差異蛋白點(diǎn)脫色和胰酶消化后，用MALDI-TOF/TOF-MS分析，用Mascot軟件搜索NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)protein score CI% >95%和樣品的物種判定差異蛋白種類.

2 結(jié)果與分析

2.1 雙向電泳結(jié)果分析

每組樣品進(jìn)行3次重復(fù)，經(jīng)PDQuest 8.0軟件分析.根據(jù)蛋白點(diǎn)表達(dá)量3倍以上變化標(biāo)準(zhǔn)及蛋白點(diǎn)在3次試驗(yàn)中的重復(fù)性，共篩選出28個(gè)蛋白差異點(diǎn)見圖1.這些蛋白差異點(diǎn)在發(fā)情及配種后不同時(shí)期的測(cè)值變化趨勢(shì)見圖2.

Ⅰ：‘荷斯坦奶牛’分娩當(dāng)天乳汁雙向電泳圖譜；Ⅱ：‘荷斯坦奶?！置浜蟮? d乳汁雙向電泳圖譜；Ⅲ：‘荷斯坦奶?！置浜蟮?5 d乳汁雙向電泳圖譜；Ⅳ：‘荷斯坦奶?！置浜蟮?8 d乳汁雙向電泳圖譜；Ⅴ：‘荷斯坦奶牛’分娩后第35 d乳汁雙向電泳圖譜；蛋白編號(hào)由PDQuest 8.0軟件自動(dòng)生成.圖1 ‘荷斯坦奶?！a(chǎn)后不同時(shí)期乳樣雙向電泳圖譜Fig.1 2-DE gel profile of milk from Holstein cows in different period after delivery

圖2 ‘荷斯坦奶?！置浜蟛煌瑫r(shí)期乳樣差異蛋白點(diǎn)測(cè)值變化趨勢(shì)Fig.2 The variation tendency of the differential proteins from Holstein cows’ milk in different periods after delivery

2.2 質(zhì)譜分析結(jié)果

質(zhì)譜分析結(jié)果見表1.差異點(diǎn)1402,2402,3208,5403,3401,2406未鑒定成功.4510、5505為血清白蛋白前體(serum albumin precursor(Bostaurus))，5502、6505、7501、7503為白蛋白(albumin(Bostaurus))，5406、5410、6403、6404和6406為免疫球蛋白重鏈前體(Ig heavy chain precursor(B/MT.4A.17.H5.A5)-bovine)，2202、2203、2302、2303、3301和3302為α-S2酪蛋白前體(alpha-s2-like casein precursor(Bostaurus))，4403為β-酪蛋白(beta-casein(Bostaurus))，1202為κ-酪蛋白前體(kappa-casein precursor(Bostaurus))，7504為cGMP的磷酸二酯酶α亞基(cGMP phosphodiesterase alpha subunit(PDE)(EC3.1.4.17)(Bostaurus))，1401和6504為角蛋白I型細(xì)胞骨架10 (Keratin,type I cytoskeletal10).

表1 ‘荷斯坦奶牛’分娩后不同時(shí)期乳樣差異蛋白點(diǎn)的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定

α-S2酪蛋白前體只在分娩當(dāng)天乳樣中檢測(cè)到，β-酪蛋白在分娩后7 d和分娩后35 d檢測(cè)到，且在分娩后35 d的表達(dá)量比分娩后7天高，κ-酪蛋白前體在分娩當(dāng)天表達(dá)量最高，之后表達(dá)量快速下降，在分娩后15 d至分娩后35 d表達(dá)量平穩(wěn).免疫球蛋白重鏈前體存在于分娩后分娩后7 d，分娩后15 d，分娩后28 d，分娩后35 d的乳樣中存在，且表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，在分娩后35 d的乳樣中表達(dá)量最低.白蛋白在產(chǎn)后期7 d到28 d的表達(dá)量基本保持不變，但在產(chǎn)后28 d到35 d過(guò)程中慢慢降低，在分娩后35 d的表達(dá)量最低.cGMP磷酸二酯酶的α亞基在分娩后7 d，分娩后15 d，分娩后28 d的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，角蛋白I型細(xì)胞骨架10在分娩當(dāng)天到分娩后28 d表達(dá)量的變化趨勢(shì)平穩(wěn).

3 討論

3.1 α-S2酪蛋白前體、β-酪蛋白、κ-酪蛋白前體

酪蛋白是組成大多數(shù)哺乳動(dòng)物乳汁的主要蛋白成分，主要包括4種蛋白質(zhì)：α-S1-酪蛋白，α-S2-酪蛋白，β-酪蛋白和κ-酪蛋白.在試驗(yàn)過(guò)程中，分娩當(dāng)天乳樣即牛初乳經(jīng)過(guò)3 000×g/min,離心15 min，棄去上層脂肪.用酸度計(jì)調(diào)pH至4.6沉淀酪蛋白，11 400×g/min，離心30 min取上清處理后，仍然為乳白色液體，而其他時(shí)期的乳樣通過(guò)相同方法處理后為淡黃色澄清液體.由此表明初乳中酪蛋白的含量顯著高于其他時(shí)期乳樣中的含量，用此方法不能徹底去除.由于酪蛋白，白蛋白在初乳中含量較高，掩蓋了其他低豐度蛋白，因此本試驗(yàn)中在分娩當(dāng)天的乳樣中主要檢測(cè)到了α-S2酪蛋白前體和κ-酪蛋白前體這兩種差異蛋白.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)α-S2酪蛋白前體只在分娩當(dāng)天乳樣中檢測(cè)到，β-酪蛋白只在分娩后7 d和35 d檢測(cè)到，且在分娩后35 d的表達(dá)量比分娩后7 d高，而Yamada等[6]利用免疫吸附技術(shù)結(jié)合雙向電泳、微測(cè)序和質(zhì)譜對(duì)牛初乳和產(chǎn)后50 d的成熟乳的低豐度蛋白進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在哺乳期β-酪蛋白片段的水平顯著增加.Visker等[7]檢測(cè)牛的新多態(tài)性β-酪蛋白(β-CN)基因，發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白變體I顯著與蛋白比例，蛋白產(chǎn)量，α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白指數(shù)和酪蛋白產(chǎn)量相關(guān).本研究發(fā)現(xiàn)κ-酪蛋白前體在分娩當(dāng)天表達(dá)量最高，之后表達(dá)量快速下降，在分娩后15 d到35 d表達(dá)量平穩(wěn).人乳腺組織中的κ-酪蛋白mRNA的含量在它的功能分化過(guò)程中增加，而催乳素可能調(diào)節(jié)κ-酪蛋白mRNA的產(chǎn)生[8].這3種酪蛋白含量的變化到底是與試驗(yàn)處理的方法有關(guān)，還是機(jī)體自身的機(jī)理使然還有待研究.

3.2 免疫球蛋白重鏈前體

牛初乳具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功能，研究發(fā)現(xiàn)牛初乳中IgG，IgA和IgM的水平較常乳中高[9]，它們具有結(jié)合抗原、活化補(bǔ)體、中和毒素等諸多生理功能，能夠?yàn)樾律鸂倥Ｌ峁┍粍?dòng)免疫保護(hù)，增強(qiáng)新生仔畜抗感染能力和維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育[4].在一些物種(人類，兔子等)中，母體的免疫球蛋白從子宮內(nèi)跨胎盤或卵黃囊膜轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒血液；而在其它物種，包括反芻動(dòng)物，母體的免疫球蛋白則通過(guò)初乳轉(zhuǎn)運(yùn)到新生兒[10].毛永江等[11]對(duì)7頭中國(guó)‘荷斯坦奶?！谌樵缙谌榈鞍捉M分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白的含量在產(chǎn)犢后1 h最高，至第5天時(shí)接近常乳水平.楊永新等[4]研究發(fā)現(xiàn)奶牛初乳中的IgG是常乳的50～100倍，為最主要的免疫球蛋白.Zhang等[3]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)分娩后9 d內(nèi)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的初乳和成熟乳的蛋白質(zhì)組變化進(jìn)行分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)所定量三分之一的蛋白質(zhì)含量在產(chǎn)犢后9 d較第1天相比都有所下降，特別是免疫球蛋白高達(dá)40倍.Zhang等[12]運(yùn)用2-DE結(jié)合LC-MS-MS技術(shù)研究奶牛產(chǎn)后1、3、7、21 d中奶牛乳清蛋白質(zhì)的變化，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)IgG表達(dá)量逐漸下降.

本試驗(yàn)中免疫球蛋白重鏈前體蛋白點(diǎn)在分娩當(dāng)天的乳樣的雙向電泳圖中不存在，但是存在于分娩后分娩后7、15、28、35 d的乳樣中，且總體表現(xiàn)為一種下降的趨勢(shì).這與其他學(xué)者的研究有所差別，這可能是因?yàn)槌跞橹欣业鞍?、免疫球蛋白和白蛋白濃度過(guò)高，聚集阻塞凝膠孔隙，造成免疫球蛋白重鏈前體不能在第二項(xiàng)SDS-PAGE中向下遷移.

3.3 血清白蛋白前體和白蛋白

白蛋白是由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，是血漿中含量最為豐富的蛋白，白蛋白是血漿中的主要的載體物質(zhì)，能與體內(nèi)許多難溶性的小分子有機(jī)物及其他生物活性物質(zhì)可逆地結(jié)合.Zhang[12]等比較1、3、7、21 d中奶牛乳清蛋白質(zhì)的變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)白蛋白含量在產(chǎn)后1-7 d沒(méi)有變化，而在產(chǎn)后7開始下降.

本試驗(yàn)中血清白蛋白前體在分娩后7-28 d表達(dá)量基本保持不變，但在產(chǎn)后28 d到35 d過(guò)程中慢慢降低，在分娩后35 d的表達(dá)量最低.在分娩當(dāng)天并未檢出白蛋白，這可能是由于初乳中高豐度蛋白濃度過(guò)高，特別是酪蛋白濃度較高，不能通過(guò)等電點(diǎn)沉淀法完全去除，所以阻礙了其他蛋白在SDS-PAGE中的遷移，這可能是造成未在分娩當(dāng)天的乳樣中檢測(cè)到白蛋白和血清白蛋白前體的原因.

白蛋白作為一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在奶牛泌乳的初期階段其含量較高可能與犢牛生長(zhǎng)發(fā)育需要較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，白蛋白需要運(yùn)輸這些物質(zhì)進(jìn)入乳中，以發(fā)揮增強(qiáng)免疫和促生長(zhǎng)發(fā)育的功能[13].而為何在產(chǎn)后28-35 d其含量逐漸下降還有待進(jìn)一步研究.

3.4 cGMP的磷酸二酯酶α亞基

環(huán)磷酸腺苷cAMP和環(huán)鳥苷酸cGMP是具有細(xì)胞內(nèi)信息傳遞作用的小分子，被稱為細(xì)胞內(nèi)第二信使，主要作用于信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游元件：蛋白激酶G、cGMP依賴性磷酸二酯酶及cGMP門控離子通道，參與血管舒縮、神經(jīng)信號(hào)傳遞、抑制血小板凝集及細(xì)胞增殖與調(diào)亡等調(diào)節(jié)[13].cAMP和cGMP的細(xì)胞內(nèi)的濃度水平由膜上的腺苷環(huán)化酶的合成和磷酸二酯酶的降解共同調(diào)控.磷酸二酯酶PDEs可將cAMP、cGMP水解為無(wú)活力的5′-AMP和5′-GMP，從而調(diào)控機(jī)體多種生理病理過(guò)程.PDEs由11種各具特性的同工酶家族組成，該家族參與大量的生理學(xué)過(guò)程，包括心肌收縮、神經(jīng)退行性病變、細(xì)胞凋亡、脂肪生成、糖原分解和糖異生作用等.因此，PDE具有成為多種疾病治療靶點(diǎn)的潛力，包括抑郁、哮喘、炎癥與勃起功能障礙等[14].不過(guò)PDEs調(diào)控機(jī)體生理活動(dòng)的具體機(jī)制仍不明確[15].

磷酸二酯酶家族的各亞型因水解能力的不同，PDE4、7、8主要特異性水解cAMP，PDE5、6、9特異性水解cGMP，而PDE1、2、3、10、11則對(duì)cAMP和cGMP均起作用[16].PDE3抑制劑ORG9935可以阻止卵母細(xì)胞中cAMP的降解，防止靈長(zhǎng)類動(dòng)物懷孕.cGMP是PDE3A的生理抑制劑，產(chǎn)生于卵丘細(xì)胞，并通過(guò)間隙連接進(jìn)入卵母細(xì)胞.針對(duì)性的抑制PDE5可以減少抑制卵母細(xì)胞體外成熟所需要的ORG9935的劑量.因此，結(jié)合PDE抑制劑可能有避孕的潛力[17].PDE5存在于大鼠子宮壁，在整個(gè)孕期PDE5蛋白表達(dá)沒(méi)有變化.本試驗(yàn)中cGMP磷酸二酯酶的α亞基在分娩后7、15、28 d的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在分娩后當(dāng)天和35 d都沒(méi)有檢測(cè)到cGMP磷酸二酯酶.目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有研究關(guān)于cGMP磷酸二酯酶與犢牛生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的報(bào)道，其還有待進(jìn)一步研究.

3.5 角蛋白I型細(xì)胞骨架10

角蛋白是皮膚、毛發(fā)和指甲等組織的重要組成成分，而Han等[18]對(duì)妊娠30～50 d的奶牛和非妊娠奶牛的乳汁進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)上皮角蛋白10為妊娠特異性蛋白.目前還沒(méi)有更多關(guān)于角蛋白10和生殖的研究.不過(guò)，Bartek等[19]研究發(fā)現(xiàn)在成年人的乳腺大部分的腔上皮細(xì)胞表達(dá)角蛋白19(K19 +)，而乳腺上皮細(xì)胞的功能與數(shù)量很大程度的決定了泌乳奶牛的生產(chǎn)性能[20]，而角蛋白19缺失的細(xì)胞(K19-)似乎具有高增殖潛能，具有比K19 +細(xì)胞低的分泌活性，K19-管腔細(xì)胞少分化，并且可能是K19+管腔細(xì)胞的前體.K19 +管腔細(xì)胞代表完全分化的表型，能響應(yīng)激素的刺激產(chǎn)生牛奶[19].

本試驗(yàn)中角蛋白I型細(xì)胞骨架10在分娩當(dāng)天到分娩后28 d表達(dá)量的變化趨勢(shì)平穩(wěn)，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)角蛋白角蛋白I型細(xì)胞骨架10的功能的研究報(bào)道較少，根據(jù)對(duì)角蛋白19的研究，推測(cè)其可能與激素刺激產(chǎn)生牛奶有關(guān)，不過(guò)還有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)在荷斯坦奶牛分娩當(dāng)天，分娩后7、15、28、35 d的乳汁中共發(fā)現(xiàn)28個(gè)差異蛋白點(diǎn)，檢測(cè)出8種蛋白.分別是：α-S2酪蛋白前體、β-酪蛋白、κ-酪蛋白前體、免疫球蛋白重鏈前體、血清白蛋白前體、白蛋白、cGMP磷酸二酯酶的α亞基和角蛋白I型細(xì)胞骨架10.角蛋白I型細(xì)胞骨架10可能與牛奶分泌有關(guān)，其他蛋白的發(fā)現(xiàn)對(duì)于產(chǎn)后母牛的生理變化和犢牛的生長(zhǎng)管理提供一定的理論基礎(chǔ).

[1] 黃云飛,侯小露,杜玉蘭，等.奶牛產(chǎn)后部分血液指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及相關(guān)分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,45(6):1094-1097

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(責(zé)任編輯 李辛)

Differential proteomic analysis of milk in the postpartum period of Holstein cows

LIU Shan-shan1,TAO Jin-zhong2,ZHAO Guo-shun3,ZHAO Xing-xu4,YANG Yong-xin5

(1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China；2.College of Agonomy, Ningxia University,Yinchuan 750021,China；3.Tianshui Centre for Animal Disease Control and Prevention,Tianshui 741000,China；4.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China； 5.Institute of Animal Science,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031,China)

【Objective】 To compare the difference in proteome expression of milk among Holstein cows in the postpartum period.【Method】 The map of 0,7,15,28,35 days after delivery were performed using two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) method.Differential protein spots were detected by PDQuest 8.0 software after staining with commassie blue.【Result】 These spots were identified by MALDI-TOF/TOF-MS and eight differential proteins were found,which were alpha-s2-like casein precursor,beta-casein,kappa-casein precursor,immunoglobulin heavy chain precursor (B/MT.4A.17.H5.A5)-bovine,albumin,serum albumin precursor,cGMP phosphodiesterase alpha subunit and keratin I cytoskeletal 10.【Conclusion】 According to reference research on the proteins and the changing trend of protein content in different period,these proteins may be related to the passive immunization of colostrums,material transport and lactation.

Holstein cows；postpartum；milk；proteome

劉姍姍(1989-)，女，碩士研究生，主要從事發(fā)育生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.E-mail：liushanshan0214@163.com

陶金忠，男，博士，副教授，主要從事動(dòng)物生殖生理、動(dòng)物繁殖障礙研究和蛋白組學(xué)研究.E-mail：tao_jz@nxu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160523).

2015-06-29；

2016-04-18

S 823.9+1

A

1003-4315(2016)05-0007-07